一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法
阅读说明：本技术 一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法 (Anti-gout drug screening method based on modified fiber enrichment ) 是由 陶益 陈林 江恩赐 朱菲 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法,在聚偏二氟乙烯纤维表面依次覆盖功能化聚多巴胺、聚乙烯亚胺和黄嘌呤氧化酶得到靶标键合纤维,然后将靶标键合纤维和待筛选的药用植物提取物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗,再用变性清洗液进行变性洗脱,然后对变性洗脱物进行液质分析,获取靶标结合物的相关质谱信息,同时采用表面等离子共振技术分析靶标-小分子的相互作用,获取KD值,筛选出抗痛风成分。本发明提供的筛选方法能够用于药用植物中抗痛风成分的筛选,与传统植物化学分离筛选方法相比,可显著提高筛选效率、缩短筛选时间,可重复使用,具有快速、高效、准确、重现性好等优点。(The invention discloses a method for screening anti-gout drugs based on modified fiber enrichment, which comprises the steps of sequentially covering the surface of polyvinylidene fluoride fiber with functionalized polydopamine, polyethyleneimine and xanthine oxidase to obtain target bonding fiber, and then mixing and incubating the target bonding fiber and a medicinal plant extract to be screened; and after incubation, washing with PBS buffer solution, performing denaturing elution with a denaturing washing solution, performing liquid mass analysis on the denatured eluate to obtain related mass spectrum information of the target conjugate, analyzing the interaction of the target and the small molecule by adopting a surface plasmon resonance technology to obtain a KD value, and screening out the anti-gout component. The screening method provided by the invention can be used for screening anti-gout components in medicinal plants, can obviously improve the screening efficiency and shorten the screening time compared with the traditional plant chemical separation screening method, can be repeatedly used, and has the advantages of rapidness, high efficiency, accuracy, good reproducibility and the like.)
技术领域
本发明涉及一种从药用植物提取物中筛选抗痛风活性成分的方法，具体涉及一种筛选效率高、环保、能同步进行活性成分富集和鉴定的亲和固相微萃取方法，对于抗痛风活性成分的快速筛选具有重要意义。
背景技术
传统的药用植物活性成分筛选模式主要是包括两步：一是通过提取、萃取、柱层析、纯化等手段分离单体化合物，二是对单体化合物进行活性测试。整个筛选过程存在繁琐、耗时、消耗大量有机溶剂、对环境不友好等缺点。固相微萃取技术是一种新兴的样品预处理富集技术，常与气相色谱-质谱联用来检测挥发性成分，分析水、土壤、大气等化学环境中多环芳烃、微囊藻毒素等有害化学物质和环境污染物。亲和固相微萃取技术通过在改性纤维表面固定靶标，制备成靶标萃取纤维，在与配体结合后，取出纤维，与非特异性结合的成分分离，然后用洗脱剂把结合配体洗脱下来。目前，已经开发了很多纤维表面修饰技术来固定靶标。例如，聚多巴胺通过自发的氧化自聚合作用表现出对许多材料的强粘合性能，可以通过迈克尔加成或形成席夫碱与各种生物分子例如蛋白质和酶等进行连接，可用于固定化反应，因此，聚多巴胺被广泛用于仿生表面改性。
聚乙烯亚胺是一种阳离子聚合物，它包含胺基和两个碳脂肪族CH2CH2间隔基，带负电的靶标很容易与涂有带正电的聚乙烯亚胺的纤维结合。与传统方法相比，亲和固相微萃取技术具有快速、高效、有机试剂消耗少、环保等优势。黄嘌呤氧化酶是抗痛风药物的主要靶标，应用亲和固相微萃取-超高效液相-质谱联用技术进行黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选的方法尚无人报道。而基于改性纤维的活性成分富集技术具有操作时间短、消耗有机试剂少、富集效率高等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法，通过液质-联用鉴定靶标结合物，用表面等离子体共振技术研究靶标和小分子互作，本发明提供的方法，筛选效率高，准确度高，对于药用植物中抗痛风成分的筛选具有重要应用价值。
为实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法，包括以下步骤：在聚偏二氟乙烯纤维表面依次覆盖功能化聚多巴胺、聚乙烯亚胺和黄嘌呤氧化酶得到靶标键合纤维，然后将靶标键合纤维和待筛选的药用植物提取物混合、孵育；孵育结束后先用PBS缓冲液清洗，再用变性清洗液进行变性洗脱，然后对变性洗脱物进行液质分析，获取靶标结合物的相关质谱信息，同时采用表面等离子共振技术分析靶标-小分子的相互作用，获取KD值，筛选出抗痛风成分。
作为优选方案，变性清洗液为乙腈水溶液或甲醇水溶液。
作为优选方案，孵育结束后先用PBS缓冲液清洗3次，变性清洗液为体积浓度70％的甲醇水溶液。
作为优选方案，将靶标键合纤维和待筛选的药用植物提取物在35℃下孵育20min。
作为优选方案，将靶标键合纤维和待筛选的药用植物提取物混合，加入PBS缓冲液，使孵育溶液的pH在6.7-6.9。
作为优选方案，将靶标键合纤维和待筛选的药物，混合，加入PBS缓冲液，使孵育溶液的离子强度为333-337mM。
以上所述的一种基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法，包括以下步骤：
(1)取一束聚偏二氟乙烯纤维，使用等体积的10mM Tris-盐酸盐缓冲液(pH 8.5)溶液超声半小时，得到活化纤维，备用；
(2)取步骤(1)得到的活化纤维，加入80mg多巴胺，将溶液搅拌过夜，得到聚多巴胺覆盖纤维。用超纯水洗涤聚多巴胺覆盖纤维3次，再浸入12mL聚乙烯亚胺(20mg/mL)中。将溶液搅拌2小时，得聚乙烯亚胺覆盖纤维；将聚乙烯亚胺覆盖纤维浸入12mL黄嘌呤氧化酶溶液(1mg/mL)，溶液搅拌3小时，得到黄嘌呤氧化酶覆盖纤维；
(3)称取车前草药材，加入蒸馏水回流提取，得到车前草提取液，过滤，取滤液，离心，取上清液，得车前草粗提物，备用；
(4)取车前草提取液，加入步骤(3)制备得到的黄嘌呤氧化酶覆盖纤维，加入PBS缓冲液，放在振荡器上混匀，使溶液的离子强度为333-337mM，pH值为6.7-6.9，在35℃下孵育20min，然后取出孵育完成的纤维，先用PBS缓冲液清洗3次，再用70％甲醇的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析，活性小分子再进行表面等离子共振验证。
以上所述的一种基于纤维富集的药用植物抗痛风药物筛选方法，液质分析的液质参数为ESI负离子模式。
本文中出现过的一些缩写形式，其含义如下：PBS:磷酸缓冲盐；KD值：解离常数；ESI：电喷雾离子；Tris:三羟甲基氨基甲烷。
有益效果：本发明提供的基于改性纤维富集的药用植物抗痛风药物筛选方法具有以下优点：
本发明提供的基于改性纤维富集的药用植物抗痛风药物筛选方法工艺设计合理，通过大量实验筛选出最佳的孵育温度、孵育时间、孵育溶液pH、离子强度及变性清洗液比例。
本发明主要应用于筛选药用植物中抗痛风活性成分，设计合理，提供的筛选和评价系统效率高、结构完善，能够用于药用植物中抗痛风成分的鉴定，而且设备简单经济，适合于探索更多靶标在多种药用植物中的鉴定表现。与传统植物化学方法相比，本方法显著提高了筛选效率，缩短了筛选时间，并且能够循环使用，绿色环保。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下实施例所用试剂：
黄嘌呤氧化酶(bovine milk，EC:1.1.3.22)、抗黄嘌呤氧化酶抗体(Bioss生物技术有限公司)、羊抗兔抗体(荣柏生物科技有限公司)、别嘌呤醇(阿拉丁生物技术有限公司)，七种标准品：连翘苷C、异大车前苷、大车前苷、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷、异类叶升麻苷、毛蕊花糖苷、野黄芩苷、黄芩苷A、高车前素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(维克奇生物科技有限公司)、香草酸(源叶生物科技有限公司)。聚偏氟乙烯纤维(H-过滤膜技术工程公司)、盐酸多巴胺(sigma)、聚乙烯亚胺(sigma)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，sigma)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，sigma)、乙醇胺盐酸盐(ETA，sigma)
实施例所用仪器：扫描电子显微镜(SEM，日立S4800)、衰减全反射红外光谱(ATR-IR,Bruker光学)、荧光显微镜检测(Carl Zeiss,Thornwood,NY)、AB Sciex 5600Q-TOF高分辨质谱仪(AB Sciex公司)、UHPLC系统(Shimadzu)、X射线光电子能谱(XPS)、BIAcore T200系统(GE医疗)。
实施例1聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺纤维的制备和表征
取一束纤维，使用12mL的10mM Tris-盐酸盐缓冲液(pH 8.5)溶液超声半小时，得到活化纤维，备用。取活化纤维，加入80mg多巴胺，将溶液搅拌过夜，得到聚多巴胺覆盖纤维。用超纯水洗涤聚多巴胺覆盖纤维3次，再浸入12mL聚乙烯亚胺(20mg/mL)中。将溶液搅拌2小时，得聚乙烯亚胺覆盖纤维；将聚乙烯亚胺覆盖纤维浸入12mL黄嘌呤氧化酶溶液(1mg/mL)，溶液搅拌3小时，得到黄嘌呤氧化酶覆盖纤维。
分别取50、100、200根活化纤维，加入多巴胺缓冲液，轻轻搅拌一段时间，在不同时间点取样20μL，采用Bradford法测定溶液中蛋白质含量。纤维表面键合蛋白的定量结果：通过纤维的数量不同，来确定黄嘌呤氧化酶结合疗效与黄嘌呤氧化酶恒定量的最优比例。结果表明：恒定50根纤维时，孵育3h每根有最大固定化蛋白量。
使用扫描电子显微镜、红外、X光谱衍射、荧光显微镜对空白聚偏二氟乙烯纤维和聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维进行性状表征。将空白聚偏二氟乙烯纤维和聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维分别与抗黄嘌呤氧化酶抗体孵育24h。然后PBS缓冲液洗涤3次。然后加入二抗与空白聚偏二氟乙烯纤维和聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维孵育2小时。随后用T-PBS洗涤纤维3次，用荧光显微镜拍照。聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维的光学显微镜和免疫荧光图分析表明：改性聚偏二氟乙烯纤维表面已经均匀覆盖黄嘌呤氧化酶。
红外光谱显示：1637cm-1，3389cm-1与聚多巴胺处理后表面吲哚基团的C＝C，N-H匹配；1184cm-1，1068cm-1，1642cm-1与涂覆聚乙烯亚胺后非芳香族C-N振动和N-H振动相符合；1624cm-1，1415cm-1，1333cm-1处的吸收带与黄嘌呤氧化酶的特征吸收带一致，表明在键合纤维表面覆盖有黄嘌呤氧化酶。
以上结果说明本发明制备得到的聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维符合要求。
实施例2基于改性纤维富集的抗痛风药物筛选方法的影响因素考察
(1)以异类叶升麻苷为模型药物，对变性洗脱溶剂进行优化
取以上实施例1制备得到的10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，加入异类叶升麻苷对照品溶液1.0mL(1.0mg/mL)和12mL PBS缓冲液(pH6.7-6.9)混合，在35℃下孵育20min，孵育完成后，用12mL PBS缓冲液清洗3次，洗脱液进液相分析，最后，分别以2mL体积浓度10％、30％、50％、70％、90％和100％乙腈-水溶液(v/v)及体积浓度10％、30％、50％、70％90％和100％甲醇-水溶液(v/v)进行变性洗脱，分别取变性洗脱液进行液相分析。
(2)以异类叶升麻苷为模型药物，对孵育时间进行优化
取以上实施例1制备得到的10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，加入异类叶升麻苷对照品溶液1.0mL(1.0mg/mL)和12mLPBS缓冲液(pH6.7-6.9)混合，35℃下孵育，在5、10、20、30、45min后孵育，孵育完成后，用12mL PBS缓冲液清洗3次，转移聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维到2mL的试管中，再用70％甲醇-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(3)以异类叶升麻苷为模型药物，对孵育温度进行优化
取以上实施例1制备得到的10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，加入异类叶升麻苷对照品溶液1.0mL(1.0mg/mL)和12mLPBS缓冲液(pH6.7-6.9)混合，在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下孵育20min，孵育完成后，用12mL PBS缓冲液清洗3次，转移聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维到2mL的试管中，再用70％甲醇-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(4)以异类叶升麻苷为模型药物，对孵育pH值进行优化
取以上实施例1制备得到的10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，加入异类叶升麻苷对照品溶液1.0mL(1.0mg/mL)和12mLPBS缓冲液(pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5，8.0)混合，在35℃下孵育20min，孵育完成后，用12mL PBS缓冲液清洗3次，转移聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维到2mL的试管中，再用70％甲醇-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(5)以异类叶升麻苷为模型药物，对孵育离子强度进行优化
取以上实施例1制备得到的10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，加入异叶类升麻苷对照品溶液1.0mL(1.0mg/mL)和12mLPBS pH6.7-6.9的缓冲液(离子强度分别为50mM、160mM、270mM、380mM、490mM、600mM)混合，在35℃下孵育20min，孵育完成后，用12mL PBS缓冲液清洗3次，转移聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维到2mL的试管中，再用70％甲醇-水溶液(v/v)进行变性清洗，取变性洗脱液进行液相分析。
(6)各因素筛选结果
清洗的目的在于排除非特异性结合的化合物产生的干扰，本发明通过大量实验对不同的清洗次数进行考察，结果表明，先用PBS缓冲液清洗三次可以足够消除非特异性结合的化合物。变性洗脱液可以将特异性结合在纤维上的凝血酶清洗下来，结果表明，70％甲醇-水洗脱溶剂(v/v)的洗脱效率优于其它洗脱溶剂。
因为小分子与黄嘌呤氧化酶的非共价作用主要是静电相互作用，离子强度和pH是重要影响因素。实验结果表明：溶液pH值在6.7-6.9左右最适宜，PBS缓冲液的离子强度为333-337mM最佳。孵育时间的长短与温度的高低也是影响亲和程度的重要因素，结果表明，在35℃下孵育20min异叶类升麻苷与黄嘌呤氧化酶的亲和程度最高。
实施例3筛选系统应用于车前草中抗痛风成分的筛选
(1)称取1g车前草粉末，加入50mL蒸馏水，回流1h，过滤，滤液13400rpm离心10min，吸取上清液备用。取车前草提取物上清液1.0mL，插入10根聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维，补足35℃ PBS缓冲液(pH 6.7-6.9,333-337mM)中至12mL，放在振荡器上混匀，孵育20min。然后将聚偏二氟乙烯@聚多巴胺@聚乙烯亚胺@黄嘌呤氧化酶纤维拉出并用12mL孵育缓冲液洗涤清洗3次，再用70％甲醇的水溶液变性洗脱，变性洗脱液进行液质分析
色谱条件设置如下：Syncronis AQ-C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，样品进样量1μL；柱温箱温度35℃；流速0.4mL/min；流动相，含0.1％甲酸的水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)。梯度如下：5％B(0–2min)，5–30％B(2.0–8.0min)，30–95％B(8.0–13.0min)，95–100％B(13.0–17.0min)。
飞行时间质谱如下：离子喷雾电压，-4.5kV；碰撞能量：-35eV；雾化器气体(气体1)，55psi；去簇电压，-60V；加热气体(气体2)，55psi；离子源温度：550℃；帘气压：35psi。进行全扫描数据采集，在负离子模式下扫描m/z 100到1500。
(2)通过液质联用技术获得车前草中9个活性化合物的化学信息，并采用ELISA法测定9个化合物的IC50值，采用表面等离子共振获得化合物与黄嘌呤氧化酶的亲和力数值(pD2)，具体结果如表1所示。其中7个化合物，即黄芩苷A、野黄芩苷、大车前苷、异大车前苷、高车前素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-7-O-二葡萄糖醛酸苷、连翘苷C的黄嘌呤氧化酶抑制活性为首次发现。
表1单体化合物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用
本发明提供的基于改性纤维分离的抗痛风药物筛选方法，结果准确可信。与传统的天然药物活性成分筛选方法相比，本发明的优点是筛选效率更高、有机溶剂消耗少、可以循环使用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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