一种喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用
阅读说明：本技术 一种喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用 (Application of quinoline derivative in preparation of medicine for treating sepsis ) 是由 吕奔 唐怡庭 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用,所述喹啉衍生物的结构如下所示：该喹啉衍生物对脓毒症和内毒素血症具有一定的治疗作用,能够有效提高脓毒症和内毒素血症小鼠的生存率,为临床治疗脓毒症提供了新的治疗方法和药物。(The invention discloses an application of a quinoline derivative in preparing a medicament for treating sepsis, wherein the quinoline derivative has the following structure: the quinoline derivative has a certain treatment effect on sepsis and endotoxemia, can effectively improve the survival rate of mice with sepsis and endotoxemia, and provides a new treatment method and a new medicine for clinically treating sepsis.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用。
背景技术
脓毒症(又称为败血症，拉丁语：Sepsis)是感染诱发的以多脏器衰竭为特征的危急重症，具有起病急和病情重的特点，死亡率高达40％。其常见的临床症状包括发烧、呼吸频率和心跳加速，以及意识不清，严重的脓毒症会导致供应组织的血流不足甚至引起器官衰竭以及感染性休克，严重威胁患者的生命安全。目前，早期液体复苏、早期使用抗生素及器官功能支持等治疗在一定程度上降低了脓毒症的死亡率，但脓毒症仍然是重症病监护室(ICU)患者死亡的首要原因。
脓毒症的发病机制十分复杂，病原微生物侵入机体后其主要致病因子脂多糖(LPS)在内毒素结合蛋白(LPS binding protein，LBP)及CD14分子的协助下，与膜结合蛋白MD-2及TLR-4特异性结合，从而介导促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等的大量产生和释放。在脓毒症病变过程中，机体始终处于免疫紊乱状态。早期因严重感染、创伤、烧伤等打击，机体处于免疫激活状态，表现为大量促炎因子释放；随着病情发展，机体可能经历一个免疫抑制阶段，淋巴细胞大量凋亡，出现代偿性抗炎反应综合症，进一步发展则出现脏器功能障碍。
异喹啉类化合物具有异喹啉母核结构，异喹啉类化合物具有多种药理活性。异喹啉及衍生物具有多种生物活性，在医药、化工、染料等领域都有广泛的应用。
目前治疗脓毒症的药物主要以糖皮质激素等非特异性治疗以防治器官功能衰竭和休克等对症治疗为主。虽然控制感染的治疗方法能缓解脓毒症症状，延长患者生命，但治标不治本。因此，开发新的脓毒症治疗的药物以应用于临床治疗具有重要的意义。目前也没有关于喹啉衍生物应用于脓毒症治疗的报道。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，所述药物对脓毒症有良好治疗作用。
本发明还提出上述喹啉衍生物的在制备脓毒症相关药理途径中抑制剂的应用。
根据本发明的第一方面实施例的喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，所述喹啉衍生物的结构式如下所示：
根据本发明实施例的喹啉衍生物在制备治疗脓毒症药物中的应用，至少具有如下有益效果：所述喹啉衍生物用于制备治疗脓毒症药物，能够提高脓毒症或内毒素血症感染后人体或动物的生存率。
在本发明中，脓毒症还包括脓毒症相关疾病，如内毒素血症、严重脓毒症和脓毒性休克等。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够提高感染脓毒症动物生存率的药物。根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内细胞焦亡的药物。
细胞焦亡(Pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应，在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡的特征为依赖于炎性半胱天冬酶(主要是Caspase-1，4，5，11)，并伴有大量促炎细胞因子的释放。
进一步地，抑制细胞焦亡为抑制Caspase11依赖的细胞焦亡。
进一步地，抑制细胞焦亡为抑制LPS和HMGB活化Caspase11诱导的细胞焦亡。
进一步地，所述细胞为巨噬细胞。
根据本发明的一些实施方式，所述治疗脓毒症药物为能够抑制感染脓毒症动物体内促炎细胞因子分泌的药物。
进一步地，所述促炎细胞因子包括IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6中的至少一种。
根据本发明的一些实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。
根据本发明的一些实施方式，所述药物根据需要被制成任何一种药学上可接受的制剂，例如制备成口服给药制剂：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、口服剂等；制备成直肠给药制剂：栓剂、灌肠剂；制备成注射给药制剂：肌肉注射制剂、静脉注射制剂等。
根据本发明第二方面实施例喹啉衍生物的在制备脓毒症相关药理途径中抑制剂的应用，用，所述喹啉衍生物的结构式如下所示：
还提出了所述喹啉衍生物在制备细胞焦亡抑制剂中的应用；或
所述喹啉衍生物在制备促炎细胞因子抑制剂中的应用。
根据本发明的一些实施例，所述促炎细胞因子包括IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6中的至少一种。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物的LDH检测实验结果；
图2为本发明实施例1中化合物的细胞因子的ELISA检测实验结果，其中(a)为IL-1α的含量测试图，(b)为IL-1β的含量测试图；(c)为TNF-α的含量测试图，(d)为IL-6的含量测试图；
图3为本发明实施例2中化合物影响内毒血症小鼠生存率的统计结果图；
图4为本发明实施例3中化合物影响脓毒症小鼠生存率的统计结果图。
图中，将本发明的喹啉衍生物标记为“396”，n代表小鼠数目。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
若无特殊说明，以下实施例中的实验试剂和材料均为商业购得。以下实施例中使用的化合物为喹啉衍生物，购买自selleck公司，结构式为：
实施例1：化合物抑制LH(LPS+HMGB1)活化Caspase11诱导的原代巨噬细胞焦亡
高迁移率族蛋白B1((high-mobility group box 1protein，HMGB1)是一类在哺乳动物中高度保守且广泛表达的蛋白质，正常情况下主要存在于细胞核内，感染等应激状态下作为炎症介质被释放至细胞外，在疾病或组织损伤中起重要的致病作用(Regulation ofpost-translational modifications of HMGB1 during immune responses.AntioxidRedox Signal.2016Apr 20；24(12):620-34.)。发明人发现：在脓毒症中肝细胞释放的HMGB1能将循环中的LPS转运至血管内皮细胞和巨噬细胞的胞浆内，并启动Caspase-11介导的细胞焦亡(The Endotoxin Delivery Protein HMGB1 Mediates Caspase-11-DependentLethality in Sepsis.Immunity.2018 Oct 16；49(4):740-753.)。在上述过程中，肝脏细胞通过其自身表达的TLR4受体识别循环中的LPS，释放大量HMGB1入血；这些被释放的HMGB1又结合血循环中的LPS，HMGB1-LPS复合体通过RAGE受体介导的内吞作用，进入血管内皮细胞或巨噬细胞的溶酶体中；在溶酶体的酸性环境下，HMGB1能直接作用于溶酶体膜导致溶酶体的破裂，使得溶酶体中的LPS泄漏至细胞浆，最终活化Caspase-11并启动细胞焦亡。上述发现不仅揭示了脓毒症致病的新机制，而且提示HMGB1-Caspase-11途径可能是脓毒症中潜在的药物干预靶点，因此，发明人构建了LPS+HMGB1活化Caspase11诱导的原代巨噬细胞焦亡的体外筛选平台，本发明中通过研究化合物对HMGB1-Caspase11途径细胞焦亡的抑制，证明化合物对于脓毒症的抑制活性。
1、实验步骤：提取野生型(WT)小鼠和Casp11 KO小鼠原代腹腔巨噬细胞，RPMI-1640完全培养基重悬细胞调整浓度至1×10^6个/ml，500μl/well种24孔板，贴壁过夜后DPBS洗涤细胞2次，换成1640无血清培养基。使用实施例1的化合物分别以5μM、10μM终浓度加入细胞预孵育1h，再加入脂多糖(LPS)1μg/ml+高迁移率族蛋白(HMGB1)400ng/ml混合物(提前室温预孵育20min)刺激细胞过夜，16-18h收上清做乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验和ELISA实验对促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6含量检测。
具体实验操作如下：
1)提取小鼠原代腹腔巨噬细胞：腹腔注射3％巯基乙酸盐培养基(3ml/只)，3-4天后，小鼠腹腔注射10ml RPMI1640培养基，轻揉小鼠腹部后用注射器回抽腹腔灌洗液，重复1次，收集于离心管中，800rpm离心5分钟弃上清。以5～10ml RPMI1640完全培养基重悬细胞，显微镜下细胞计数后调整细胞浓度至1×10^6个/ml，100μl/well种96孔板，贴壁过夜。
2)加药刺激：使用DPBS洗涤细胞2次以去除未贴壁悬浮细胞，换成1640无血清培养基，化合物10μM/孔终浓度预处理1h后，再加入LPS 1μg/ml+HMGB1 400ng/ml(室温预孵育20min)刺激细胞过夜(包括对照组：Crtl-不加LPS和HMGB；L-只加LPS 1μg/ml；H-只加HMGB1400ng/ml)；
3)收细胞上清检测乳酸脱氢酶(LDH)、细胞因子IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6含量。
a.细胞毒性实验(乳酸脱氢酶LDH检测)：
实验步骤：向对照组中加入100μl LDH释放试剂，再加入RPMI-1640培基补齐至原体积混匀，室温孵育1h。将上清收集到1.5ml EP管，置于4度离心机中，以500rpm离心5min，然后将上清转移到新的EP管中。再配置LDH检测工作液即：乳酸溶液，碘硝基氯化四氮唑(INT)溶液(1X)，酶溶液按1:1:1混合。取96孔板，首先向各孔加入80μl RPMI-1640培基，再加入各待测样品60μl，然后向各孔分别加入60μl LDH检测工作液。混匀，室温(约25℃)避光孵育30min。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。
数据处理：按下述公式进行计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)：
细胞毒性或死亡率(％)＝(处理样品吸光度﹣样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度﹣样品对照孔吸光度)×100。
b.ELISA检测(细胞因子检测)：通过ELISA检测试剂盒分别检测上清样品中IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达。分别用IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6包被抗体包被酶标板，4度过夜。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。1×Assay buffer室温封闭1h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次，加入相应的待测样本及细胞因子标准品，摇床上室温孵育2h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。加入相应的检测抗体室温摇床孵育1h。0.05％PBST清洗3遍，1min/次。最后加入HRP摇床室温孵育30min。0.05％PBST清洗5次后TMB显色，2M硫酸终止显色。450nm处测定吸光度。
2、实验结果：本实施例的细胞毒性实验的实验结果如图1所示(图中，L为只加LPS，H为只加HMGB1，LH为加LPS和HMGB1，LH+5μM为加5μM化合物的实验组，LH+10μM为加10μM化合物的实验组)，从图1可以看出，与对照组或单独LPS及单独HMGB1组相比，实验组(LH组)细胞上清中的LDH含量显著升高，并依赖于caspase11蛋白；但细胞毒性(LDH检测)随化合物的加入大幅降低，当化合物的浓度为5μM时即有很好的作用效果，说明化合物的加入能使得降低细胞死亡率，抑制Caspase11诱导的巨噬细胞焦亡。本实施例的ELISA检测由图2所示，图2中的(a)为IL-1α的含量测试图，(b)为IL-1β的含量测试图，(c)为TNF-α的含量测试图，(d)为IL-6的含量测试图，从图中看出，当化合物加入后，促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量均有降低，说明化合物抑制了促炎细胞因子的分泌。
实施例2：化合物对内毒素血症小鼠的保护作用
1、实验步骤：选取体重25～30g小鼠，分为LPS组、LPS+化合物396组及DMSO完全对照组。化合物溶于DMSO，母液浓度为40mg/ml。化合物396以4mg/kg剂量，100μl/只，提前1h腹腔注射后再注射LPS 10mg/kg，100μl/只；LPS组为DMSO 100μl/只提前1h腹腔注射后再注射LPS 10mg/kg，100μl/只；DMSO完全对照组为DMSO 100μl/只腹腔注射。观察各组小鼠5天内生存率。
2、实验结果：本实施例的实验结果如图3所示，从图3可以看出，使用化合物后，提高了内毒素血症小鼠的生存率，证明了该化合物对内毒素血症具有一定的治疗作用。
实施例3：化合物对脓毒症小鼠的保护作用
盲肠结扎穿孔(Cecal ligation and puncture，CLP)模型实验：
1、实验步骤：选取体重25～30g小鼠麻醉后，做下腹部切口找到盲肠，在盲肠远端至回盲部的50％处结扎(CLP中度模型)，以无菌针头对穿结扎盲肠，并从每个孔中挤出适量肠内容物，随后将拉出的盲肠轻柔放回腹腔后关腹。术后小鼠两侧背部皮下注射37℃预热生理盐水(1ml/只)，并予以复温至苏醒。化合物以4mg/kg术后1h腹腔注射，即为CLP+化合物组，CLP组为术后注射同等体积DMSO。观察各组小鼠5天生存率。
2、实验结果：本实施例的实验结果如图4所示，从图4可以看出，使用化合物后，提高了脓毒症小鼠的生存率，证明了该化合物对脓毒症具有一定的治疗作用。
综上所述，本发明提供的喹啉衍生物对脓毒症和内毒素血症具有一定的治疗作用，能够有效提高脓毒症和内毒素血症小鼠的生存率；同时，通过上述实验可以得知，喹啉衍生物治疗脓毒症的药理作用途径为抑制Caspase11诱导的巨噬细胞焦亡，抑制促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌。为临床治疗脓毒症提供了新的治疗方法和治疗药物。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。