Itm-2c6在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用
阅读说明：本技术 Itm-2c6在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用 (Application of ITM-2C6 in preparation of drugs for preventing and/or treating tumors ) 是由 夏培雪 高凯瑜 刘颖 于 2020-12-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了化合物ITM-2C6的新用途。该新用途包括：1)抑制KLHL22与DEPDC5的相互作用；2)制备抑制KLHL22与DEPDC5相互作用的产品；3)抑制真核生物肿瘤细胞增殖；4)制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；5)预防和/或治疗肿瘤；6)制备预防和/或治疗肿瘤的产品。利用KLHL22-DEPDC5相互作用模型对ITM-2C6进行筛选,加入ITM-2C6的细胞中,KLHL22-DEP相互作用强度要明显低于对照组强度。通过三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231对ITM-2C6抗癌效果进行验证,结果表明,加入药物组的细胞数量远低于对照组,说明该化合物具有抑制三阴性乳腺癌细胞生长的作用。(The invention discloses a new application of a compound ITM-2C 6. The new application comprises the following steps: 1) inhibits the interaction of KLHL22 with DEPDC 5; 2) preparing a product that inhibits the interaction of KLHL22 with DEPDC 5; 3) inhibiting proliferation of eukaryotic tumor cells; 4) preparing a eukaryotic tumor cell proliferation inhibitor; 5) preventing and/or treating tumors; 6) preparing a product for preventing and/or treating tumors. The ITM-2C6 is screened by using a KLHL22-DEPDC5 interaction model, and the KLHL22-DEP interaction strength is obviously lower than that of a control group when the ITM-2C6 cells are added. The anti-cancer effect of ITM-2C6 is verified by triple negative breast cancer cells MDA-MB-231, and the result shows that the number of cells added into a drug group is far lower than that of a control group, which indicates that the compound has the effect of inhibiting the growth of triple negative breast cancer cells.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及ITM-2C6在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
KLHL22是一个重要的E3泛素化连接酶，其底物包括PLK1，DEPDC5和PD-1等，在细胞生长，增殖以及癌症形成方面具有重要调控作用。在此前的报道中，KLHL22通过泛素化DEPDC5激活了mTOR信号通路进而促进三阴性乳腺癌的增殖。因此，我们期望开发一种能够抑制KLHL22-DEPDC5相互作用的药物来阻碍乳腺癌细胞的生长。
发明内容
本发明的目的是提供化合物ITM-2C6或其药学上可接受的盐的新用途。
所述化合物ITM-2C6，其SMILES结构式：
OC＝2/C＝C(/OC/C1＝C/C＝C/C＝C1/C)C＝CC＝2/C3＝N/N/C＝C3/C＝4C＝CC＝CC＝4OC
其结构式如式I所示：
本发明所提供的化合物ITM-2C6或其药学上可接受的盐的新用途是其在如下任一中的应用：
1)抑制KLHL22与DEPDC5的相互作用；
2)制备抑制KLHL22与DEPDC5相互作用的产品；
3)抑制真核生物肿瘤细胞增殖；
4)制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；
5)预防和/或治疗肿瘤；
6)制备预防和/或治疗肿瘤的产品。
所述真核生物为人或哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为乳腺癌细胞，具体可为三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231。
所述肿瘤为癌；所述癌具体为乳腺癌，进一步可为三阴性乳腺癌。
所述产品均可为药品。
以ITM-2C6或其药学上可接受的盐为活性成分制备的下述产品也属于本发明的保护范围；所述产品具有如下任一用途：
a)抑制KLHL22与DEPDC5相互作用；
b)抑制肿瘤细胞增殖；
c)预防和/或治疗肿瘤。
需要的时候，在上述产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
为了构建KLHL22-DEPDC5相互作用的模型，发明人曾尝试了ALPHA，NanoBit等系统。发现在原核表达的KLHL22-DEPDC5无法在ALPHA系统下工作。由此推测原核表达的KLHL22及DEPDC5难以进行相互作用。同样，发明人利用了NanoBit系统进行KLHL22-DEPDC5系统的构建，同样无法工作。最终选择了NanoBRET筛选系统，在该系统中，我们选择了KLHL22与DEP结构域的相互作用，其中DEP是DEPDC5与KLHL22相互作用的结构域。
在构建KLHL22-DEP相互作用系统时，发明人将KLHL22和DEP构建到了PromegaNanoBRET的pHTC，pHTN，pNLF1-N和pNLF1-C上，由此得到了8个质粒。并且对不同的蛋白N，C端连接进行了测试，最终发现pHTC-KLHL22与pNLF1-N-DEP具有最好的相互作用效果(图2)。除了蛋白不同的连接方式，我们同样测试了质粒的转染比例，我们发现当pHTC-KLHL22的质粒量为2ug，pNLF1-N-DEP的质粒量为0.02ug时具有较高的相互作用，该条件更适合用于药物筛选(图3)。除此之外，我们还在pHTC-KLHL22和pNLF1-N-DEP过表达的同时，过表达了ha-DEP质粒。发现ha-DEP的过表达抑制了KLHL22-DEP的NanoBRET信号，说明本发明的系统真实反映了KLHL22-DEP的相互作用。
利用上述建立的KLHL22-DEPDC5相互作用模型对化合物ITM-2C6进行筛选，加入化合物ITM-2C6的细胞中，KLHL22-DEP的相互作用强度要明显低于对照组(ctrl)强度。说明化合物具有抑制KLHL22-DEP相互作用的功能。并通过典型的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231对上述化合物ITM-2C6抗癌效果进行验证，结果表明，加入药物组的细胞数量远低于对照组数量，说明该化合物具有抑制三阴性乳腺癌细胞生长的作用。
附图说明
图1为NanoBRET的方法检测蛋白相互作用原理图；NanoLuc产生460nm荧光，激活618ligand 600nm以上的荧光，600nm/460nm的强度即两个蛋白相互作用强度。
图2为对不同的KLHL22及DEP连接方式进行检测。
图3为对不同转染比例的KLHL-HT，NL-DEP进行相互作用的强度检测；KLHL-HT：NL-DEP：A 1μg+1μg，B 2μg+0.2μg，C 2μg+0.02μg，D 2μg+0.002μg，negative 2μg+0μg；positive 2μg P53-HT+0.2μg NL-MDM2。
图4为在过表达NanoBRET相关质粒的基础上再过表达空载体或ha-DEP，检测NanoBRET系统的信号强度，两者之间有显著性差异，p＝0.0062。
图5为化合物ITM-2C6对KLHL22-DEP蛋白相互作用的抑制。
图6为化合物ITM-2C6对MD A-MB-231的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中：人类KLHL22(uniprot：Q53GT1)，DEP(DEPDC5 DEP结构域)
KLHL-HT代表pHTC-KLHL22；HT-KLHL代表pHTN-KLHL22；
KLHL-NL代表pNL1-C-KLHL22；NL-KLHL代表pNLF1-N-KLHL22；
DEP-NL代表pNLF1-C-DEP；NL-DEP代表pNLF1-N-DEP；
DEP-HT代表pHTC-DEP；HT-DEP代表pHTN-DEP.
下述实施例采用的方法：nanoBRET(promega，https://www.promega.com.cn/Products/Protein-Interactions/Live-Cell-Protein-Interactions/NanoBRET-PPI-Starter-Systems/)
下述实施例中使用的化合物ITM-2C6 SMILES结构式：
OC＝2/C＝C(/OC/C1＝C/C＝C/C＝C1/C)C＝CC＝2/C3＝N/N/C＝C3/C＝4C＝CC＝CC＝4OC
其结构式如式I所示：
该化合物购买自ChemDiv化合物库，商品目录号为：Y041-1191。
实施例1、构建KLHL22-DEPDC5蛋白相互作用筛选系统
实验方法：
首先我们利用传统的质粒构建方法构建了KLHL22及DEP过表达的相关质粒(promega，N1811)，具体为将KLHL22和DEP构建到了NanoBRET的pHTC，pHTN，pNLF1-N和pNLF1-C上，由此得到了8个质粒。在获得质粒后，利用PEI试剂(1mg/mL，polysciences，24765)对质粒进行转染。
KLHL22的蛋白氨基酸序列如序列表中序列1所示；DEPDC5蛋白DEP结构域的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
编码KLHL22蛋白的基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述编码DEP结构域的DNA分子的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
在构建上述8个重组质粒时，所采用的酶切位点均为SacII与XbaI。
pCDNA3.1-HA：购自addgene，128034。
pCDNA3.1-HA-DEP：利用传统方法将编码DEP结构域的DNA序列(如序列表中序列4所示)用BamHI和XhoI连接进入到pCDNA3.1-HA质粒中。
首先，将HEK-293T细胞养到了合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。一天后，对0.8-1.2*106个细胞数量进行了质粒转染1ug(KLHL22过表达的相关质粒)+1ug(DEP过表达的相关质粒)。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*106个/mL，并加入NanoBRETTM 618Ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。24小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer Envision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。结果见图2。由图2可知，相比于其他7组条件，pHTC-KLHL22与pNLF1-N-DEP组(KLHL-HT+NL-DEP)具有最强的生物发光信号。
除了蛋白不同的连接方式，发明人进一步对质粒的转染比例进行了考察。将pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP组按照A:1μg+1μg，B:2μg+0.2μg，C:2μg+0.02μg，D:2μg+0.002μg，negative 2μg+0μg，或者positive 2μg pHTC-TP53+0.2μg pNLF1-N-MDM2进行转染。首先，将HEK-293T细胞养到了合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。一天后，对细胞按照上述分组进行质粒转染。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*106个/mL，并加入NanoBRETTM 618 Ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。24小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer Envision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将A组的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。结果见图3。在A-D四组中，2μg：0.02μg组(C组)以及2μg：0.002μg组(D组)具有较高的相互作用强度，且高于试剂盒给出的阳性对照组(positive)。
在图4中，将pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP组按照1μg+0.01μg+1ug pCDNA3.1-HA或1μg+0.01μg+1ug pCDNA3.1-HA-DEP进行转染。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*106个/mL，并加入618ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。24小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将对照(control)的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。
图4结果表明，过表达ha-DEP组(o.v.ha-DEP)能够竞争性抑制KLHL22与DEP的相互作用。
实施例2、化合物ITM-2C6对KLHL22-DEP蛋白相互作用的抑制
将HEK-293T细胞培养到合适的生长状态，并按照30％细胞密度铺到6孔板中。采用pHTC-KLHL22与pNFL1-N-DEP质粒按照2μg+0.02μg进行转染。转染后一天，将细胞消化后用计数仪(Thermofisher)计数，并用含有4％血清(Gibco)的Opti-MEM(Gibco)将细胞密度调整为2*106个/mL，并加入NanoBRETTM 618 Ligand(1000倍稀释，promega，N1662)。16小时后，对细胞加入10μM浓度的化合物ITM-2C6(compound)或者DMSO溶剂(ctrl)。8小时后，给细胞加入25uL荧光素底物(萤光素酶底物)(100倍稀释，promega，N1662)，混合均匀后加入到96孔板的孔中。并利用酶标仪(perkin elmer Envision)对450nm及620nm的生物发光信号进行检测。并将620nm信号/450nm信号*1000作为最终的蛋白相互作用强度。并将对照(ctrl)的强度均一化调整为1，对其他实验组进行相应调整。结果见图5。由图5可知，加入化合物组(compound)的细胞中，KLHL22-DEP的相互作用强度要明显低于对照组(ctrl)强度。说明化合物具有抑制KLHL22-DEP相互作用的功能。
实施例3、化合物ITM-2C6对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的抑制作用
将典型的三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231以每个孔100μL，5000个细胞的数量接种到了96孔板中，待细胞贴壁后，每孔加入1uL 10mM(终浓度为100μM)的化合物(compound)或DMSO溶剂(ctrl)。48小时后，对细胞的数量进行计数，加入药物组的细胞数量(compound)远低于对照组(ctrl)数量，说明化合物具有抑制癌细胞生长的作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京景瑞康分子医药科技有限公司
<120>ITM-2C6在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 634
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Ala Glu Glu Gln Glu Phe Thr Gln Leu Cys Lys Leu Pro Ala Gln
1 5 10 15
Pro Ser His Pro His Cys Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Ala Gln His
20 25 30
Ser Gln Ala Leu Leu Arg Gly Leu Leu Ala Leu Arg Asp Ser Gly Ile
35 40 45
Leu Phe Asp Val Val Leu Val Val Glu Gly Arg His Ile Glu Ala His
50 55 60
Arg Ile Leu Leu Ala Ala Ser Cys Asp Tyr Phe Arg Gly Met Phe Ala
65 70 75 80
Gly Gly Leu Lys Glu Met Glu Gln Glu Glu Val Leu Ile His Gly Val
85 90 95
Ser Tyr Asn Ala Met Cys Gln Ile Leu His Phe Ile Tyr Thr Ser Glu
100 105 110
Leu Glu Leu Ser Leu Ser Asn Val Gln Glu Thr Leu Val Ala Ala Cys
115 120 125
Gln Leu Gln Ile Pro Glu Ile Ile His Phe Cys Cys Asp Phe Leu Met
130 135 140
Ser Trp Val Asp Glu Glu Asn Ile Leu Asp Val Tyr Arg Leu Ala Glu
145 150 155 160
Leu Phe Asp Leu Ser Arg Leu Thr Glu Gln Leu Asp Thr Tyr Ile Leu
165 170 175
Lys Asn Phe Val Ala Phe Ser Arg Thr Asp Lys Tyr Arg Gln Leu Pro
180 185 190
Leu Glu Lys Val Tyr Ser Leu Leu Ser Ser Asn Arg Leu Glu Val Ser
195 200 205
Cys Glu Thr Glu Val Tyr Glu Gly Ala Leu Leu Tyr His Tyr Ser Leu
210 215 220
Glu Gln Val Gln Ala Asp Gln Ile Ser Leu His Glu Pro Pro Lys Leu
225 230 235 240
Leu Glu Thr Val Arg Phe Pro Leu Met Glu Ala Glu Val Leu Gln Arg
245 250 255
Leu His Asp Lys Leu Asp Pro Ser Pro Leu Arg Asp Thr Val Ala Ser
260 265 270
Ala Leu Met Tyr His Arg Asn Glu Ser Leu Gln Pro Ser Leu Gln Ser
275 280 285
Pro Gln Thr Glu Leu Arg Ser Asp Phe Gln Cys Val Val Gly Phe Gly
290 295 300
Gly Ile His Ser Thr Pro Ser Thr Val Leu Ser Asp Gln Ala Lys Tyr
305 310 315 320
Leu Asn Pro Leu Leu Gly Glu Trp Lys His Phe Thr Ala Ser Leu Ala
325 330 335
Pro Arg Met Ser Asn Gln Gly Ile Ala Val Leu Asn Asn Phe Val Tyr
340 345 350
Leu Ile Gly Gly Asp Asn Asn Val Gln Gly Phe Arg Ala Glu Ser Arg
355 360 365
Cys Trp Arg Tyr Asp Pro Arg His Asn Arg Trp Phe Gln Ile Gln Ser
370 375 380
Leu Gln Gln Glu His Ala Asp Leu Ser Val Cys Val Val Gly Arg Tyr
385 390 395 400
Ile Tyr Ala Val Ala Gly Arg Asp Tyr His Asn Asp Leu Asn Ala Val
405 410 415
Glu Arg Tyr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Trp Ala Tyr Val Ala Pro Leu
420 425 430
Lys Arg Glu Val Tyr Ala His Ala Gly Ala Thr Leu Glu Gly Lys Met
435 440 445
Tyr Ile Thr Cys Gly Arg Arg Gly Glu Asp Tyr Leu Lys Glu Thr His
450 455 460
Cys Tyr Asp Pro Gly Ser Asn Thr Trp His Thr Leu Ala Asp Gly Pro
465 470 475 480
Val Arg Arg Ala Trp His Gly Met Ala Thr Leu Leu Asn Lys Leu Tyr
485 490 495
Val Ile Gly Gly Ser Asn Asn Asp Ala Gly Tyr Arg Arg Asp Val His
500 505 510
Gln Val Ala Cys Tyr Ser Cys Thr Ser Gly Gln Trp Ser Ser Val Cys
515 520 525
Pro Leu Pro Ala Gly His Gly Glu Pro Gly Ile Ala Val Leu Asp Asn
530 535 540
Arg Ile Tyr Val Leu Gly Gly Arg Ser His Asn Arg Gly Ser Arg Thr
545 550 555 560
Gly Tyr Val His Ile Tyr Asp Val Glu Lys Asp Cys Trp Glu Glu Gly
565 570 575
Pro Gln Leu Asp Asn Ser Ile Ser Gly Leu Ala Ala Cys Val Leu Thr
580 585 590
Leu Pro Arg Ser Leu Leu Leu Glu Pro Pro Arg Gly Thr Pro Asp Arg
595 600 605
Ser Gln Ala Asp Pro Asp Phe Ala Ser Glu Val Met Ser Val Ser Asp
610 615 620
Trp Glu Glu Phe Asp Asn Ser Ser Glu Asp
625 630
<210> 2
<211> 75
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Ser Thr Gly Val Gln Leu Leu Ser Glu Gln Lys Gly Leu Ser Pro Tyr
1 5 10 15
Cys Phe Ile Ser Ala Glu Val Val His Trp Leu Val Asn His Val Glu
20 25 30
Gly Ile Gln Thr Gln Ala Met Ala Ile Asp Ile Met Gln Lys Met Leu
35 40 45
Glu Glu Gln Leu Ile Thr His Ala Ser Gly Glu Ala Trp Arg Thr Phe
50 55 60
Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Tyr Lys Ile Val Thr
65 70 75
<210> 3
<211> 1905
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atggcagagg agcaggagtt cacccagctc tgcaagttgc ctgcacagcc ctcacaccca 60
cactgcgtga acaacaccta ccgcagcgca cagcactccc aggctctgct ccgagggctg 120
ctggctctcc gggacagcgg aatcctcttc gatgttgtgc tggtggtgga gggcagacac 180
atcgaggccc atcgcatcct gctggctgcg tcctgcgatt acttcagagg aatgtttgct 240
gggggattga aggagatgga acaggaagag gtcctgatcc acggtgtgtc ctacaatgct 300
atgtgccaaa tcctacattt catatacacc tccgagctgg agctcagcct gagcaatgta 360
caagagacac tggtggctgc ctgccagctt cagatcccag aaattatcca tttctgctgt 420
gatttcctca tgtcctgggt ggacgaagag aacattctcg atgtctaccg gctggcagag 480
ctgtttgact tgagccgcct gactgagcaa ctggacacct atatcctcaa aaactttgtg 540
gccttctctc ggactgacaa gtaccgccag cttccattgg agaaggtcta ctccctcctc 600
agcagcaatc gcctggaggt ctcctgcgag accgaggtat atgagggggc ccttctctac 660
cattatagcc tggagcaggt gcaggctgac cagatctcgc tgcacgagcc cccaaagctc 720
cttgagacag tgcggtttcc gctgatggaa gctgaggtcc tgcagcggct gcatgacaag 780
ctggacccca gccctttgag ggacacagtg gccagcgccc tcatgtacca ccggaacgag 840
agcctacagc ccagcctgca gagcccgcaa acggagctgc ggtcggactt ccagtgcgtt 900
gtgggcttcg ggggcattca ctccacgccg tccactgtcc tcagcgacca ggccaagtat 960
ctaaacccct tactgggaga gtggaagcac ttcactgcct ccctggcccc ccgcatgtcc 1020
aaccagggca tcgcggtgct caacaacttc gtatacttga ttggagggga caacaatgtc 1080
caaggatttc gagcagagtc ccgatgctgg aggtatgacc cacggcacaa ccgctggttc 1140
cagatccagt ccctgcagca ggagcacgcc gacctgtccg tgtgtgttgt aggcaggtac 1200
atctacgctg tggcgggccg tgactaccac aatgacctga atgctgtgga gcgctacgac 1260
cctgccacca actcctgggc atacgtggcc ccactcaaga gggaggtgta tgcccacgca 1320
ggcgcgacgc tggaggggaa gatgtatatc acctgcggcc gcagagggga ggattacctg 1380
aaagagacac actgctacga tccaggcagc aacacttggc acacactggc tgatgggcct 1440
gtgcggcgcg cctggcacgg catggcaacc ctcctcaaca agctgtatgt gatcgggggc 1500
agcaacaacg atgccggata caggagggac gtgcaccagg tggcctgcta cagctgcacg 1560
tctggacagt ggtcatctgt ctgcccactc cctgctgggc acggtgagcc tggcattgct 1620
gtgctggaca acaggatcta tgtgttaggt ggccgctcac acaaccgcgg cagccgcaca 1680
ggctacgtgc acatttacga tgtggagaag gactgctggg aggaagggcc ccagctggac 1740
aactccatct caggcctggc ggcctgtgtg ctcaccctgc cccgctccct gctccttgag 1800
ccgccccgcg ggacccctga ccgcagccag gccgacccgg actttgcctc tgaggtgatg 1860
agtgtgtctg actgggagga gtttgacaac tccagtgagg actag 1905
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
tcgacaggag tccagctgct ctctgaacag aagggcctct caccgtactg cttcatcagc 60
gcggaggtgg tacactggtt ggtgaaccac gtggagggga tccagacaca ggcgatggcc 120
attgacatca tgcagaaaat gctggaagag cagctcatca cacatgcatc tggcgaagcc 180
tggcggacct tcatctacgg cttctatttc tacaagatag taacg 225