一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用
阅读说明：本技术 一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用 (Application of kaempferitrin in relieving side effects of glucocorticoid ) 是由 谢保城 陈世春 何瑞荣 丁少波 于 2021-01-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及天然化合物在缓解糖皮质激素副作用方面的应用技术领域,具体涉及一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用。山奈苷或其药学上可接受的盐、酯或前药在制备缓解糖皮质激素副作用方面的药物中的用途,山奈苷能显著缓解糖皮质激素所致的成骨分化抑制作用,促进地塞米松诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化。该实验结果发现了本化合物在减轻糖皮质激素类药物副作用方面的分子作用机制,对于开发新的药物具有重要的临床意义。(The invention relates to the technical field of application of natural compounds in relieving glucocorticoid side effects, in particular to application of kaempferitrin in relieving glucocorticoid side effects. The kaempferide or pharmaceutically acceptable salt, ester or prodrug thereof can be used for preparing the medicine for relieving the side effect of glucocorticoid, and the kaempferide can obviously relieve the osteogenic differentiation inhibition effect caused by the glucocorticoid and promote dexamethasone to induce the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells. The experiment result discovers a molecular action mechanism of the compound in the aspect of reducing the side effect of glucocorticoid medicaments, and has important clinical significance for developing new medicaments.)
技术领域
本发明涉及天然化合物在缓解糖皮质激素副作用方面的应用技术领域，具体涉及一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用。
背景技术
糖皮质激素(GC)是机体内极为重要的一类调节分子，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，也是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。在紧急或危重情况下，糖皮质激素往往为首选。临床常见的糖皮质激素类药物有泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等。具有抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫及退热作用等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生，对任何类型的变态反应性疾病几乎都有效。
P.Hench、E.Kendal和T.Reichstein在1949年首次在Annals of the rheumaticdiseases杂志上报道运用糖皮质激素类药物治疗风湿性关节炎以来，糖皮质激素类药物以其优良的抗炎活性和免疫抑制作用，广泛运用于炎症、自身免疫性疾病及器官移植等临床治疗。目前临床上使用糖皮质激素治疗的主要原因包括炎症性、风湿性疾病(如风湿性关节炎，结缔组织病、红斑狼疮)、呼吸系统疾病(哮喘症、慢性阻塞性肺病)等。尽管糖皮质激素类药物具有良好的药理活性且在临床上应用广泛，但其在长期应用后的副作用却不容小觑。
糖皮质激素类药物的副作用主要表现在以下几方面：(1)诱发或加重感染；(2)物质代谢和水盐代谢紊乱，长期大量应用糖皮质激素可引起物质代谢和水盐代谢紊乱；(3)心血管系统并发症，长期应用糖皮质激素，可导致钠、水潴留和血脂升高，可诱发高血压和动脉粥样硬化；(4)神经精神影响，糖皮质激素可引起多种形式的行为异常，如神经过敏、激动、失眠、情感改变等；(5)诱发糖皮质激素性骨质疏松或骨折，长期应用糖皮质激素会诱导成骨谱系细胞的细胞周期阻滞并抑制其增殖；诱导成骨谱系细胞发生凋亡；导致的骨质流失会增加核因子-Kβ受体活化因子配体(RANKL)的释放，促进破骨细胞的分化和激活，抑制骨保护蛋白(OPG)的表达，OPG/RANKL的比例下调，导致破骨细胞数量增加，加速骨微结构破坏；抑制细胞的成骨分化及功能；(6)引发肥胖与库欣综合征。
Runx2是Runt相关转录因子2，属于Runt相关转录因子家族。Runx2是成骨分化特异性转录因子的一种，可调控许多基因的转录，能够上调SP7、OPN和OCN等多种骨基质蛋白基因的表达。同时也是间质细胞向成骨细胞分化的重要调控因子，当成骨细胞Runx2基因缺失时，其分化将会被抑制，研究者用敲除Runx2基因小鼠研究Runx2在成骨分化中的作用，发现敲除Runx2基因小鼠丧失了有效分化出成骨细胞的能力，其骨膜内和软骨内骨化现象消失。结果表明Runx2缺失会抑制成骨细胞的成骨分化从而导致机体发生骨化障碍。
骨桥蛋白(OPN)在骨组织中可由成骨细胞、破骨细胞、骨细胞合成和分泌，参与细胞移动、黏附、增殖、骨重建和矿化、信号转导等过程。生理状态下，骨形成和骨吸收处于动态平衡，当这种平衡被打破时，就可能出现骨代谢相关的疾病。近年来多项研究发现，OPN在骨代谢中有着不可替代的地位，可能是导致骨质疏松的一个重要环节。研究发现OPN对成骨细胞有着复杂双重调节机制：一方面，OPN可使成骨细胞向成熟状态转化，是成骨细胞分化成熟的标志之一；另一方面，OPN能促进OPG/RANKL的表达上调，促进成骨细胞增殖。
骨钙素(Osteocalcin，OCN)，也称为骨Gla蛋白，或骨γ-羧基谷氨酸蛋白(Boneγ-CarboxyglutamicAcid Containing Protein，BGLAP或BGP)，或骨依赖维生素K蛋白(BoneVitamin K Dependent Protein)，是一种由成骨细胞、成牙质细胞和肥大软骨细胞特异合成和分泌的一种结构蛋白，属于构成骨基质的成分之一。骨钙素分子中的谷氨酸残基通过依赖维生素K的翻译后修饰转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。γ-羧基化骨钙素分子含3个Gla残基。活性维生素D促进成骨细胞中γ-羧基化骨钙素的生物合成。γ-羧基化骨钙素称为活性骨钙素，能够通过Gla残基与钙结合。研究证明，骨钙素能维持骨的正常矿化速率，抑制异常的羟磷灰石(HA)结晶的形成，是反映机体骨代谢变化的灵敏、可靠的指标。由于一部分骨钙素分子分泌到血液中，所以用血清骨钙素水平作为骨形成和骨代谢病的指数。
糖皮质激素过量导致骨脆性增强，是患者发生骨折的高风险因素。糖皮质激素性骨质疏松在各种骨质疏松症中发生率较高且多数患者不易发现，症状隐匿。患者长期糖皮质激素治疗会导致骨骼矿物质密度下降并引发骨折的风险，高危人群应尽早开始骨保护治疗。目前，双膦酸盐为是临床上应用最为广泛的抗骨质疏松药物。研究表明双膦酸盐类抗骨质疏松药物可有效的改善腰椎、股骨颈和全髋骨密度，并降低椎体骨折发生风险。美国风湿病学会在2017年对糖皮质激素性骨质疏松指南进行了更新修订。该指南强推荐特立帕肽、雷洛昔芬、地诺单抗和双膦酸盐可作为一线治疗糖皮质激素性骨质疏松药物。但有研究发现如果长时间使用双膦酸盐类药物治疗骨质疏松反而会增加非典型性股骨骨折的风险，建议患者长时间使用3年或者5年以上则需要对患者病情进行评估以确定是否需要继续用药。如果使用特立帕肽则需要每日皮下注射、需冷藏储存、降低患者的依从性。同时该药的成本高且有副作用较多如头晕、抑郁、头痛等，特别是有肾结石病患者或甲状旁腺激素基线水平升高患者用药需特别谨慎，密切观察。因此，持续开发价格低廉、安全有效的治疗糖皮质激素性骨质疏松的药物尤为重要。
山奈苷是一种天然存在的黄酮类化合物，主要是由樟树和紫荆叶中提取，具有抗氧化，抗菌，抗炎和降血糖的作用。山奈苷是否具有抗糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)作用，并没有发现有相关的研究报道。作为一种资源丰富且天然的无毒化学物，山奈苷具有极高的药用价值及广泛的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种山奈苷在缓解糖皮质激素副作用方面的应用，所述山奈苷的化学式如式I所示，如式I所示化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药应用于制备缓解糖皮质激素副作用方面的药物：
在一方面，所述缓解糖皮质激素副作用通过调节选自Runx2的mRNA表达、OPN的mRNA表达、OPG的mRNA表达、Bglap的mRNA表达、Runx2的蛋白表达、OPN的蛋白表达、OPG的蛋白表达和Bglap的蛋白表达中的至少一种，或调节成骨细胞的碱性磷酸酶活性，或调节成骨细胞的矿化实现。优选地，所述缓解糖皮质激素副作用通过促进选自Runx2的mRNA表达、OPN的mRNA表达、OPG的mRNA表达、Bglap的mRNA表达、Runx2的蛋白表达、OPN的蛋白表达、OPG的蛋白表达和Bglap的蛋白表达中的至少一种，或促进成骨细胞的碱性磷酸酶活性，或促进成骨细胞的矿化实现。
在一方面，所述糖皮质激素副作用选自：肥胖与库欣综合征、诱发感染、加重感染、物质代谢紊乱、水盐代谢紊乱、心血管系统并发症、水钠潴留、高血脂、高血压、动脉粥样硬化、神经过敏、神经异常、失眠、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、骨折、成骨谱系细胞的细胞周期阻滞、促进破骨细胞的分化、促进破骨细胞的激活、诱导成骨谱系细胞发生凋亡和成骨分化抑制中的至少一种。优选的，所述糖皮质激素副作用选自：骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、骨折、成骨谱系细胞的细胞周期阻滞、促进破骨细胞的分化、促进破骨细胞的激活、诱导成骨谱系细胞发生凋亡和成骨分化抑制中的至少一种。
本发明亦提供式I所示化合物在制备用于治疗糖皮质激素造成的Runx2表达抑制相关疾病，或OPN表达抑制相关疾病，或OPG表达抑制相关疾病，或Bglap表达抑制相关疾病，或成骨细胞的碱性磷酸酶活性抑制相关疾病，或成骨细胞矿化结节形成抑制的药物中的用途。
在一方面，所述糖皮质激素选自泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松或地塞米松。优选的，所述糖皮质激素选自泼尼松龙、氢化可的松或地塞米松。
在一方面，所述疾病选自肥胖与库欣综合征、诱发感染、加重感染、物质代谢紊乱、水盐代谢紊乱、心血管系统并发症、水钠潴留、高血脂、高血压、动脉粥样硬化、神经过敏、神经异常、失眠、骨骼肌的分解代谢、骨质疏松、骨折、成骨谱系细胞的细胞周期阻滞、促进破骨细胞的分化、促进破骨细胞的激活、诱导成骨谱系细胞发生凋亡和成骨分化抑制中的至少一种。
本发明亦提供式I所示化合物在制备用于调节Runx2表达的试剂中的用途。
本发明亦提供式I所示化合物在制备用于调节OPN表达的试剂中的用途。
本发明亦提供式I所示化合物在制备用于调节OPG表达的试剂中的用途。
本发明亦提供式I所示化合物在制备用于调节Bglap表达的试剂中的用途。
本发明的发明人经过创造性劳动，开展了山奈苷相关实验研究，发现山奈苷能显著缓解地塞米松所致MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性抑制和矿化抑制作用，以及进一步发现山奈苷可以缓解地塞米松所致成骨相关Runx2、OPN、Bglap、OPG的mRNA和蛋白抑制的情况。综合以上的研究结果表明，我们创造性发现山奈苷能显著缓解糖皮质激素所致的成骨分化抑制作用，促进地塞米松诱导MC3T3-E1细胞的成骨分化。该实验结果发现了本化合物在减轻糖皮质激素类药物副作用方面的分子作用机制，对于开发新的药物具有重要的临床意义。
附图说明
图1是本发明的山奈苷对MC3T3-E1细胞的活性的影响(*P<0.05vs Control)；
图2是山奈苷对地塞米松所致MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶抑制的作用(**P<0.01)，OM：成骨诱导组，DEX：地塞米松组；
图3是山奈苷对地塞米松所致MC3T3-E1细胞矿化抑制的作用(**P<0.01)，OM：成骨诱导组，DEX：地塞米松组；
图4是山奈苷对地塞米松所致MC3T3-E1细胞成骨分化抑制中成骨相关基因的影响(*P<0.05,**P<0.01)，OM：成骨诱导组，DEX：地塞米松组；
图5是山奈苷对地塞米松所致MC3T3-E1细胞成骨分化抑制中成骨相关蛋白的影响(*P<0.05,**P<0.01)，OM：成骨诱导组，DEX：地塞米松组。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
术语“药学上可接受的盐或酯”表示本发明式I化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐或酯，和碱加成盐。这些盐或酯可以在化合物的最终分离和纯化过程中原位制备。特别是，可以通过独立使纯化的游离碱形式的化合物与适宜的有机或无机酸反应，和将如此形成的盐或酯分离，来制备酸加成盐或酯。示例性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、naphthylate、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐(lactiobionate)、氨基磺酸盐、丙二酸盐、水杨酸盐、丙酸盐、亚甲基-双-b-羟基萘甲酸盐、龙胆酸盐、异硫代硫酸盐、二对甲苯酰酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐月桂基磺酸盐(quinateslaurylsulphonate)等(参见例如，Berge等人，“Pharmaceutical Salts”，J.Pharm.Sci.，66：1-9(1977)和Remington′s PharmaceuticalSciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页，据此整体通过引用并入本文)。也可以通过独立进行使纯化的酸形式的化合物与适宜的有机或无机碱反应，和分离如此形成的盐，来制备碱加成盐。碱加成盐包括药学上可接受的金属盐和胺盐。适宜的金属盐包括钠、钾、钙、钡、锌、镁和铝盐。钠和钾盐为优选。适宜的无机碱加成盐是由金属碱制备的，所述金属碱包括氢化钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁和氢氧化锌。适宜的胺碱加成盐是由胺制备的，所述胺具有足够的碱性以形成稳定的盐，并且优选包括由于其药用的低毒性和可接受性而在医药化学中常用的那些胺，所述胺的实例包括氨、乙二胺、N-甲基-葡糖胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)-氨基甲烷、四甲基氢氧化铵、三乙胺、二苄胺、二苯羟甲胺、脱氢松香胺、N-乙基哌啶、苄胺、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、乙胺、碱性氨基酸例如赖氨酸和精氨酸、二环己基胺等。
本文所用的术语“药学上可接受的前药”表示可根据本发明使用的化合物的前药，以及，在可能的情况下，本发明化合物的两性离子形式，所述前药，在合理的医学判断范围内，适合用于与人和低级动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等，与合理的利益/风险比率相称，并对预期的使用是有效的。术语“前药”表示迅速在体内转化，例如通过在血液中水解，产生上式母体化合物的化合物。可以通过体内代谢裂解而迅速转化的官能团，形成与本发明化合物的羧基反应的一类基团。所述官能团包括，但不限于，如烷酰基(例如乙酰基、丙酰基、丁酰基等)、未取代的和取代的芳酰基(例如苯甲酰基和取代的苯甲酰基)、烷氧基羰基如乙氧基羰基)、三烷基甲硅烷基(例如三甲基和三乙基甲硅烷基)、与二羧酸形成的单酯(例如琥珀酰基)等这类的基团。由于本发明有用的化合物的可代谢裂解基团在体内容易被裂解，所以携带这样的基团的化合物可以作为前药。携带代谢可裂解基团的化合物具有可以表现出提高的生物利用度的优点，所述优点是由于存在代谢可裂解基团而给予母体化合物提高的溶解度和/或吸收率的结果。下列文献提供了前药的详尽论述：Design of Prodrugs，H.Bundgaard编辑，Elsevier(1985)；Methods in Enzymology，K.Widder等人编辑，Academic Press，42，第309-396(1985)；A Textbook of Drug Designand Development，Krogsgaard-Larsen和H.Bundgaard编辑，第5章；“Design andApplications of Prodrugs”第113-191页(1991)；Advanced Drug Delivery Reviews，H.Bundgard，8，第1-38页(1992)；Journal of Pharmaceutical Sciences，77：285(1988)；Nakeya等人，Chem.Pharm.Bull.，32：692(1984)；Higuchi等人，“Pro-drugs as NovelDelivery Systems”，A.C.S.Symposium Series的第14卷，以及Bioreversible载体in DrugDesign，Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association and PergamonPress(1987)，上述文献通过引用整体并入本文。
前药的实例包括但不限于，本发明化合物中的醇和胺官能团的乙酸酯(盐)、甲酸酯(盐)和苯甲酸酯(盐)衍生物。
术语“治疗有效量”是指描述有效产生所需治疗效果的本发明化合物的量。这样的量通常依若干因素变化，而所述变化是在已知本文提供的描述的普通技术人员能够确定和计算的范围内。这些因素包括，但不限于：特定的个体及其年龄、体重、身高、一般身体状况和医疗经历，所使用的特定化合物，化合物配制于其中的载体，所选择的化合物的施用途径，以及被治疗的病症的性质和严重性。
术语“药物组合物”意指包含式(I)化合物以及依施用方式和剂型的性质而定的至少一种选自以下药学上可接受的成分的组合物，包括：载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或赋形剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、矫味剂、香味剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。悬浮剂的实例包括乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶、或这些物质的混合物。通过多种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等，能够确保预防微生物的作用。最好包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，能够使注射剂型延长吸收。适宜的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、乙醇、多元醇、它们的适宜的混合物、植物油(例如橄榄油)、和注射有机酯例如油酸乙酯。赋形剂的实例包括乳糖、枸橼酸钠、碳酸钙、磷酸二钙。崩解剂的实例包括淀粉、藻酸和一些复合硅酸盐。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石以及高分子量聚乙二醇。
术语“药学上可接受”意指在合理的医疗判断范围内，适用于与人和低等动物细胞接触而没有过度的毒性、刺激性、变应性反应等，且与合理的益处/风险比相应。
术语“药学上可接受的剂型”意指本发明化合物的剂型，包括例如片剂、糖锭剂、散剂、酏剂、糖浆剂、液体制剂(包括混悬剂、喷雾剂、吸入片剂、锭剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、胶囊剂和栓剂)以及用于注射的液体制剂，包括脂质体制剂。一般可在Remington’sPharmaceutical Science，Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版中发现配制技术和制剂。
本发明的化合物可以按照各种公知的方法制备，没有特别限定。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
MC3T3-E1细胞的增殖实验
1.1药物与试剂
MC3T3-E1细胞株(中国科学院细胞库)，澳洲胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(兰州民海生物工程有限公司)，α-MEM培养基(不含Vc)(美国GIBCO)，地塞米松(Dexamethasone，Dex)(美国Sigma)，β-甘油磷酸钠(Sodiumβ-glycerophosphate，β-GP)(美国Sigma)，抗坏血酸(vitamin C，Vc)(美国Sigma)，NBT/BCIP染色试剂(美国Sigma)，CCK-8检测试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(日本同仁)，碱性磷酸酶活性检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，氯化十六烷基吡啶(Cetylpyridinium Chloride，CPC)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术有限公司)，MgCl2·6H2O(广东汕头市西陇化工厂)，无水乙醇(天津市大茂化学试剂厂)，茜素红(美国Sigma)，二甲基亚砜(DMSO)，山奈苷(成都曼思特生物科技有限公司)。
1.2 MC3T3-E1细胞培养
将MC3T3-E1细胞从液氮罐中复苏后，使用含10％胎牛血清的α-MEM培养基(不含Vc)于37℃，5％CO2培养箱中持续培养MC3T3-E1细胞，每3天进行培养基换液，待细胞长至铺满瓶底约90％时，采用0.25％胰酶进行消化，900rpm离心2min，收集细胞，进行以下的实验。
1.3 CCK-8法检测山奈苷对MC3T3-E1细胞活性的影响
将消化后的MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液后，细胞计数调整细胞密度为3×103个/孔；每孔接种100μl细胞悬液于96孔板，放入二氧化碳孵育箱中培养。24h细胞贴壁后，将细胞分组，分组如下：①0μM山奈苷(Control组)，②1μM山奈苷组，③5μM山奈苷组，④10μM山奈苷组，⑤20μM山奈苷组，⑥40μM山奈苷组，⑦60μM山奈苷组，⑧80μM山奈苷组，⑨100μM山奈苷组。于给药后48h和72h，运用CCK-8检测试剂盒检测细胞增殖情况。加入100μl CCK-8工作液，放入孵育箱继续培养2h，到达孵育时间后，取出96孔细胞培养板，在酶标仪450nm波长处测量各孔的吸光度，比较各组之间OD(optical density)值。
实验结果：如图1所示，实验结果表明，山奈苷在1-80μM范围内培养48h和72h均对MC3T3-E1细胞的活性没有抑制作用。
1.4细胞碱性磷酸酶染色以及活性检测
碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞早期分化的标志性糖蛋白，ALP活性与细胞成骨分化有着密切关系。在成骨分化及功能成熟的早期阶段，ALP活性强弱可作为评估骨形成及骨转换的指标之一。但超生理量的糖皮质激素的作用下，体外成骨分化过程中的碱性磷酸酶的活性会受到显著的抑制并影响到细胞的成骨分化能力。本实验中采用碱性磷酸酶染色和碱性磷酸酶活性定量检测，探究山奈苷是否具有缓解地塞米松所致的MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性抑制的作用。
实验方法：
将消化后的MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液后，细胞计数使细胞密度调整为2.5×104个/孔；取24孔板，每孔接种500μl细胞悬液。
分组处理：实验分组：①成骨分化诱导组(对照组)，②地塞米松模型组，③地塞米松+5μM山奈苷组，④地塞米松+10μM山奈苷组，⑤地塞米松+20μM山奈苷组。ALP染色：细胞培养7天后，进行ALP染色，染色步骤如下：①吸弃原培养基，每孔加入500μl PBS洗涤；②吸去PBS，70％乙醇固定15min；③吸去固定液，每孔加入ALP缓冲液平衡5min，重复两次；④每孔加入300μl新配的NBT/BCIP染色液；⑤37℃下避光孵育15～30min，或至明显蓝色颗粒生成；⑥吸取弃去染色液，蒸馏水终止反应，显微镜下观察并拍照。
ALP活性检测：使用ALP活性试剂盒检测样品中的ALP活性，在405nm测定吸光度，根据酶活性定义，计算出样品中的ALP活性。作图与统计分析：在Graphpad prism软件中作图，单因素方差分析。
实验结果：如图2所示，结果发现，地塞米松在1μM能显著抑制细胞ALP活性，ALP染色变浅。与地塞米松模型组相比，随着山奈苷组，ALP染色逐渐加深，ALP活性逐渐恢复。以上实验结果表明，山奈苷能够在一定程度上缓解地塞米松所致的MC3T3-E1细胞ALP活性抑制的作用。
1.5矿化结节染色以及定量检测
矿化结节主要在细胞成骨分化晚期出现，是成骨细胞分化过程中产生的羟基磷灰石晶体和无定型磷酸钙分泌至细胞外基质中，与骨钙素、骨桥蛋白、胶原等结合形成羟基磷灰石结晶，是判断成骨分化晚期重要的指标之一。因此，本实验采用茜素红染色及钙结节定量来研究山奈苷对地塞米松抑制MC3T3-E1细胞矿化的影响。
实验方法：
将消化后的MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液，细胞接种培养。细胞计数使细胞密度调整为2.5×104个/孔；取24孔板，每孔接种500μl细胞悬液。
分组处理：实验分组：①成骨分化诱导组(对照组)，②地塞米松模型组，③地塞米松+5μM山奈苷组，④地塞米松+10μM山奈苷组，⑤地塞米松+20μM山奈苷组。接种培养至第14天后，运用茜素红染色法观察细胞的矿化。茜素红染色步骤如下：①细胞接种至14天后，每孔加入500μl PBS洗涤细胞两次，②吸去PBS，70％乙醇固定液，固定15min，③吸去固定液，每孔加入500μl 0.5％茜素红溶液(pH＝4.1)，④37℃避光孵育15～30min，或至桔黄色钙结结出现，⑤吸去染色液，每孔加蒸馏水终止反应，重复两至三次,⑥晾干，显微镜下观察并拍照。
钙结节染色定量分析：a.每孔加入500μl 10％氯化十六烷基吡啶溶液，常温孵育30min；b.置摇床震荡15～30min，使结晶物充分溶解后吸取溶液于96孔板，在酶标仪562nm波长处测量各孔的吸光度；c.统计分析：比较各组之间OD值，采用Spss 17.0单因素方差分析。d.作图：在Graphpad prism软件中作图。
实验结果：如图3所示，MC3T3-E1细胞分组干预培养14天后，茜素红染色结果发现：与诱导组相比，地塞米松组的茜素红染色明显变浅，矿化被抑制；添加山奈苷组，茜素红染色逐渐加深。矿化结节定量结果发现：与诱导组相比，地塞米松组的矿化结节形成受到抑制，添加山奈苷组，矿化结节的形成逐渐恢复。以上实验结果表明，地塞米松能显著抑制MC3T3-E1细胞的矿化结节形成，山奈苷能缓解由地塞米松所致的MC3T3-E1细胞矿化结节形成抑制的作用。
1.6山奈苷对MC3T3-E1细胞Runx2、OPN、OPG、Bglap的mRNA表达影响
实时定量PCR检测：将消化后的MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液，细胞计数以105个/孔接种于6孔板。
实验分组：①成骨分化诱导组(对照组)，②地塞米松模型组，③地塞米松+5μM山奈苷组，④地塞米松+10μM山奈苷组，⑤地塞米松+20μM山奈苷组。于第3天按以Trizal提取细胞总RNA，按照cDNA合成试剂盒将所得总RNA反转录为cDNA。cDNA，使用实时荧光定量PCR试剂盒和7500Real Time PCR仪进行RT-PCR反应，检测相关基因Runx2、Bglap、OPN和OPG的表达情况。
目的基因引物序列：Runx2上游“5’-gaatgcactacccagccac-3”，下游“5’-tggcaggtacgtgtggtag-3”；OPN上游“5’-tccaaagccagcctggaac-3”，下游“5’-tgacctcagaagatgaactc-3”；OPG上游“5’-agaagaagactgtttctcaagcact-3”，下游“5’-gcctcactctccggactcag-3”；Bglap上游“5’-ttctgctcactctgctgacc-3”，下游“5’-gccggagtctgttcactacc-3”；β-actin上游“5’-gccaaccgtgaaaagatgac-3”，下游“5’-accagaggcatacagggacag-3”扩增流程为，预变性：95℃，30s，扩增：95℃，5s，60℃，34s，40个循环进行基因扩增。以β-actin为内参，应用2-△△Ct相对定量法，检测各组基因mRNA的相对表达量。
实验结果：如图4所示，采用实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OPN、OPG、Bglap的mRNA表达情况。结果显示，地塞米松可以显著抑制Runx2、OPN、Bglap、OPG的基因mRNA表达，山奈苷能够一定程度上缓解地塞米松所致Runx2、OPN、Bglap、OPG的基因的抑制情况，差异统计学意义。
1.7山奈苷对MC3T3-E1细胞Runx2、OPN、OPG、Bglap的蛋白表达影响
蛋白质印迹法检测：将消化后的MC3T3-E1细胞用α-MEM完全培养基制备成均匀的单细胞悬液，以105个/孔接种于6孔板。
实验分组：①成骨分化诱导组(对照组)，②地塞米松模型组，③地塞米松+10μM山奈苷组，④地塞米松+20μM山奈苷组。诱导分化5天后，PBS洗涤两次，用RIPA法裂解细胞，离心，提取总蛋白质。BCA法测定蛋白浓度，蛋白质免疫印迹检测细胞中的目标蛋白质含量。样品加入上样缓冲液后95℃加热5min变性。每孔上样30μL总蛋白进行SDS-PAGE。电泳后半干转蛋白至裁剪好的电转膜上，电转完毕后，将电转膜置于5％的脱脂奶粉封闭，37℃2h。一抗蛋白分别是Runx2(Cell Signal Technology,1:1000)，OPN(Cell Signal Technology,1:1000),Bglap(Cell Signal Technology,1:1000),OPG(Cell Signal Technology,1:1000),β-actin(Cell Signal Technology,1:5000)。4℃环境孵育过夜，一抗孵育完成后，从一抗混合液中取出蛋白条带，放入装有1×TBST的容器中，于水平摇床上快速震摇漂洗5min，弃重复3-4次；置入预先配置好的二抗稀释液中(根据抗体说明书选择孵育二抗的类型)，室温缓慢震摇1h孵育。
显影与结果分析：PVDF膜漂洗后加入现配的ECL显影液，置于凝胶成像系统下曝光。拷贝数据后应用Image J或其他软件对结果进行灰度分析。
实验结果：如图5所示，我们采用蛋白质印迹法检测成骨相关蛋白Runx2、OPN、Bglap和OPG的表达情况。实验结果显示，地塞米松可以显著抑制Runx2、OPN、Bglap、OPG的蛋白表达，山奈苷能够一定程度上缓解地塞米松所致Runx2、OPN、Bglap、OPG的蛋白抑制的情况，差异统计学意义。
统计学分析：采用SPSS 20.0软件对实验数据进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD多重检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。