一种快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法
阅读说明：本技术 一种快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法 (Method for rapidly and effectively identifying embryo genotype of living zebra fish ) 是由 不公告发明人 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法,具体步骤包括将将单个活体斑马鱼胚胎放至一种含蛋白酶的DNA收集液中,转移至适当的环境温度条件下在具一定转速摇动或震动的情况下孵育一段时间,然后收取DNA收集液,同时在单个胚胎中加入胚胎恢复液。收集到的DNA收集液中含从活体胚胎中分离出的含核上皮细胞,经加入裂解处理后可直接用作基因组DNA模板用于未来的基因型鉴定；加入胚胎恢复液的斑马鱼胚胎可正常发育与生长。本发明进一步提供了可用于快速有效鉴定包括斑马鱼活体胚胎在内的行体外发育的动物活体胚胎的基因型鉴定的试剂盒,其特征在于所述试剂盒包括本发明中所述的各种溶液和蛋白酶。(The invention relates to a method for quickly and effectively identifying living zebra fish embryo genotype, which comprises the following specific steps of putting a single living zebra fish embryo into DNA collecting liquid containing protease, transferring the living zebra fish embryo into a proper environment temperature condition, incubating for a period of time under the condition of shaking or shaking at a certain rotating speed, then collecting the DNA collecting liquid, and simultaneously adding embryo recovery liquid into the single embryo. The collected DNA collecting fluid contains the epithelial cells containing nuclei separated from the living embryo, and the cells can be directly used as a genome DNA template for future genotype identification after being added with lysis treatment; the zebra fish embryo added with the embryo recovery liquid can normally develop and grow. The present invention further provides a kit for rapid and efficient genotyping of in vitro developing live animal embryos, including zebrafish live embryos, characterized in that the kit comprises various solutions and proteases as described herein.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于蛋白酶限制性酶解以取得活体斑马鱼胚胎细胞基因组DNA模板用于鉴定斑马鱼活体胚胎基因型的方法，其特征在于将单个活体斑马鱼胚胎放至一种含蛋白酶的DNA收集液中，转移至适当的环境温度条件下摇动或震动孵育一段时间，然后收取DNA收集液，同时在单个胚胎中加入胚胎恢复液。收集到的DNA收集液中含从活体胚胎中分离出的细胞(核)，经加入裂解液处理后可直接用作基因组DNA模板用于未来的基因型鉴定，加入胚胎恢复液的斑马鱼胚胎可正常发育与生长。
技术背景
作为一个强有力的脊椎动物的模式动物，斑马鱼被广泛用于从动物发育、到疾病模型以及药物筛选等多个不同研究领域。斑马鱼作为模式动物的一个重要优势就是可进行多种遗传操作。新近发明的CRISPR技术极大地提高了斑马鱼遗传改造的便利性。
斑马鱼基因组是否被成功实现遗传改造需要通过基因型鉴定来确定。而要进行基因型鉴定，必然涉及到生物样品的取材以制备基因组DNA模板。就处于发育早期的斑马鱼胚胎而言，迄今绝大多数的基因型鉴定方法所涉及到的生物样本取材都需要牺牲斑马鱼胚胎本身，否则需要将斑马鱼胚胎饲养至1月龄以上以剪取部分尾鳍而无需处死斑马鱼幼鱼(Parant et al.，2009)。
尽管针对活体斑马鱼胚胎直接进行基因型鉴定(无需牺牲斑马鱼胚胎)的方法已经有报道，但是这些方法中或者需要使用特殊仪器(Samuel et al.，Lambert et al.，2018)，或者需要冗长的外科手术(Xing et al.，2014；Kosuta et al.，2018)。这些局限性增加了实验时间和实验成本，不利于后续的大规模的实验开展，特别是表型筛选工作的开展。因而，急需发明一种针对活体斑马鱼胚胎的快速基因型鉴定方法。
斑马鱼胚胎被证明拥有强大的再生能力。基于此，本发明描述了通过使用有限的蛋白酶裂解建立一种低廉且操作相对简便的活体胚胎基因型鉴定方法。
在本发明中，我们优选了蛋白酶的种类以及酶解活体胚胎的条件，有效地解决了将含核细胞从斑马鱼活体胚胎中分离出来而不损害胚胎的生存能力，且分离出来的含核细胞的量足以用于后续的PCR扩增，实现对活体胚胎的基因型鉴定。
参考文献
KOSUTA，C.，DANIEL，K.，JOHNSTONE，D.L.，MONGEON，K.，BAN，K.，LEBLANC，S.，MACLEOD，S.，ET-TAHIRY，K.，EKKER，M.，MACKENZIE，A.&PENA，I.2018.High-throughput DNAExtraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping.J Vis Exp.
LAMBERT，C.J.，FRESHNER，B.C.，CHUNG，A.，STEVENSON，T.J.，BOWLES，D.M.，SAMUEL，R.，GALE，B.K.&BONKOWSKY，J.L.2018.An automated system for rapid cellularextraction from live zebrafish embryos and larvae：Development and applicationto genotyping.PLoS One，13，e0193180.
PARANT，J.M.，GEORGE，S.A.，PRYOR，R.，WITTWER，C.T.&YOST，H.J.2009.A rapid andefficient method of genotyping zebrafish mutants.Dev Dyn，238，3168-74.
SAMUEL，R.，STEPHENSON，R.，ROY，P.，PRYOR，R.，ZHOU，L.，BONKOWSKY，J.L.&GALE，B.K.2015.Microfluidic-aided genotyping of zebrafish in the first 48h with100％viability.Biomed Microdevices，17，43.
XING，L.，QUIST，T.S.，STEVENSON，T.J.，DAHLEM，T.J.&BONKOWSKY，J.L.2014.Rapidand efficient zebrafish genotyping using PCR with high-resolution meltanalysis.J Vis Exp，e51138.
发明内容
本发明的目的之一在于建立快速有效的鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的方法。要进行活体斑马鱼胚胎的基因型鉴定，必须要从活体胚胎中分离中含核的斑马鱼细胞。在本发明中，我们将单个活体斑马鱼胚胎放至一种含蛋白酶的DNA收集液中，转移至适当的环境温度条件下摇动孵育一段时间，然后收取DNA收集液，同时在单个胚胎中加入胚胎恢复液。收集到的DNA收集液中含从活体胚胎中分离出的细胞，经加入裂解液处理后可直接用作基因组DNA模板用于未来的基因型鉴定，加入胚胎恢复液的斑马鱼胚胎可正常发育与生长。
为从活体胚胎分离中出含核的斑马鱼细胞，在本发明的一个实施例中，我们以E3培养液(配方见
具体实施方式
)配制了分别含0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、0.1％蛋白酶(Pronase)、0.3％I型胶原蛋白酶(Collagenase Type I)和0.001％蛋白酶K(Pronase K)等4种不同的DNA收集液，然后比较了这4种不同DNA收集液在37℃隔水恒温培养箱中从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现含0.001％蛋白酶K的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果最好(大于30％)，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例大于75％。
确定了优选的蛋白酶K后，在本发明的另一个实施例中，我们评价了不同的胚胎收集液从活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果。我们以常用的PBS(磷酸盐缓冲液)、鱼类生理盐水、30mM Tris(pH8.0)和E3培养液分别配制了含0.001％蛋白酶K的DNA收集液，然后比较了这4种不同DNA收集液在37℃隔水恒温培养箱中从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现以30mM Tris(pH8.0)配制的含0.001％蛋白酶K的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果最好(基因型鉴定成功率几乎达100％)，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例大于90％。
确定了适当的蛋白酶和培养液后，在本发明的另一个使用例中，我们评价了不同浓度的蛋白酶K配制的DNA收集液从活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含1μg/ml、5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和75μg/ml蛋白酶K的DNA收集液，然后比较了这4种不同DNA收集液在37℃隔水恒温培养箱中从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现当蛋白酶K浓度为12.5μg/ml、25μg/ml和75μg/ml时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果最好(基因型鉴定成功率均100％)，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例大于80％。
确定了适当的DNA收集液后，在本发明的另一个实施例中，我们评价了不同的孵育时间从活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液，然后比较了该DNA收集液在37℃环境条件下与96hpf斑马鱼胚胎分别共孵育5min、10min、15min、20min和30min后从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现当共孵育时间为10min、15min、20min、和30min时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果依序升高，基因型鉴定成功率从75％升高至100％，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例均大于90％。
确定了适当的DNA收集液和孵育时间后，在本发明的另一个实施例中，我们评价了孵育时不同的旋转速度对从活体胚胎中收集的含核细胞用于基因型鉴定效果的影响。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液，然后比较了该DNA收集液在37℃环境条件下与96hpf斑马鱼胚胎分别以0、50、100、500和1,000rpm共孵育30min后从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现当共旋转速度孵育时间为500和1000rpm(转/秒)时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定成功率均为100％，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例分别为90％和60％。
确定了适当的DNA收集液及共孵育时间后，在本发明的另一个实施例中，我们评价了从不同发育时期的活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含15或25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液，然后比较了该DNA收集液在37℃环境条件下分别与24hpf、48hpf、72hpf和96hpf等不同发育时期的斑马鱼胚胎共孵育15min(24hpf胚胎)、20min(48hpf胚胎)和30分钟(72-96hpf)后从活体胚胎中分离到的细胞用于基因型鉴定的效果，结果发现自24-96hpf不同发育时期胚胎经DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果均较好，基因型鉴定成功率均在85％以上，加入恢复液处理的胚胎进一步存活的比例均大于80％。
为进一步增强该方法在高通量筛选活体突变斑马鱼胚胎中的运用，在另一个实施例中，我们建立了活体胚胎基因型鉴定的两轮法。具体地，当胚胎发育至48hpf，将多至8个胚胎一组一起放入24孔板的其中一个培养孔中，按照前述的方法，加入DNA收集液(DNA收集液的加入量按单个胚胎加入的溶液的倍数)，摇动培养后，收集DNA收集液，胚胎中则加入恢复液让胚胎继续生长。按前述方法以经裂解液处理后的用胚胎收集液作为基因组模板通过PCR对胚胎进行基因型鉴定。当基因型鉴定出现阳性结果时(譬如携带目标突变等位基因)，则将第一轮分组的发育至96hpf的胚胎逐一进行基因型鉴定，以确定携带的目标基因的胚胎。该方法特别适用于对那些种系遗传效率低下的基因组改造(如基因敲入、碱基编辑以及目标基因的大片段删除等)的胚胎进行大规模的筛选。每人可以很容易的对多至800枚胚胎进行一轮筛选。
本发明的目的之二在于进一步提供了用于快速有效鉴定活体斑马鱼胚胎基因型的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括本发明中所述的各种溶液和蛋白酶。
本发明的目的之三在于本发明所提供的方法及试剂盒可以用于其它行体外发育的水生或陆生动物活体胚胎如青鳉鱼、青鳉鱼、黄颡鱼、鲤鱼、石斑鱼和爪蛙等活体胚胎的基因型鉴定。
发明的有益结果
本发明提供了一个快速的(包括PCR在内不到3小时)、成本低廉的、高通量对行体外发育胚胎的动物如鱼类活体胚胎进行基因型鉴定的方法。该方法特别适用于筛选携带SNP、转基因、和突变等位基因(包括单碱基对的变化、插入、或缺失)等的活体胚胎。将有利于方便斑马鱼等活体动物胚胎在生物医药研究中的运用。
附图说明
图1示出的是快速有效的活体斑马鱼胚胎基因型鉴定的基本过程。(A)将单个活体斑马鱼胚胎放至一种含蛋白酶的DNA收集液中，转移至适当的环境温度条件下摇动或震动孵育一段时间，然后收取DNA收集液，同时在单个胚胎中加入胚胎恢复液。收集到的DNA收集液中含从活体胚胎中分离出的细胞(核)，经加入裂解液处理后可直接用作基因组DNA模板用于未来的基因型鉴定，加入胚胎恢复液的斑马鱼胚胎可正常发育与生长。(B)经基因鉴定后发育至7dpf斑马鱼仔鱼的代表性图像(无任何可见的发育异常)；幼鱼呈侧面观，头部朝左；(C)以经加入裂解液处理的DNA收集液作为基因组DNA进行PCR扩增所获得的代表性PCR产物电泳的结果；NC，阴性对照，PC，阳性对照。
图2示出的是斑马鱼活体胚胎基因型鉴定方法的系统优化方案。(A)起始测试时使用不同的蛋白酶进行的基因型鉴定结果比较；不同蛋白酶以E3培养液稀释。在蛋白酶溶液中的96hpf胚胎在37℃环境条件下孵育20分钟。(B)筛选可提高基因型鉴定敏感性和生存率的适当缓冲液；蛋白酶K的浓度为100μg/ml。96hpf的斑马鱼胚胎在37℃环境条件下以500rpm的转速摇动孵育20分钟。(C)和(D)和(E)分别为96hpf胚胎基因型鉴定所需的蛋白酶K浓度、处理时间以及旋转摇动速度的优化实验；(F)对不同发育时期胚胎进行基因型鉴定的效果的评价；A-F：每一种实验条件至少测试48枚胚胎。存活率是在7dpf时进行判断的。
图3示出的是高通量活体胚胎基因型鉴定的两步法策略。(A)用于活体胚胎第一轮基因型鉴定的代表型的PCR产物电泳结果图；当胚胎发育至2dpf(受精后2天)时，7枚野生型胚胎与1枚Tg(blf：RF2)胚胎被混成一组放入24孔培养板的一个孔中(含280μl DNA收集液)。共重复6组相同实验。每一组胚胎均放入37℃隔水式培养箱中，以500rpm孵育20分钟。取30μl DNA收集液作为基因组DNA模板，同时，向胚胎中加入800μl恢复液以终止酶反应。在PCR扩增目标基因组DNA片段时，胚胎被放置在28℃环境下生长。第一轮PCR产物电泳后，出现目标条带对应的那一组胚胎以E3培养液洗3次，然后将每个胚胎分别放置在96个孔板中，按标准操作过程进行活体胚胎的基因型鉴定过程。NC：阴性对照；PC：阳性对照。(B)用于基因型鉴定的第二轮PCR扩增产物的电泳结果图。经两天的恢复后，单个胚胎被按活体胚胎基因型鉴定的标准实验方案进行基因型鉴定。*指示Tg(blf：RP2)胚胎被成功鉴定出。(A)和(B)涉及的引物与PCR条件列于实施例中.(C)两轮法活体胚胎基因型鉴定涉及胚胎的基因型鉴定成功率(sensitivity)和胚胎发育至7天的成活率(survival)。
图4示出的是活体胚胎经基因型鉴定后正常发育和生长情况评价。(A)和(B)活体胚胎经基因型鉴定、恢复液处理生长至120hpf的行为学分析。(A)经基因型鉴定的发育至120hpf的活体胚胎与对照胚胎的游泳轨迹。颜色示意的是游泳轨迹，黑色示意速度小于或等于2.2mm/sec；绿色示意的游泳速度大于2.2mm/s但小于6.6mm/s；红色示意的游泳速度大于或等于6.6mm/s。(B)对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育至120hpf的累积运动距离的定量分析。在测试记录期间，基因型鉴定处理的胚胎与对照胚胎在运动距离上没有显著差异；同样地，累积的运动时间也是一样的(无显著差异)。n.s.无显著差异。(A)和(B)以ZebraBox(法国ViewPoint Behavior Technology公司产品)对每组12尾幼鱼的运动轨迹记录了1小时，然后用设备配置的斑马鱼轨迹分析软件进行了分析。(C)对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育至60dpf(受精后60天的活体青年鱼照片。侧面观，头部向左。(D)显示对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育与生长的Kaplan-Meier生存曲线。观测的样本总量分别为32尾对照及经基因型鉴定处理的胚胎的生存情况。(E)对照经基因型鉴定处理的胚胎的发育至性成熟后的生育能力及交配效率比较。16尾对照经基因型鉴定处理的胚胎的发育至性成熟后与同龄的野生型斑马鱼进行交配的交配效率(mating efficiency)和产卵量(受精卵量)(clutch size)之间无显著差异。
图5示出的是采集自活体胚胎的基因组DNA用作模板进行扩增后获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳结果的照片。所有电泳照片的第1泳道均为DNA标准，其它泳道为不同活体胚胎的基因组DNA片段扩增产物的电泳结果。(A)Ocean pout terminator基因片段的扩增结果：以pGBT-RP2.1.作为陷阱子进行基因陷阱(gene trapping)所获得的转基因鱼Gt(blf：RP2)用作实验对象，扩增引物设计在pGBT-RP2.1上，正向引物序列为ATCGTGGAACAGTACGAGCG，反向引物序列为TACACCAGACAGGTTTGGCTC。PCR的退火温度是63℃，34个循环。目标扩增子大小为1228bp。(B)mRFP基因片段的扩增结果：以转基因鱼Gt(blf：RP2)用作实验对象，扩增引物设计在mRFP的CDS上，正向引物序列为GTCCCCTCAGTTCCAGTACG，反向引物序列为TCAGTTAACGGTGGCTGAGAC。PCR的退火温度是66℃，33个循环。目标扩增子大小为534bp。(C)斑马鱼mvp基因扩增扩增结果：以野生型斑马鱼为实验对象，引物设计在mvp基因(GeneID：373081，Chr 3：15，722，418-15，723，110)上，正向引物序列为GGTATGTCTAACCTGACCTGTGTT，反向引物序列为CAGCCGCCTTTACTTTGATTTAC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为630bp。(D)mCherry基因扩增扩增结果：以Tg(UAS：nfsb-mCherry)转基因斑马鱼为实验对象，引物设计在mCherry基因的CDS上，正向引物序列为AGTTCATGTACGGCTCCAAGG，反向引物序列为GTTAGCTGGTACCCACTTCTC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为426bp。(E)drl.3基因扩增扩增结果：以野生型斑马鱼为实验对象，引物设计在drl.3基因(GeneID：555591，Chr 5：61，609，026-61，609，441)上，正向引物序列为GGACCGAGTATCAGTAGTATGCA，反向引物序列为CAGCCGCCTTTACTTTGATTTAC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为416bp。(F)E)drl-drl.3基因扩增扩增结果：以突变体斑马鱼为实验对象，引物设计在以CRISPR/Cas9技术删除包括drl、drll.1、drll.2、和drll.3等基因在内的49kbp的基因组片段上(涉及的GeneID为30167；555453；555524；555591，染色体的位置为Chr 5：61，602，035-61，652，332)上，正向引物序列为GAGTGGCGTTTTAACGGTTTG，反向引物序列为CCCAAAGAGCTGTGTCAAGAAAT。PCR的退火温度是67℃，34个循环。目标扩增子大小为485bp。(F)CreERT基因扩增扩增结果：以Tg(cmlc2：CreERT2)转基因斑马鱼为实验对象，引物设计在CreERT基因的CDS上，正向引物序列为CCCGCAGAACCTGAAGATGT，反向引物序列为CAGCGTTTTCGTTCTGCCAA。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为417bp。
具体实施方式
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明方法中涉及的试剂配方
E3培养液(60×)：含0.3M NaCl、10 mM KCl、20mM CaCl2·2H2O和24mM MgCl2·6H2O。分别称取34.8g NaCl、1.6g KCl、5.8g CaCl2.2H2O、9.78g MgCl2.6H2O溶于1.8L去离子水中。以NaOH将pH调节至7.2。加入去离子水至终体积2L。高压湿热灭菌后保存于室温中。准备1×E3培养液(工作浓度)，将16.5ml的60×储备液稀释至1L。
1.5M Tris-HCl(pH8.0)储备液：称取181.71g Tris溶解于800ml去离子水中，以浓盐酸将pH调节至8.0。使用去离子水将终体积加到1L。高压湿热灭菌，保存于室温中备用。
15mM三卡因储备液(25×)：称取400mg三卡因粉末(tricaine)溶于97.9ml去离子水中，加2.1ml1M Tris(pH 9)。调节pH至7.0左右。储存在4℃冰箱中。
蛋白酶K储备液(10mg/ml)：称取500mg蛋白酶K溶解于50ml去离子水中制作10mg/ml的储备液。以0.22μm滤膜滤过灭菌，然后分装于1.5ml塑料离心管中，储藏于-20℃(一年内有效)。
DNA收集缓冲液：量取10 ml配制的1.5M Tris-HCl储备液和20ml三卡因溶液放入400ml去离子水中，用盐酸调节pH至8.0。加去离子水使终体积为500ml。
DNA收集液：15μg/ml蛋白酶K(用于24hpf胚胎)；取1.5μl蛋白酶K储备液加入到1mlDNA收集缓冲液中。25μg/ml蛋白酶K(用于年龄大于24hpf的胚胎)；取2.5μl蛋白酶K储备液加入到1ml DNA收集缓冲液中。
恢复液：含0.5M NaCl、0.68M KCl、30mM CaCl2.2H2O和MgSO4.7H2O。依次称取29.4gNaCl、51.3g KCl、4.9g CaCl2.2H2O、和8.1g MgSO4.7H2O溶于800ml去离子水中，用NaOH调节pH至7.2。加入去离子水使终体积至1000ml。常规高压湿热灭菌获得100×储备液，保存在室温中。制备1×工作液时，取10ml储备液用去离子水稀释至1000ml。
裂解液：含10mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM KCl、0.3％Tween 20、0.3％NP40和1mMEDTA。分别准备1M Tris-HCl(pH8.0)、1M KCl、和0.5M EDTA的储备液。制备50ml裂解液时，依次在40ml去离子水中加入0.5ml的1M Tris-HCl(pH8.0)、2.5ml的1M KCl、100μl 0.5MEDTA、150μl Tween 20、和150μl NP40，最后加入去离子水使总体积至50ml。
本发明方法中涉及的部分耗材与设备
直径为90mm或30mm的细胞培养皿；96孔培养板；.2ml 8-联PCR管；移液枪；体式显微镜；微型培养板混匀仪；隔水式恒温培养箱。
斑马鱼胚胎的准备：在所有的实施例中，斑马鱼胚胎的收集均按常规在早上收集，收集到的受精卵经清洗后被分选放入培养皿中按常规进行饲养(溶液为E3培养液)，至待采集含核细胞时，再将常规的水溶液吸去，再加上各种DNA收集缓冲液或DNA收集液。
实施例1斑马鱼活体胚胎基因型鉴定的基本实验过程
按图1所描述的过程开展优选过程。首先收取特定发育时期的斑马鱼胚胎放入培养皿中，以DNA收集缓冲液清洗3遍，然后转移至30mm的培养皿中。实验时，将DNA收集缓冲液从培养皿中移除，然后加入DNA收集液(图1A)。
准备96孔培养板或24孔培养板。同时将200μl的枪头的尖端剪去，制作一个“宽嘴”枪头，使用该枪头将斑马鱼胚胎以及40μl DNA收集液转移至96-孔培养板的培养孔中，分组(pooled)胚胎则每组胚胎转移至24孔培养板中的培养孔中(图1A)。
将96-孔培养板或96-孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定环境温度的培养箱中，以指定转速摇晃混匀仪孵育胚胎，不同发育时期的胚胎在混匀仪上孵育的时间不同(图1A)。
孵育结束后，取出96孔板，使用枪头轻轻地混匀的DNA收集液10次，避免枪头吸到胚胎，必要时在体式显微镜下操作(图1A)。
将30μl上述DNA收集液转移至200μl的8-联PCR管中或96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在指定的条件下孵育指定时间以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来(图1A)。
在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待培养发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，然后计算胚胎成功率(Survival)(图1B)。
基因型鉴定：取5-8μl经裂解液处理的DNA收集液作为基因组DNA模板进行PCR扩增以实现基因型鉴定。PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物、1μl的10μM反向引物、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。按指定要求进行PCR扩增，扩增目标基因。扩增的PCR产物按常规方法进行琼脂糖凝胶电泳。根据电泳条带出现的情况，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)(图1C)。
实施例2用于活体胚胎基因型鉴定的蛋白酶的优选
为从活体胚胎分离中出含核的斑马鱼细胞，我们以E3培养液配制了分别含0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、0.1％蛋白酶(Pronase)、0.3％I型胶原蛋白酶(Collagenase Type I)和0.001％蛋白酶K(Pronase K)等4种不同的DNA收集液；待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的4种不同的DNA收集液，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中，每种DNA收集液共测试48个胚胎。接着，将装有胚胎的96孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定37℃的隔水式恒温培养箱中，以500rpm摇晃混匀仪孵育胚胎20分钟。
孵育完成后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来以用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现含0.001％蛋白酶K的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定成功率大于30％，效果最好(图2A)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现，经含0.25％胰蛋白酶(Trypsin)、0.3％I型胶原蛋白酶(Collagenase Type I)和0.001％蛋白酶K(Pronase K)等3种不同的DNA收集液处理的胚胎存活率均大于75％(图2A)。
实施例3可提高基因型鉴定敏感性和生存率的DNA收集液的优选
确定了优选的蛋白酶K后，我们对不同的胚胎收集液从活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果进行了比较。我们以常用的PBS、鱼类生理盐水、30mM Tris(pH8.0)和E3培养液分别配制了含100μg/ml蛋白酶K的DNA收集液。待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的4种不同的DNA收集液，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中，每种DNA收集液共测试48个胚胎。接着，将装有胚胎的96孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定37℃的隔水式恒温培养箱中，以500rpm摇晃混匀仪孵育胚胎20分钟。
孵育完成后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来以用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现以30mM Tris(pH8.0)配制的含100μg/ml蛋白酶K的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果最好，基因型鉴定成功率几乎达100％(图2B)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现以30mM Tris(pH8.0)配制的含0.001％蛋白酶K的DNA收集液处理的胚胎正常发育生长(存活)的比例大于90％(图2B)。
实施例4可提高基因型鉴定敏感性和生存率的DNA收集液所含蛋白酶K浓度的优选
确定了DNA收集缓冲液后，我们对含不同浓度蛋白酶K的胚胎收集液从活体胚胎中收集含核细胞用于基因型鉴定的效果进行了比较。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含1μg/ml、5μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和75μg/ml蛋白酶K的DNA收集液。待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的5种不同的DNA收集液，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中，每种DNA收集液共测试48个胚胎。接着，将装有胚胎的96孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定37℃的隔水式恒温培养箱中，以500rpm摇晃混匀仪孵育胚胎20分钟。
孵育完成后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现当蛋白酶K浓度为12.5μg/ml、25μg/ml和75μg/ml时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果最好，基因型鉴定成功率均100％(图2C)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现经蛋白酶K浓度为12.5μg/ml、25μg/ml和75μg/ml的DNA收集液处理的胚胎存活的比例均大于80％(图2C)。
实施例5可提高基因型鉴定敏感性和生存率的DNA收集液处理时间的优选
确定了DNA收集液后，我们对经DNA收集液以不同孵育时间处理活体胚胎获得的含核细胞用于基因型鉴定的效果进行了比较。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液。待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中，共测试5*48个胚胎。接着，将装有胚胎的96孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定37℃的隔水式恒温培养箱中，以500rpm摇晃混匀仪孵育胚胎5、10、15、20和30分钟(每个处理时间测试48个胚胎)。
完成相应的孵育时间后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现当处理时间(孵育时间)为15、20和30分钟时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果分别达到80％、90％和100％(图2D)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现除处理30分钟，胚胎正常存活比例为90％外，其余均为100％(图2D)。
实施例6可提高基因型鉴定敏感性和生存率的胚胎旋转摇动速度的优选
确定了DNA收集液和处理时间后，我们对经DNA收集液以不同旋转摇动速度处理活体胚胎获得的含核细胞用于基因型鉴定的效果进行了比较。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液。待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中，共测试5*48个胚胎。接着，将装有胚胎的96孔培养板固定在微型培养板混匀仪上，将混匀仪放入指定37℃的隔水式恒温培养箱中，以0、50、100、500和1000rpm分别摇晃孵育胚胎30分钟(每个旋转速度测试48个胚胎)。
完成相应的孵育后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×MasterMix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现当旋转速度为500和1000rpm时，相应的DNA收集液收集到的用作基因组DNA模板进行基因型鉴定效果均达到100％(图2E)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现当旋转速度为500和1000rpm时，胚胎正常存活比例为90％和60％(图2E)。
实施例7不同发育时期活体胚胎基因型鉴定的效果评价
确定了DNA收集液和处理时间以及旋转速度后，我们对从不同发育时期的活体胚胎中收集到的含核细胞用于基因型鉴定的效果。我们以30mM Tris(pH8.0)配制了含15或25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液。待受试的Gt(blf：RP2)转基因斑马鱼胚胎发育至24、48、72和96hpf时，将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液(24hpf胚胎用含15μg/ml蛋白酶K的DNA收集液；48-96hpf胚胎用含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液)，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中。接着，以500rpm分别摇晃孵育24hpf胚胎15分钟、48hpf胚胎20分钟和72-96hpf胚胎30分钟(每种发育时期测试48个胚胎)。
完成相应的孵育后，取出96孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×MasterMix、1μl的10μM正向引物(ATCGTGGAACAGTACGAGCG)、1μl的10μM反向引物(TACACCAGACAGGTTTGGCTC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，34×(95℃1min，63℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为1228bp)的扩增情况(图5A)，计算活体胚胎被成功进行基因型鉴定的效率(称作敏感性，即sensitivity)，结果发现每种发育时期胚胎的基因型鉴定效果均达到85％以上(图2F)。
此外，在取出30μl的DNA收集液用作基因型鉴定的同时，在含有斑马鱼胚胎的每个培养孔中分别加入100μl恢复液以终止酶解反应，然后将胚胎放置在28℃环境下按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现每种发育时期胚胎经处理后正常存活比例均在80％以上(图2F)。
实施例8高通量活体胚胎基因型鉴定的两步法策略
对于基因组改造效率极低的活体胚胎如果按前述方法逐一进行基因型鉴定前处理，将费时费力及费钱。为提高其检出效率，我们尝试建立了两步法策略。简单地说，当胚胎发育至2dpf(受精后2天)时，我们将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液(含15μg/ml蛋白酶K的DNA收集液)，然后用“宽嘴枪头”先后将总计7枚野生型胚胎与1枚Tg(blf：RF2)转基因鱼胚胎转移至24孔培养板的一个孔中(含280μl DNA收集缓冲液)。共重复6组相同实验。每一组胚胎均放入37℃隔水式恒温培养箱中，以500rpm孵育20分钟。
完成相应的孵育后，取出24孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀的DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×Master Mix、1μl的10μM正向引物(GTCCCCTCAGTTCCAGTACG)、1μl的10μM反向引物(TCAGTTAACGGTGGCTGAGAC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，33×(95℃1min，66℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为534bp)的扩增情况(图3A)。结果显示，源自每一组胚胎的基因组DNA模板扩增出目标基因片段的成功率为80％以上(图3C)。
在取出30μl DNA收集液作为基因组DNA模板的同时，向胚胎中加入800μl恢复液以终止酶反应，然后将胚胎按常规方法饲养。待胚胎发育至96hpf时，胚胎的正常存活率达90％以上(图3C)。将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液(含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液)，然后用“宽嘴枪头”将含单个胚胎的40μl DNA收集液转移至96孔培养板的单个培养孔中。接着，在37℃隔水式的培养箱中以500rpm分别摇晃孵育30分钟。
完成相应的孵育后，取出24孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。用于基因型鉴定的PCR反应(20μl)的组成为：10μl的2×MasterMix、1μl的10μM正向引物(GTCCCCTCAGTTCCAGTACG)、1μl的10μM反向引物(TCAGTT，AACGGTGGCTGAGAC)、2μl的基因组DNA模板、和6μl的超纯水。PCR扩增的反应条件为95℃2min，33×(95℃1min，66℃30sec，72℃1min)，72℃5min。扩增完成后，将PCR产物按常规方法电泳，拍照记录电泳结果，观测预期目标扩增子(大小为534bp)的扩增情况(图3B)。结果显示，源自每一组8枚胚胎的基因组DNA模板只有1枚活体胚胎的能扩增出目标基因片段(图3B)，对应于每组胚胎均只含有一枚目标转基因鱼活体胚胎，检出成功率为100％(图3C)。
在取出30μl DNA收集液作为基因组DNA模板的同时，向胚胎中加入100μl恢复液以终止酶反应，然后将胚胎按常规方法饲养。待胚胎发育至7dpf(受精后7天)时，计数正常胚胎数，结果发现经两步法处理后的胚胎正常存活比例在80％以上(图3C)。
实施例9活体胚胎经基因型鉴定后正常发育和生长至成体的情况评价
为全面评价经DNA收集处理的胚胎的正常发育情况，我们收集野生型斑马鱼受精卵为研究对象。待胚胎发育至2dpf(受精后2天)时，我们将饲养胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液(含15μg/ml蛋白酶K的DNA收集液)，然后用“宽嘴枪头”将单枚野生型胚胎转移至96孔培养板的一个孔中(含40μl DNA收集缓冲液)。每一组胚胎均放入37℃隔水式恒温培养箱中，以500rpm孵育20分钟。同时设未经任何处理的对照胚胎一组。待完成孵育后，向胚胎中加入100μl恢复液以终止酶反应，然后将胚胎按常规方法饲养。
待胚胎发育至120hpf，从对照组和实验组胚胎中各随机选取12枚胚胎进行行为学分析，以ZebraBox(法国ViewPoint Behavior Technology公司产品)对每尾幼鱼的运动轨迹记录了1小时，然后用设备配置的斑马鱼轨迹分析软件进行了分析。图4A显示的是经基因型鉴定处理的发育至120hpf的活体胚胎与对照胚胎的游泳轨迹。颜色示意的是游泳轨迹，黑色示意速度小于或等于2.2mm/sec；绿色示意的游泳速度大于2.2mm/s但小于6.6mm/s；红色示意的游泳速度大于或等于6.6mm/s。图4B显示的是对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育至120hpf的累积运动距离的定量分析。结果表明，在测试记录期间，基因型鉴定处理的胚胎与对照胚胎在运动距离上没有显著差异；同样地，累积的运动时间也是一样的(无显著差异)。进一步地，对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育至60dpf(受精后60天)的活体青年鱼亦无明显差异(图4C)。以Kaplan-Meier生存曲线描绘样本总量分别为32尾对照及经基因型鉴定处理的胚胎的生存情况，结果发现对照及经基因型鉴定处理的胚胎发育与生长也无显著差异(图4D)。对16尾对照及经基因型鉴定处理胚胎发育至性成熟后与同龄的野生型斑马鱼进行交配的交配效率(mating efficiency)和产卵量(受精卵量)(clutch size)进行观测，发现处理组与对照组之间无显著差异(图4E)。
实施例10多种基因型活体胚胎的基因型鉴定结果取例
为测试已建立的活体胚胎基因型鉴定方法的有效性，我们选择了多种不同基因组改造的斑马鱼胚胎作为测试对象。基本处理方法为：待胚胎发育至3dpf时，将目标鉴定胚胎的E3培养液更换成相应的DNA收集液(含25μg/ml蛋白酶K的DNA收集液)，然后用“宽嘴枪头”将单枚野生型胚胎转移至96孔培养板的一个孔中(含40μl DNA收集缓冲液)。每一组胚胎均放入37℃隔水式恒温培养箱中，以500rpm孵育30分钟。待完成孵育后，取出24孔板，在体式显微镜下使用枪头轻轻地混匀的DNA收集液10次(避免枪头吸到胚胎)。然后从单个培养孔中吸取30μl的DNA收集液转移至96孔PCR板的每个孔中，加入15μl的裂解缓冲液，在98℃的条件下孵育5min以灭活蛋白酶K并将基因组DNA从细胞核中释放出来用作PCR扩增的模板。同时，向胚胎中加入100μl恢复液以终止酶反应，然后将胚胎按常规方法饲养。
欲进行基因型鉴定的活体胚胎为源自mvp基因组编辑突变体初建者生产的F1代胚胎。目标基因组片段PCR引物设计在mvp基因(GeneID：373081，Chr 3：15，722，418-15，723，110)上，正向引物序列为GGTATGTCTAACCTGACCTGTGTT，反向引物序列为CAGCCGCCTTTACTTTGATTTAC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为630bp。PCR产物的电泳结果表明电泳条带小于630bp对应的活体胚胎是发生了mvp基因编辑(片段删除)的候选胚胎(图5B)。
欲进行基因型鉴定的活体胚胎为源自Tg(UAS：nfsb-mCherry)转基因斑马鱼初建者生产的F1代胚胎。目标基因组片段PCR引物设计在mCherry基因的CDS上，正向引物序列为AGTTCATGTACGGCTCCAAGG，反向引物序列为GTTAGCTGGTACCCACTTCTC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为426bp。PCR产物的电泳结果表明电泳条带为426bp对应的活体胚胎是种系遗传的Tg(UAS：nfsb-mCherry)转基因斑马鱼的候选胚胎(图5C)。
欲进行基因型鉴定的活体胚胎为野生型胚胎。目标基因组片段PCR引物设计在drl.3基因(GeneID：555591，Chr 5：61，609，026-61，609，441)上，正向引物序列为GGACCGAGTATCAGTAGTATGCA，反向引物序列为CAGCCGCCTTTACTTTGATTTAC。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为416bp。PCR产物的电泳结果表明电泳条带为416bp对应的活体胚胎是携带野生型drl.3基因的斑马鱼胚胎(图5D)。
欲进行基因型鉴定的活体胚胎为源自基因组编辑以删除drl-drl.3基因族的基因组编辑突变体初建者生产的F1代胚胎。目标基因组片段PCR引物设计在以CRISPR/Cas9技术删除包括drl、drll.1、drll.2、和drll.3等基因在内的49kbp的基因组片段上(涉及的GeneID为30167；555453；555524；555591，染色体的位置为Chr 5：61，602，035-61，652，332)上，正向引物序列为GAGTGGCGTTTTAACGGTTTG，反向引物序列为CCCAAAGAGCTGTGTCAAGAAAT。PCR的退火温度是67℃，34个循环。目标扩增子大小为485bp左右。PCR产物的电泳结果表明电泳条带为485bp左右对应的活体胚胎是携带了可种系遗传的drl-drl.3基因族删除的斑马鱼胚胎(图5E)。
欲进行基因型鉴定的活体胚胎为Tg(cmlc2：CreERT2)转基因斑马鱼后代。目标基因组片段PCR扩增引物设计在CreERT基因的CDS上，正向引物序列为CCCGCAGAACCTGAAGATGT，反向引物序列为CAGCGTTTTCGTTCTGCCAA。PCR的退火温度是58℃，33个循环。目标扩增子大小为417bp。PCR产物的电泳结果表明电泳条带为417bp左右对应的活体胚胎是携带了可种系遗传CreERT基因的斑马鱼胚胎(图5F)。
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