一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法
阅读说明：本技术 一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法 (CRISPR/Cas12a one-step nucleic acid detection method ) 是由 田亚晨 刘箐 刘程 刘涛 方水琴 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法,包括以下步骤：步骤1,选取待检测病菌的靶标序列,设计RPA上下游引物并进行特异性筛选后扩增靶标序列,得到引物扩增子序列,利用NCBI BLAST对引物扩增子序列进行特异性验证；步骤2,设计特异性的crRNA；步骤3,设计单链DNA报告分子；步骤4,将单链DNA报告分子、RPA上下游引物、冻干RPA反应颗粒、醋酸镁、RPA水化缓冲液、NEB buffer2.1、RNase Inhibitor与待测靶标进行混合,得到反应混合物；步骤5,构建包括反应物放置管以及注射器的一步检测试剂盒,将反应混合物置于反应物放置管底部,将crRNA与Cas12a蛋白预装到注射器；步骤6,在反应混合物反应后,推动注射器的活塞使得crRNA和Cas12a蛋白与反应混合物混合进行反应,再通过蓝光激发,得到检测结果。(The invention provides a CRISPR/Cas12a one-step nucleic acid detection method, which comprises the following steps: step 1, selecting a target sequence of pathogenic bacteria to be detected, designing an RPA upstream primer and a downstream primer, carrying out specificity screening, amplifying the target sequence to obtain a primer amplicon sequence, and carrying out specificity verification on the primer amplicon sequence by using NCBI BLAST; step 2, designing specific crRNA; step 3, designing a single-stranded DNA reporter molecule; step 4, mixing single-stranded DNA reporter molecules, RPA upstream and downstream primers, freeze-dried RPA reaction particles, magnesium acetate, RPA hydration buffer, NEB buffer2.1 and RNase Inhibitor with a target to be detected to obtain a reaction mixture; step 5, constructing a one-step detection kit comprising a reactant placing tube and a syringe, placing a reaction mixture at the bottom of the reactant placing tube, and pre-loading crRNA and Cas12a protein into the syringe; and step 6, after the reaction mixture reacts, pushing a piston of the injector to mix the crRNA and the Cas12a protein with the reaction mixture for reaction, and then exciting by blue light to obtain a detection result.)
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)是一类重要的食源性致病菌，可穿透肠道屏障、胎盘屏障和血脑屏障,死亡率20％～30％,严重危害人类安全及健康。单增李斯特菌的致病性与毒力因子密切相关，快速准确识别单增李斯特菌相关毒力基因可为研究其致病性提供重要的参考。
目前基因水平检测的主要方法为通过聚合酶链式反应实现靶基因的扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳实现可视化。定量PCR或者荧光实时PCR采用TaqMan探针，荧光染料，在仪器上进行实时检测。但是由于其依赖精密的温控设备，成本较高，检测步骤较复杂，结果无法满足现场检测的要求。特别地RPA，由于其灵敏度高、操作简便等特点，受到越来越多的关注。RPA是一种等温扩增方法，在恒温(37℃-48℃)下用热稳定的DNA聚合酶进行扩增，不需要复杂的仪器，能够实现即时检测。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)作为古菌和绝大多数细菌的获得性免疫系统，当病毒入侵时，细菌生成对应的能识别病毒基因组的crRNA，该crRNA引导具有核酸内切酶活性的Cas蛋白(CRISPR-associatedproteins)对病毒靶标序列进行特异性识别和切割。
2018年，基于Cas13a效应蛋白“附带切割”活性的发现，Jonathan S.Gootenbery等人开发了一种基于LwCas13a的检测平台SHERLOCK(Specific High-SensitivityEnzymatic Reporter Unlocking)实现了对Zika病毒、Dengue病毒和致病菌的检测。在SHERLOCK体系中，首先利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)对靶标进行扩增，将扩增后的产物添加到CRISPR/Cas13a体系后，crRNA会特异性识别靶标核酸序列从而激发Cas13a的附带切割功能，随即切割体系中的ssRNA-FQ产生可被检测的荧光信号。
同样具有“附带切割”活性的Ⅴ型的Cas12a也能够应用在核酸检测领域。Li等利用LbCas12a开发了HOLMES(an one-Hour Low-cost Multipurpose highly EfficientSystem)，HOLMES将CRISPR/Cas12a体系与PCR扩增技术进行结合，将扩增后的产物添加到CRISPR/Cas12a体系中，crRNA会特异性识别dsDNA扩增子，激发的Cas12a的附带切割功能，随即切割体系中的ssDNA-FQ产生可被检测的荧光信号(图2)。整个检测体系可在1h内完成对靶标DNA的检测，经过验证HOLMES可以检测aM的DNA病毒和RNA病毒并准确区分病毒的基因型和人的单核苷酸多态性SPN。2018年，Doudna团队将CRISPR/Cas12a体系与RPA恒温扩增技术进行结合，开发出了一种能够实现aM灵敏度的核酸检测技术DETECTR(DNAEndonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter)。利用这个检测体系可以在70min内实现对临床样本中的人乳头瘤病毒(HPV)进行检测，并准确判断感染的HPV的类型(HPV16和HPV18)。
以上基于CRISPR的检测技术通常分为两步，第一步扩增目的基因，第二步利用CRISPR检测目的基因。虽然该方法灵敏度高，但延长了检测时间，仍需要进行开盖操作，易造成气溶胶污染，产生假阳性，不利于实际应用。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法。
本发明提供了一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法，具有这样的特征，包括以下步骤：步骤1，选取待检测病菌的靶标序列，再设计合成用于扩增靶标序列的RPA上下游引物并进行特异性筛选，使用特异性筛选后的RPA上下游引物扩增靶标序列，得到引物扩增子序列，并利用NCBI BLAST对引物扩增子序列进行特异性验证；步骤2，根据靶标序列设计检测所需的特异性的crRNA；步骤3，设计用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测的单链DNA报告分子；步骤4，将单链DNA报告分子、RPA上下游引物、冻干RPA反应颗粒、醋酸镁、RPA水化缓冲液、NEB buffer2.1、RNase Inhibitor与待测靶标进行混合，得到反应混合物；步骤5，构建包括反应物放置管以及置于反应物放置管中的注射器的一步检测试剂盒，而后将反应混合物置于反应物放置管的底部，将crRNA与Cas12a蛋白混合后预装到注射器中；步骤6，在反应混合物进行反应后，推动注射器的活塞使得crRNA和Cas12a蛋白与反应混合物混合并进行反应，再通过蓝光激发，得到检测结果，其中，设计crRNA时，使crRNA对靶标序列与crRNA的互补链的切割位点位于引物扩增子序列上，再根据设计的crRNA的序列，直接进行化学合成或者构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化。
在本发明提供的一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤4中的待测靶标的具体提取过程包括如下子步骤：步骤4-1，取过夜培养的待检测病菌的菌液1mL，而后以8000r/min的速度离心5min后弃上清，得到菌体；步骤4-2，将菌体用500ul生理盐水洗涂二次，再用pH7.6的TE缓冲液重悬菌体，煮沸10min后立即在-20℃的温度下冷冻5min，再以12000r/min的速度离心5min后取上清液，该上清液作为待测靶标待用。
在本发明提供的一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法中，还可以具有这样的特征：其中，步骤6包括如下子步骤:步骤6-1，将反应混合物置于37℃恒温检测仪内进行实时信号监测，反应时间5-10min，得到反应后的反应混合物；步骤6-2，推动注射器的活塞将crRNA、Cas12a蛋白与反应后的反应混合物混合，在37℃的温度下继续反应40min，而后使用蓝光激发，通过肉眼观察即可得到检测结果。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法，具有快速、准确、便捷等优点，有利于在基层检验机构进行普及。并且相比于现有的基于CRISPR/Cas的核酸检测技术，本发明的反应时间缩短至30-50min，操作也更加简便；另外，本发明通过构建的一步检测试剂盒进行检测时，将RPA扩增与CRISPR检测相结合，一步完成操作，避免了开盖操作，不会形成气溶胶污染，更利于实际应用。
附图说明
图1是本发明的实施例中的CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法的流程示意图；
图2是本发明的实施例中采用不同RPA上下游引物进行扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3是本发明实施例中不同添加浓度的Cas12a/crRNA的荧光检测结果；
图4是本发明的实施例中不同Cas12a添加时间的荧光信号检测结果；
图5是本发明的实施例中通过一步检测试剂盒进行检测的示意图。
图6是本发明的实施例中检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度结果；
图7是本发明的实施例中的检测不同菌株的交叉反应结果；
图8是本发明的实施例中对20株李斯特菌株的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
<实施例>
本实施例中所使用试剂、仪器以及菌株如下：
主要试剂：LbCas12a广州博徕斯生物科技有限公司；XP Beckman Coulter；RPA扩增试剂盒潍坊安普未来生物科技有限公司；引物序列生工生物工程股份有限公司；HiScribe T7 Quick HighYield RNA Synthesis Kit New England Biolabs。
主要仪器：酶标仪SpectraMax M2购自Molecular Devices；Nanodrop 2000C购自Thermo Scientific；HiScribe T7 Quick HighYield RNA Synthesis KitNewEnglandBiolabs。
使用菌株如表1所示：
表1菌株名称与对应编号
图1是本发明的实施例中的CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法的流程示意图。
如图1所示，本实施例的一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法包括以下步骤：
本实施例中，选取单核增生李斯特菌Lm-EGD-e进行检测。
步骤1，在NCBI上下载Lm-EGD-e hly基因序列，利用Primer5.0设计RPA上下游引物并进行特异性筛选，使用特异性筛选后的RPA上下游引物扩增靶标序列，得到引物扩增子序列，并利用BLAST对引物扩增子序列进行特异性验证，在引物扩增子序列中寻找5’-TTTN-3’序列。
本实施例中可选用的RPA上下游引物如表2：
表2 RPA引物序列
对RPA上下游引物进行特异性筛选时，分别利用表1中的引物对靶标序列进行扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳结果进行筛选。
图2是本发明的实施例中采用不同RPA上下游引物进行扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
如图2所示，图中各标记代表的引物分别如下，M:Marker，1:RPA-158，2:RPA-264，3:RPA-261，4:RPA-291，根据琼脂糖凝胶电泳结果可知，RPA-264-F/R引物特异性及扩增效率最高，因此，本实施例中选用该引物进行扩增。
步骤2，根据靶标序列设计检测所需的特异性的crRNA，本实施例中，利用CRISPR-DT设计选取crRNA序列，使crRNA对靶标序列与crRNA的互补链的切割位点位于引物扩增子序列上，合成crRNA的具体过程如下:利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGG)+LbCas12a的scaffold序列(aatttctactaagtgtagat)+靶点序列(靶标DNAPAM序列后的20-23bp)构成crRNA-F，反向互补为crRNA-R，其中，T7启动子使得退火得到的双链可被T7 RNA聚合酶识别并进行转录，scaffold序列可与LbCas12a结合。合成crRNA-F/R两条寡核苷酸链如表3所示，退火后得到DNA双链，再进行体外转录获得检测所需的crRNA。
表3 crRNA模板引物序列
步骤3，设计用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测的单链DNA报告分子，本实施例中，单链DNA报告分子采用两端分别带有FAM和BHQ1基团的5碱基随机单链DNA分子，本实施例中选用的单链DNA报告分子如下表4所示。
表4单链DNA报告分子序列
步骤4，将单链DNA报告分子、RPA上下游引物、冻干RPA反应颗粒、醋酸镁、RPA水化缓冲液与待测靶标进行混合，得到反应混合物。
步骤4中的待测靶标的具体提取过程包括如下子步骤：
步骤4-1，取过夜培养的待检测病菌的菌液1mL，而后以8000r/min的速度离心5min后弃上清，得到菌体；
步骤4-2，将菌体用500ul生理盐水洗涂二次，再用pH7.6的TE缓冲液重悬菌体，煮沸10min后立即在-20℃的温度下冷冻5min，再以12000r/min的速度离心5min后取上清液，该上清液作为待测靶标待用。
步骤5，构建包括反应物放置管以及置于反应物放置管中的注射器的一步检测试剂盒，而后将反应混合物置于反应物放置管的底部，将crRNA与Cas12a蛋白混合后预装到注射器中。
本实施例中，还通过调节Cas12a/crRNA的浓度，来保证体系中酶活性能得到最大释放，具体过程如下：将不同浓度的Cas12a和crRNA分别与反应混合物进行混合并置于37℃恒温检测仪内进行实时信号监测，反应时间60min，每秒采集一次荧光信号，进行检测结果判读，根据检测结果得到最适混合浓度的Cas12a/crRNA来混合预装到注射器中，图3是本发明实施例中不同添加浓度的Cas12a和crRNA的荧光检测结果。
如图3所示，图中(a)为Cas12a在不同添加浓度下荧光检测结果，如结果所示，当待测靶标加入量为1nM，Cas12a添加浓度为60nM时能够得到最高的荧光检测值，图中(b)为crRNA在不同添加浓度下的荧光检测结果，如结果所示，当待测靶标加入量为1nM，crRNA添加浓度为120nM时均能够得到最高的荧光检测值，因此本发明根据待测靶标浓度，当待测靶标加入量为1nM时，将Cas12a的添加浓度为60nM、crRNA的添加浓度为120nM作为最适混合浓度。
本实施例中，将2ul的待测靶标直接与crRNA、Cas12a、单链DNA报告分子、RPA上下游引物、冻干RPA反应颗粒、醋酸镁、RPA水化缓冲液、NEB buffer2.1、RNase Inhibitor进行混合得到混合液，并将混合液置于37℃恒温孵育并进行荧光检测，各组分配比如表5，表5混合液组分
根据荧光检测结果，将Cas12a直接添加到反应体系中时，荧光信号值较低，可能是因为Cas12a/crRNA对靶标的剪切导致了初始模板降低，因此需要对Cas12a添加时间进行优化，图4是本发明实施例中不同Cas12a添加时间的荧光信号检测结果。
如图4所示，在先使反应混合物反应5-10min后再加入Cas12a均能得到较高的荧光信号值，因此本发明先使反应混合物反应5-10min后再加入crRNA、Cas12a蛋白进行反应。
步骤6，在反应混合物进行反应后，推动注射器的活塞使得crRNA和Cas12蛋白与反应混合物混合并进行反应，再通过蓝光激发，得到检测结果。
图5是本发明的实施例中通过一步检测试剂盒进行检测的示意图。
如图5所示，步骤6包括如下子步骤:
步骤6-1，将反应混合物置于37℃恒温检测仪内进行实时信号监测，反应时间5-10min，得到反应后的反应混合物；
步骤6-2，推动注射器的活塞将crRNA、Cas12a蛋白与反应后的反应混合物混合，在37℃的温度下继续反应40min，而后使用蓝光激发，通过肉眼观察即可得到检测结果。
本实施例中，还对本发明的检测灵敏度进行测试，具体过程如下：
挑Lm-EGD-e单菌落于培养基中，置于37℃摇床培养12h，平板菌落计数算得纯菌液浓度为5.1×109cfu/mL，将培养好的菌液用生理盐水依次稀释至108、106、104、102、101、100CFU/mL，然后每个浓度的菌液均依照步骤4提取待测靶标，进行测试时每个浓度下取2ul待测靶标添加到检测体系中，使用水阴性对照，并重复三次。
图6是本发明的实施例中检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度结果。
如图6所示，加入浓度为109、107、105、102、101、100CFU/mL的待测靶标，荧光信号明显高于阴性对照组，滴加100CFU/mL待测靶标的荧光信号与阴性对照差异不明显，说明CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法灵敏度达101CFU/mL，三次重复结果均为101CFU/mL，云因此检测灵敏度高、稳定性较好，且最低检测浓度为101CFU/mL。
本实施例中，还对本发明的检测特异性进行测试，具体过程如下：
用预混好的用于检测单核增生李斯特菌的CRISPR/Cas12a来检测15株非单增李斯特菌株培养至106CFU/mL的细菌并观察结果。
图7是本发明的实施例中的检测不同菌株的交叉反应结果。
如图7所示，各标号代表的细菌分别如下：1：单核增生李斯特菌EGD-e，2：阪崎肠杆菌ATCC 29004，3.福氏志贺氏菌ATCC 12022，4：鲍氏志贺氏菌ATCC 9207，5：宋内氏志贺氏菌CMCC 51592，6：鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028，7：肠炎沙门氏菌ATCC13076，8：猪霍乱沙门氏菌CMCC50018，9：甲型副伤寒沙门氏菌CMCC50093，10：乙型副伤寒沙门氏菌CMCC50004，11：丙型副伤寒沙门氏菌CMCC50118，12：金黄色葡萄球菌ATCC 27660，13：阪崎肠杆菌ATCC29004，14：福氏志贺氏菌ATCC12022，15：鲍氏志贺氏菌ATCC9207，16：宋内氏志贺氏菌CMCC51592，
由检测结果可知，本发明的CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法能够专一检测单核增生李斯特菌，特异性较好。
本实施例中，对表1中1-20号的20株李斯特菌株进行检测，并利用核酸检测金标准qPCR进行对比验证。
图8是本发明的实施例中对20株李斯特菌株的检测结果。
如图8所示，左侧为qPCR结果，右侧为本发明的检测结果，图中检测的20株菌株对应如下：A格从左至右分别为：格氏李斯特菌CICC21670，绵羊李斯特菌CICC21663，格氏李斯特Lgr0001，威尔斯李斯特菌CICC21672，英诺克李斯特菌CICC10297，
B格从左至右分别为：单核增生李斯特菌AB2483，单核增生李斯特菌Lm-F204，单核增生李斯特CMCC54003，单核增生李斯特菌CMCC54007，单核增生李斯特NCTC5348，
C格从左至右分别为：单核增生李斯特菌ATCC19112，单核增生李斯特菌ATCC19115，单核增生李斯特菌ATCC19116，单核增生李斯特菌ATCC19117，单核增生李斯特菌ATCC19118，
D格从左至右分别为：单核增生李斯特菌EGD-e，单核增生李斯特菌BAA751，单核增生李斯特菌10403S，单核增生李斯特菌ScottA，单核增生李斯特菌F2365，
由检测结果可知，本发明的检测结果与qPCR结果完全一致，本发明能够快速准确的完成检测。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的一种CRISPR/Cas12a一步核酸检测方法，具有快速、准确、便捷等优点，有利于在基层检验机构进行普及。并且相比于现有的基于CRISPR/Cas的核酸检测技术，本实施例的反应时间缩短至30-50min，操作也更加简便；另外，本实施例通过构建的一步检测试剂盒进行检测时，将RPA扩增与CRISPR检测相结合，一步完成操作，避免了开盖操作，不会形成气溶胶污染，更利于实际应用。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。