血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法
阅读说明：本技术 血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法 (Non-diagnostic fluorescent quantitative detection method for circular circZKSCAN1 gene in serum ) 是由 梁浩凡 缪辉来 程海兵 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法,通过荧光定量反应PCR检测正常肝脏血清和肝癌患者血清,结果显示,肝癌患者血清Exosome中的环状circZKSCAN1基因表达量明显较高。本发明提供的检测方法能够有效检测肝癌患者血清中Exosome的表达,对于肝癌的检出率达到95％以上,达到肝癌早期诊断的目的,填补目前在肝癌早期诊断领域的市场空白,为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。(The invention provides a non-diagnostic fluorescent quantitative detection method of a circular circZKSCAN1 gene in serum, which detects normal liver serum and liver cancer patient serum through fluorescent quantitative reaction PCR, and the result shows that the circular circZKSCAN1 gene expression in liver cancer patient serum Exosome is obviously higher. The detection method provided by the invention can effectively detect the expression of Exosome in serum of a liver cancer patient, the detection rate of liver cancer reaches more than 95%, the aim of early diagnosis of liver cancer is fulfilled, the market blank in the field of early diagnosis of liver cancer at present is filled, and an ideal gene detection method is provided for early clinical diagnosis of liver cancer.)
技术领域
本发明涉及肝癌早期诊断技术领域，具体涉及血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法。
背景技术
生物体内的环状RNA(circRNA)是一类具有特殊未知功能的RNA，而且是客观大量存在的。环状RNA由前体RNA通过剪切，然后由线性RNA的头对尾连接形成，以前的研究由于技术水平的限制，把这部分客观存在的RNA忽略了，随着深度RNA测序及规模化生物信息技术的发展，研究者才真正发现在生物体内大量存在环化的RNA分子，环化RNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定。对于环化RNA的具体功能尚未有明确，目前只有几种假定的说法1)环状RNA可以作为“sponge”海绵吸miRNA，抑制其功能；2)circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平；3)circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性；4)circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成。
而Exosomes起源于内吞的小膜性囊泡，可以被许多类型的细胞均有分泌，它与circRNA都是近年的研究热点。研究发现，在肝癌病人血清中的exosomes内含有大量circRNA，而且非常的稳定。在肝癌高发的地区或国家，如果能做到早期诊断，早期治疗，则将会对肿瘤预防和治疗带来非常深远的意义。
有鉴于此，确有必要提供一种解决上述问题的技术方案。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法，填补目前在肝癌早期诊断领域的市场空白。本发明提供试剂盒的检测方法，可以有效监测患者血清中exosomes的表达，达到肝癌早期诊断的目的。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法，包括以下步骤：
1)提取Exosome：提取血清中的Exosome，具体操作如下：
(a)将1mL血清置于1.5mL离心管中，2000g离心20min，去除较大的细胞碎片，取上清液；
(b)每1mL步骤(a)中的上清液加入5X PEG-8000NaCl溶液250μL；每20～30min混合一次，进行3-5次，4℃放置8～24h以使Exosome充分沉降；
(c)待沉降后，4℃下，10000g离心30min，弃去上清液；
(d)4℃下，10000g离心5min，弃去残余液体；
(e)得到沉淀Exosome；
2)提取RNA：提取步骤1)得到的Exosome中的RNA；
3)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在步骤2)提取的RNA中加入反应液，经过消化、灭活后除去残留的基因组DNA；
4)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入步骤3)中的RNA作为模板，采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
5)采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏血清和肝癌患者血清Exosome中环状circZKSCAN1基因进行检测；具体的检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物:5'TACCGCCCCGATAGTGGAGA 3'
下游引物：5'TGAAGTGGGACTGGGTGGC 3'；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行分析。
优选的，5X PEG-8000NaCl溶液的制备方法：称取NaCl 8.766g、PEG800050g溶解在200mL Milli-Q纯水中；121℃下湿热灭绝30min；得到5X PEG-8000NaCl溶液，保存在4℃中。
优选的，步骤2)：提取步骤1)得到的Exosome中的RNA，具体操作如下：
(a)按1mL血清中提取的Exosome加入1mL Trizol；
(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
(c)4℃下，12000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(e)4℃下，12000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(f)加入1mL 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，弃去上清；
(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。
优选的，步骤3)：在步骤2)提取的RNA中加入反应液，于37℃消化30min，之后加入0.5μL EDTA，65℃灭活10min除去残留的基因组DNA。
优选的，步骤4)：在PCR管中加入步骤3)中的RNA作为模板，采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
逆转录的PCR体系为：
RNase free ddH2O up to 1补足至10μL；
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明通过荧光定量反应PCR检测正常肝脏血清和肝癌患者血清，结果显示，肝癌患者血清Exosome中的环状circZKSCAN1基因表达量明显较高，本发明提供的检测方法能够有效检测肝癌患者血清中Exosome的表达，对于肝癌的检出率达到95％以上，达到肝癌早期诊断的目的，填补目前在肝癌早期诊断领域的市场空白，为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
附图说明
图1为本发明实施例1血清Exosome中circZKSCAN1环状RNA的荧光定量检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式和说明书附图，对本发明及其有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明中，提取RNA所用的试剂盒为Life technologies公司生产的Reagent试剂盒；除去提取的RNA中残留的基因组DNA所用的DNaseI试剂为全式金公司生产；逆转录试剂盒为Vazyme公司所生产的试剂盒；荧光定量反应试剂盒为Vazyme公司生产的Real-time PCR试剂盒。
实施例1
一种血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法，包括以下步骤：
1)提取Exosome：提取血清中的Exosome，具体操作如下：
(a)将1mL血清置于1.5mL离心管中，2000g离心20min，去除较大的细胞碎片，取上清液；
(b)每1mL步骤(a)中的上清液加入5X PEG-8000NaCl溶液250μL；每20～30min混合一次，进行3-5次，4℃放置8～24h以使Exosome充分沉降；
(c)待沉降后，4℃下，10000g离心30min，弃去上清液；
(d)4℃下，10000g离心5min，弃去残余液体；
(e)得到沉淀Exosome；
其中，5X PEG-8000NaCl溶液的制备方法：称取NaCl 8.766g、PEG800050g溶解在200mL Milli-Q纯水中；121℃下湿热灭绝30min；得到5X PEG-8000NaCl溶液，保存在4℃中；
2)提取RNA：提取步骤1)得到的Exosome中的RNA，具体操作如下：
(a)按1mL血清中提取的Exosome加入1mL Trizol；
(b)加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置15min；
(c)4℃下，12000g离心15min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；
(d)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(e)4℃下，12000g离心10min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；
(f)加入1mL 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12000g离心5min，弃去上清；
(g)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀；
3)除去提取的RNA中残留的基因组DNA：在步骤2)提取的RNA中加入反应液，于37℃消化30min，之后加入0.5μL EDTA，65℃灭活10min除去残留的基因组DNA；
其中反应液的配置为：使用RNase-free的DNaseI(全式金公司)，按照说明书配置反应液如下：
4)将RNA逆转录成cDNA：在PCR管中加入步骤3)中的RNA作为模板，采用随机逆转录引物，在PCR体系中逆转录成cDNA；
逆转录的PCR体系为：
RNase free ddH2O up to 1补足至10μL；
反应条件为：25℃5min，42℃20min，85℃5min，4℃2min；
5)采用荧光定量反应Real-time PCR试剂盒，配置反应体系，对正常肝脏血清和肝癌患者血清Exosome中环状circZKSCAN1基因进行检测；具体的检测反应体系如下：
其中，上下游引物分别为：
上游引物:5'TACCGCCCCGATAGTGGAGA 3'
下游引物：5'TGAAGTGGGACTGGGTGGC 3'；
荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环，并在温度60℃-95℃收集荧光信号然后进行融解曲线分析。
正常肝脏血清和肝癌患者血清Exosome中环状circZKSCAN1基因的检测结果见图1。图1中表明，相对于正常健康人(N组)，在肝癌患者血清exosome中(T组)环状circZKSCAN1表达量明显较高。本发明的检测结果为200例临床肝癌病例及正常健康人的对照结果，对于肝癌的检出率达到95％以上，达到肝癌早期诊断的目的，填补目前在肝癌早期诊断领域的市场空白，为肝癌的早期临床诊断提供一种理想的基因检测方法。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州吉赛生物科技有效公司
<120> 血清中环状circZKSCAN1基因的非诊断性荧光定量检测方法
<130> 2020
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artificaial
<400> 1
TACCGCCCCGATAGTGGAGA 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> artificaial
<400> 2
TGAAGTGGGACTGGGTGGC 19