一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用 (Kit for detecting pseudomonas cocoi based on digital PCR technology and application thereof ) 是由 杨佳怡 高运华 王志栋 吴枭 于 2021-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种用于PCR检测椰毒假单胞菌的引物和探针组合,其上游引物序列为：TTGTCTGGCGGTAGAAACC,下游引物序列为：下游引物：CGAGTCAACTGACCCGAAC,探针序列为：TCGATCCCGTCTGCCTCCACCAATCT。还包括上述引物和探针组合的检测试剂盒。本发明提供的优化设计的引物探针更适用于椰毒假单胞菌的定量检测,且同时适用于荧光定量PCR的检测体系,两种方法表现出良好的线性相关性,引物探针的优化设计扩展了该试剂盒的应用范围,方便检测者根据具体的实验条件进行应用。(The invention discloses a primer and probe combination for PCR detection of pseudomonas cocoanut, wherein the upstream primer sequence is as follows: TTGTCTGGCGGTAGAAACC, the sequence of the downstream primer is: a downstream primer: CGAGTCAACTGACCCGAAC, the probe sequence is: TCGATCCCGTCTGCCTCCACCAATCT are provided. Also comprises a detection kit combining the primer and the probe. The primer probe with optimized design provided by the invention is more suitable for quantitative detection of pseudomonas cocoanut and is also suitable for a fluorescent quantitative PCR detection system, the two methods show good linear correlation, the application range of the kit is expanded by the optimized design of the primer probe, and a detector can conveniently apply the primer probe according to specific experimental conditions.)
技术领域
本发明属于基因工程领域和食品检测领域，具体涉及一种基于数字PCR技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用。
背景技术
椰毒假单胞菌属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧，易在食品表面生长，容易污染谷类发酵制品(发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、发酵糯小米等)，薯类制品(马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)及变质银耳和木耳等。椰毒假单胞菌引起的食物中毒具有极高的致死率，对健康造成严重威胁。由该菌引发食物中毒的致死率高达 40％～100％。目前主要采用初期催吐、导泻以及后期血浆置换的方法对中毒患者进行治疗，尚无特效治疗手段或药物。椰毒假单胞菌的适宜生长温度为37℃，适宜产毒温度为26℃，其中毒事件多发在夏、秋两季，我国高发地区包括广西、云南、贵州等。2020年曾发生酸汤子中毒事件，经采玉米面样检测后发现高浓度米酵菌酸，初步定性为椰毒假单胞菌污染引起的食物中毒。
椰毒假单胞菌毒性作用主要由于其所产生的两种毒素：米酵菌酸和毒黄素，二者均为脂肪酸类小分子物质，研究者开发了基于液相色谱以及色谱质谱联用技术的方法对米酵菌酸和毒黄素进行检测，但这些方法需要使用较为昂贵的仪器，同时检测操作的难度较大，不利于进行快速的现场检测。针对椰毒假单胞菌的检测也被更多的关注，经典的平板培养法虽然操作简单，但耗时加长且误差范围较大。GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》是椰毒假单胞菌检测的主要依据，但细菌平板培养的方法耗时较长，存在多种影响因素，不利于突发情况下的快速检测。近年来，基于PCR扩增技术的检测方法也收到了越来越多的关注，研究者通过环介导等温扩增(LAMP)和荧光定量PCR 方法对椰毒假单胞菌的核酸进行检测，提高了检测的效率。然而现有核酸检测方法的定量结果均依赖于标准曲线，准确性有待提高(马晓燕,张蕴哲,王羽,刘哲, 王晓丽,张伟.环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究[J].食品工业科技,2013,34(03):321-324；林捷,方陈玉,陆晶芳,尹丹韩,赵奇琦,王加胜.食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光PCR检测的研究[J].食品安全质量检测学报,2020,11(11):3538-3544)。荧光定量PCR的原理是测量PCR扩增过程中积累的荧光信号，在进行定量检测的过程中依赖于标准曲线。总体来说，现有针对椰毒假单胞菌的核酸检测方法存在明显的局限性：1.以“半定量”分析为主，无法做到不依赖于外标的“绝对定量”；2.缺乏检测过程的质量控制。这些问题都可能影响检测的准确性。为了提高针对椰毒假单胞菌检测结果的可靠性，亟需开发可进行“绝对定量”的检测方法，添加合适的阳性与阴性对照，进而形成完整的检测试剂盒，便于检测研究人员的使用。尚无基于数字PCR技术对椰毒假单胞菌进行检测的研究报道，现有方法检测的准确性有待进一步提高。
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