具体实施方式

文中所提到的EG017为一种新的非甾体类的SARM，化学式为 C₂₅H₁₇F₃N4O4，中文化学名(S)-1-((4-氰基-3-(三氟甲基)苯基)氨基)-3-(4-氰基苯氧基)-2-甲基-1-氧代丙-2-基烟酸酯。所述EG017制备方法和结构式参考专利号为CN201410033958.0的专利文件记载的内容。

EG-017作用机理

初步研究表明，新冠病毒是通过ACE2靶点对人体造成损害的；ACE2存在于鼻子、口腔和肺部的上皮以及人体大部分主要组织器官中，是新冠病毒感染人体的入口；新冠病毒初步引起肺部感染，造成肺部上皮以及内皮组织严重损伤后，通过血液扩散引起心脏以及其它重要其管病变；ACE2含有雄激素受体， SARMs的作用靶点为雄激素受体，利用大剂量补充外源性雄激素受体调节剂 SARMs，可以迅速激活含有ACE2的肺部器官的正常生物学功能，调节肺部免疫系统，避免因新冠病毒造成的免疫风暴对肺部造成的损伤；同时，外源性sarms 还可以与病毒竞争性的与相关细胞的ACE2结合(从而降低病毒对细胞的侵入几率，减少病毒对机体的侵害)，这样就可以间接地增强机体对病毒的耐受力，同时还可以从机体与病毒的抗争中促进机体快速恢复健康。

1)利用大量外源性非甾体雄激素受体调节剂调节肺部巨噬细胞(含有雄激素受体)的活性，增强肺部组织对病毒的清除能力；2)利用外源性非甾体雄激素调节剂与体内ACE2(含有雄激素受体)进行结合，改变ACE2活性和空间结构，阻断病毒与ACE2的结合点位，从而降低病毒通过ACE2通道对人体进行伤害；3)利用外源性雄激素受体调节剂，调节机体细胞核活性，增强机体对抗病毒的自体能力的同时，增强机体的自我修复能力。

具体的，有研究表明人体内具有一种特定蛋白质，所述蛋白质使病毒能够感染人体细胞。这种蛋白质被称为血管紧张素转化酶2，或ACE2为"受体"，其为冠状病毒进入和感染各种人类细胞提供了切入点。ACE2存在于许多细胞类型和组织，包括肺、心脏、血管、肾脏、肝脏和胃肠道。它存在于上皮细胞中，该细胞与某些组织线，并形成保护屏障，肺和血管之间的氧气和二氧化碳交换发生在肺的上皮衬里上。ACE2存在于鼻子、口腔和肺部的上皮中。在肺部，ACE2在2型肺炎细胞上非常丰富，肺细胞是一种重要的细胞类型，存在于肺肺脏的腔室中，其中氧气被吸收，废二氧化碳被释放。

ACE酶将血管紧张素I转化为血管紧张素II。ACE2的主要作用是将血管紧张素II分解成分子，以抵消血管紧张素II的有害影响；也就是说ACE2有助于调节一种称为血管紧张素II(ANG II)的蛋白质的许多活动，这种蛋白质可增加血压和炎症，增加对血管衬里的损伤和各种类型的组织损伤。ACE2将 ANG II转换为其他分子，以抵消ANG II的影响。

同时，有研究表明与COVID-19关系最大的是，ANG II可增加炎症和阿尔维奥利细胞的死亡，这对将氧气引入体内至关重要，综上，ANG II的这些有害影响通过ACE2减少。

体外细胞实验结果显示，经外源转入雄激素受体的HEK293上EG02， EG017，最高剂量的功效(Efficacy Max Dose)均在70％以上；在内源表达雄激素受体的人前列腺癌细胞LNCaP上，EG02以及EG017展现了很好的组织选择性，最高剂量功效(Efficacy Max Dose)EG02为66.7％；而EG017为47.2％。以上结果说明EG017和EG02均具有组织选择性，体现了很好选择性雄激素受体的调节作用，尤其以EG017效果更为显著。

人体代谢研究表明，EG-017在体内可以代谢为EG-2，在体内达到最大浓度的时间分别为1.5-3hrs和6-7hrs。

为了验证EG-017治疗新冠病毒引起的肺部等器官的病变，以下结合具体的实施例进行说明验证EG-017的有益效果。

受试化合物和对照化合物

(1)受试化合物

名称：EG-017

来源：药源药物化学(上海)有限公司

批号：R191095

配制方法：用100％DMSO配制成120mM的母液

(2)受试化合物2

名称：rapamycin

来源：MedChemExpress

批号：61925

配制方法：用100％DMSO配制成40mM的母液

(3)对照化合物1

名称：Remdesivir，瑞德西韦

来源：MedChemExpress

批号：CS-0028115

配制方法：用100％DMSO配制成10mM的母液

(4)对照化合物2

名称：Lopinavir，洛匹那韦

来源：Selleckchem

批号：S138003

配制方法：用100％DMSO配制成10mM的母液

(5)对照化合物3

名称：Chloroquine diphosphate salt，Chloroquine，氯喹二磷酸盐，磷酸氯喹

来源：Sigma-Aldrich

批号：109M4003V

配制方法：用100％DMSO配制成30mM的母液

病毒株

新型冠状病毒βCoV/KOR/KCDC03/2020株由韩国疾控中心(Korea Centers forDisease Control and Prevention，KCDC)提供，序列号NCCP43326。

细胞

非洲绿猴肾(Vero)细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，货号 CCL-81。细胞于添加了10％胎牛血清(Gibco)和1％双抗(Gibco)的Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM，WelGene)中培养。添加了2％胎牛血清(Gibco) 和1％双抗(Gibco)的DMEM培养液用作实验培养液。

主要仪器、及试剂

(1)主要仪器：本项目所用主要仪器为高内涵成像分析仪(PerkinElmer，型号Operetta)，自动分液器(ThermoFisher，型号Multidrop Combi)，洗板机(BioTek，型号ELx406)和液体工作站(CyBio，型号CyBi-HummingWell)。

(2)主要试剂：本项目所用主要试剂包括新型冠状病毒N蛋白一抗Human SARS-CoV-2N protein antibody(北京义翘神州科技股份有限公司，货号 40143-T62)，AlexaFluor 488标记羊抗兔IgG二抗(Molecular probe，货号MOP-A-11034)，细胞核染色液Hoechst 33342(Molecular Probes，货号MOP-H-3570)。

试验方法

本研究应用IFA实验评价受试化合物对新冠病毒βCoV/KOR/KCDC03/2020株在Vero细胞中的体外抗病毒活性。受试化合物EG-017和rapamycin除了测试各自单独处理时的抗病毒活性，还测试了在100μM rapamycin存在的条件下和EG-017的联合抗病毒活性。瑞德西韦，洛匹那韦和磷酸氯喹用作阳性对照化合物。受试化合物和对照化合物测试10个浓度点。测试浓度见表1。

表1.受试化合物和对照化合物测试浓度

以上不同浓度下化合物的平均抗病毒抑制率和平均细胞活率见下表：

细胞铺板

Vero细胞经胰酶消化后，用实验培养液稀释到每ml 480,000个细胞。使用自动分液器将稀释后的细胞加入到384孔细胞测试板中，每孔25μl，12,000个细胞。细胞于5％CO₂、37℃培养箱中培养过夜。

化合物处理和病毒感染

化合物使用DMSO进行稀释，然后使用液体工作站将稀释的化合物加入测试细胞孔中。然后每孔加入25μl实验培养液稀释后SARS-CoV-2病毒，MOI＝0.0125。设置细胞对照(细胞，无化合物处理或病毒感染)和无化合物处理对照(细胞感染病毒，无化合物处理，加入0.5％DMSO)。每孔细胞培养液终体积为50μl。细胞于5％CO₂、37℃培养箱中继续培养24小时。

免疫荧光染色

(1)病毒感染24小时后，每孔加入17μl 16％多聚甲醛。然后于室温放置30分钟；

(2)吸去上清，使用DPBS洗板二次；

(3)每孔加入25μl 0.25％TritonX-100，室温放置20分钟；

(4)吸去0.25％TritonX-100，使用DPBS洗板二次；

(5)每孔加入25μl稀释后的一抗(1:3000倍稀释)，37℃孵育1个小时；

(6)吸去一抗，使用DPBS洗板二次；

(7)每孔加入25μl稀释后的二抗Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG(1:2000倍稀释)和2.5μg/ml(1:4000倍稀释)的Hoechst 33342，37℃孵育1个小时；

(8)吸去二抗和Hoechst，使用DPBS洗板二次；

(9)使用高内涵成像分析仪Operetta读板，仪器设定：488/405emission,20倍物镜，每个孔5个视野。

数据分析

使用Columbus软件定量分析高内涵成像分析仪读板所得的图片中的细胞总数(Hoechst染色细胞数量)和新型冠状病毒感染细胞数(Alexa Fluor 488标记的细胞数量)。感染细胞比例和细胞总数数据用于化合物抗病毒活性和细胞毒性分析。

计算公式如下：

抑制率(％)＝100-(测试孔感染细胞比例-细胞对照孔平均感染细胞比例)/(无化合物处理对照孔平均感染细胞比例-细胞对照孔平均感染细胞比例)x 100

细胞活率(％)＝测试孔细胞总数/无化合物处理对照孔平均细胞总数x 100

使用XLfit 4软件对化合物的抑制活率和细胞活率进行非线性拟合分析并计算出化合物的IC₅₀和CC₅₀值，拟合方法为"Sigmoidal dose-response"。IC₅₀和CC₅₀的计算公式为：Y＝Bottom+(Top Bottom)/(1+(IC₅₀/X)Hillslope)。其中，IC₅₀表示50％抑制浓度。

结果与结论

受试化合物和对照化合物单药测试体外抑制新型冠状病毒复制活性结果见表2。实验进行了1次。

结果显示对照化合物磷酸氯喹，洛匹那韦和瑞德西韦均显示出抗新型冠状病毒活性，IC₅₀值分别为4.3μM，14.1μM和5.82μM，与文献报道数据一致(Sangeun J.,et al.2020)。三个对照化合物在测试浓度内均没有显示出明显的细胞毒性， CC₅₀值大于最高测试浓度，见表2。

受试化合物EG-017和rapamycin对新型冠状病毒βCoV/KOR/KCDC03/2020 株在Vero细胞内的复制有明显抑制活性，其IC50值分别17.09μM和9.34μM。受试化合物EG-017在Vero细胞上没有显示出明显的细胞毒性，其CC50值大于最高测试浓度，>300μM。rapamycin显示出明显的细胞毒性，CC50值为29.5μM。

在100μM rapamycin存在的条件下和EG-017的联合抗病毒活性测试，因Rapamycin在100μM浓度下有明显细胞毒性(表7)而无法区分联合用药对病毒的抑制活性；但联合用药的结果表明，EG-017在300μM-11.11μM的浓度下可以抑制Rapamycin对细胞的毒性；两者联合对抗病毒的药效需要降低Rapamycin测试浓度进行进一步评估。

表2.受试化合物和对照化合物抗新型冠状病毒活性

以下采用MTT法进一步的验证EG-017及其代谢物修复阿霉素对心肌细胞造成的细胞毒性

实验对象：H9C2大鼠心肌细胞

实验方法：MTT法

实验原理：

MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜 (Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在550nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验。

实验步骤

1、不同浓度的EG-017的细胞毒性

(1)收集对数期H9C2细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁴个/mL，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，前一天下午铺板，次日上午加药。EG-017设0、1、10、50、 100和500uM六个梯度，每孔100ul，设4～6个复孔。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、二甲基亚砜)。

(3)5％CO₂，37℃孵育24小时，倒置显微镜下观察。

(4)每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，5％CO₂，37℃培养箱继续培养4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液。

(6)每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。

其实验结果如图1所示，其中，A：利用MTT法检测EG-017作用浓度为 1、10、50、100、500M细胞存活情况。*P<0.05与对照组比较；**P<0.01与对照组比较；***P<0.001与对照组比较；****P<0.0001与对照组比较。结果表明A.EG-017在浓度为100、500M时能够显著促进心肌细胞的增殖。

2、不同浓度EG-017诱导细胞损伤

(1)收集对数期H9C2细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁴个/mL，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至5000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充。

(2)5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，前一天下午铺板，次日上午加药。EG-017设0、1、10、50、 100和500uM六个梯度，每孔100ul，设4～6个复孔。预处理2小时后换同时加DOX(1uM)的培养基继续培养，同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

(3)5％CO₂，37℃孵育48小时，倒置显微镜下观察。

(4)每孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，5％CO₂，37℃培养箱继续培养4h。

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液。

(6)每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值。

其结果如图2所示，其中A：利用MTT法检测在阿霉素为1M条件下EG-017 作用浓度为1、10、50、100、500M细胞存活情况。*P<0.05与对照组C比较； **P<0.01与对照组C比较；***P<0.001与对照组C比较；****P<0.0001与对照组C比较。#P<0.05与对照组D比较；##P<0.01与对照组D比较；###P<0.001 与对照组D比较；####P<0.0001与对照组D比较。图中C:control；D:control +DOX(1M)。

结果表明A.EG-017在浓度为100、500M时能够显著提高DOX处理下心肌细胞的存活率。

为更进一步验证EG-017在制备抗新冠病毒药物中的有效性，以下通过 EG-017对TGF-β1诱导A549肺癌细胞纤维化过程的影响进行实验的验证。

实验对象：A549肺癌细胞细胞

实验方法：WB法

实验原理：

Western blot即蛋白质印迹法，是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某种特定抗原的一种蛋白质检测技术，通过分析获得特定蛋白质的条带着色的位置和着色深度从而得知其在细胞或组织中的表达情况。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β1)是肝纤维化最关键的细胞因子。利用TGF-β1体外诱导A549肺癌细胞纤维化，纤维化的肺癌细胞中波形蛋白(Vim)显著表达，而钙粘附蛋白E(E-Cad)表达明显降低。利用WB技术检测Vim与E-Cad的蛋白表达水平，验证A549细胞纤维化水平。

实验步骤

Western blot检测不同浓度EG-017对细胞中Vim与E-Cad蛋白表达的影响，

1、蛋白样品制备

(1)培养A549细胞至对数期，消化后铺六孔板。设置空白对照组及给药组。24h后，待细胞单层均匀贴满板底80％左右时，加入含TGF-β1的浓度为20ng/ml的培养基各2ml，培养基血清浓度为2％，48h后加入吸弃原来培养基，加入含不同浓度EG-017的培养基，加入后置于培养箱中48h。

(2)细胞总蛋白提取：48h后，拿出六孔板，吸掉培养基，用PBS洗2 遍，加入胰酶将细胞消化下来，收集细胞离心后弃去上清，PBS洗两次，然后加入配置好的RIPA裂解液，来回摇动或用枪吹打数次，使裂解液与细胞充分接触,于冰上裂解30min，每隔5min震荡一下。裂解完成后，将EP管置于低温离心机下12000rpm离心5min，无色透明上清液即为细胞的总蛋白。将离心后的上清用BCA蛋白定量法确定其浓度，将稀释好的蛋白样品与5×SDS loadingbuffer按4：1比例加入，再沸水中煮5min使蛋白质完全变性，-70℃保存待用。

2、SDS-PAGE电泳分离蛋白

按照制胶试剂盒的说明书和目的蛋白分子量的大小制备分离胶和浓缩胶，将提取好的各个蛋白用移液枪加入到加样孔中，每个样品加10μL，蛋白marker 加3μL，组装电泳仪，然后调电泳仪到80V，样品条带跑到压缩胶与分离胶界限附近时将电泳仪调至120V继续跑胶，快至底部1cm时停止跑胶。电泳结束后，根据marker指示切出所需要的条带。

3、转膜

(1)制备足够的转移缓冲液(100mL的10×转膜液+200mL甲醇+700mL 超纯水)备用。

(2)电泳结束后，拿出玻璃板，用镊子轻轻撬开玻璃板。用转膜液浸湿后根据蛋白marker的位置将目的条带切下来做好标记放入转膜液中。将凝胶转移到转移缓冲液中。剪出与切好的胶大小一致的PVDF膜，并在甲醇中浸泡5min 激活,然后放入转移缓冲液中平衡2min备用。

(3)制作三明治结构：在电转液中，将夹子打开，水平放置，在黑夹子上垫一层海绵，并用玻璃棒滚动驱赶气泡；然后放上厚滤纸，固定后用玻璃棒赶走气泡，之后放上凝胶，再将PVDF膜盖在凝胶上，向上依次三层滤纸以及海绵，最后将白夹子合上夹紧。

(4)将夹子放入转移槽中，胶在负极，膜在正极。

(5)转膜条件：恒流200mA，100min，电转时会产热，要放在冰浴中转膜。

4、免疫反应

(1)牛奶封闭：转膜结束后将PVDF膜拿出放到含有5mLTBST配制的 5％的脱脂牛奶的孵育盒中于摇床上，室温下封闭4h。

(2)一抗孵育：用1×TBST以1：1000稀释GAPDH、Vim以及E-Cad 抗体，封闭结束后倒掉封闭液，加入配好的一抗稀释液，使一抗稀释液没过PVDF 膜，4℃过夜，次日取出，用1×TBST漂洗3次，每次15min。

(3)二抗孵育：用1×TBST以1：10000稀释二抗，过夜后回收一抗稀释液，加入二抗稀释液置于摇床上，室温孵育2h，之后用TBST漂洗3次，每次15min。

5、ECL发光检测

(1)将发光试剂盒中的A液和B液两种试剂在离心管中等体积混合。

(2)将PVDF膜放在样品盘上，再将混合的发光液均匀滴在PVDF膜上。

(3)置于仪器中，操作仪器使其曝光。

不同浓度的EG-017对A549细胞中Vim蛋白表达的影响结果如图3所示，其利用WB法检测EG-017作用浓度为0.4、2、10M处理细胞48h后细胞中 Vim蛋白的表达情况，结果表明，处理细胞48h，EG-017抑制Vim蛋白的表达。不同浓度EG-017对TGF-β1诱导的肝星型细胞增殖的影响的结果如图4所示，其利用WB法检测EG-017作用浓度为50、100、200处理细胞48h后细胞中 E-cad蛋白的表达情况。结果表明EG-017促进E-cad蛋白的表达。

最终以上实验表明，EG-017能够抑制TGF-β1诱导的A549细胞纤维化，并呈现一定的剂量依赖性。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。