一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位及制备方法
阅读说明：本技术 一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位及制备方法 (Effective part of berberis capitata for treating dysfunctional uterine bleeding and preparation method ) 是由 杨竹雅 丁雄 刘录 马晓霞 王晓珍 王钺涵 谭文红 周志宏 于 2020-12-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,涉及一种中药提取物,具体涉及一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位及制备方法。本方案的药物是由头顶一颗珠药材经提取加工制成的甾体皂苷有效部位,甾体皂苷有效部位包括三种以一定比例组成的甾体皂苷。本方案的药物可通过口服发挥其止血、缩宫作用,达到治疗功能失调性子宫出血目的,毒副作用少,具有良好的开发应用价值。(The invention belongs to the technical field of medicines, relates to a traditional Chinese medicine extract, and particularly relates to an effective part of Aconitum capitatum for treating dysfunctional uterine bleeding and a preparation method thereof. The medicine of the scheme is a steroid saponin effective part prepared by extracting and processing a medicinal material of berberis kunmingensis, and the steroid saponin effective part comprises three steroid saponins formed according to a certain proportion. The medicine of the scheme can play the roles of stopping bleeding and contracting uterus through oral administration, achieves the aim of treating dysfunctional uterine bleeding, has little toxic and side effects and has good development and application values.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种中药提取物，具体涉及一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位及制备方法。
背景技术
功能失调性子宫出血简称功血，是指由神经内分泌失调引起，而不是由妊娠、子宫内膜肿瘤、感染或血液病等全身或女性生殖道器质性疾病引起。常发生于青春期或围绝经期，多为无排卵型功能失调性子宫出血，是妇科常见疾病。功能失调性子宫出血可有各种不同临床表现，主要表现为月经周期频率、规律性、经期长度、经期出血量的异常，常并发贫血、感染等。目前临床上主要通过服用复方孕二烯酮等激素药物进行止血治疗，严重者进行刮宫、子宫切除等手术治疗。理想的治疗功能失调性子宫出血得药物可通过控制治疗临床症状、调节子宫功能并在不长期服用激素类药物情况下达到治疗目的，上述功能的药物依然是该领域重要的药物研究开发方向。有鉴于功能失调性子宫出血的危害和对相关药物的开发的需求，亟需开发出一种高效以及副作用小的治疗功能失调性子宫出血的特效药。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位，用以解决现有技术中缺少高效以及副作用小的治疗功能失调性子宫出血的特效药的技术问题。本方案以云南产头顶一颗珠药材为原料，制备了一种治疗功能性子宫出血的甾体皂苷有效部位，进一步提升了头顶一颗珠药材对于功能性子宫出血的治疗效果。本甾体皂苷有效部位可通过口服或者注射达到止血、缩宫、抗炎作用，对功能性子宫出血具有良好的治疗作用。
本发明技术方案如下：
一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位，包括从头顶一颗珠药材提取获得的甾体皂苷有效部位；所述甾体皂苷有效部位包括偏诺皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3--α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷。
本技术方案的原理为：头顶一颗珠，又名芋儿七、狮儿七、头顶珠，为延龄草(Trillium tschonoskii Maxim)干燥的根茎，分布于我国西藏、云南、贵州、四川、湖南、湖北等地，具有镇静安神、活血止血、解毒等功效，主治高血压、神经衰弱、眩晕头痛、跌打损伤、外伤出血等。头顶一颗珠的主要功效成分为甾体皂苷，其中甾体皂苷包括以偏诺皂苷元和薯蓣皂苷元连接不同糖基链构成不同的成分，种类繁多。目前尚不清楚这些甾体皂苷中哪些是主要的功效成分，限制了对头顶一颗珠药材的进一步开发。
头顶一颗珠药材通常被用作止血凝血药物来使用，而这种药材尚未被应用到功能失调性子宫出血的治疗中。治疗功能失调性子宫出血不但需要药物具有止血功能以缓解临床症状，更需要其能够调节子宫功能(例如子宫收缩功能)以及人体激素水平。发明人首次将头顶一颗珠药材应用于功能失调性子宫出血的治疗中，该药材显示出了良好的止血和促进宫缩的效果。
如何利用头顶一颗珠药材，获得具有更好的功能性子宫出血得治疗和预防功效的精深加工产品，仍然是本领域亟待解决的问题。为了增加头顶一颗珠药材的治疗效果，发明人对头顶一颗珠的功效成分进行了大量研究，发现从头顶一颗珠中提取的含有三种甾体皂苷的提取物(甾体皂苷)具有良好的治疗功能失调性子宫出血的效果。
本方案的有益效果在于：
(1)本方案的甾体皂苷有效部位提取自头顶一颗珠药材，天然来源的偏诺皂苷具有良好的止血、抗炎作用，毒副作用小。
(2)本方案的甾体皂苷有效部位具有止血、缩宫、抗炎作用，对功能失调性子宫出血具有良好的治疗作用。
(3)本方案的甾体皂苷有效部位经口给药毒性小、安全性高。小鼠一日给药剂量为1mg/kg时，未见动物发生明显毒性反应。对小鼠进行连续14天给药实验，未见一般状况、肝肾功能及主要脏器系数发生与给药相关的毒性变化。
综上所述，本方案提供一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位，其制备工艺简便、药物用药剂量小，毒副作用少，廉价经济，具有良好的开发应用价值。
进一步，偏诺皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3--α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷的质量比为70～80；10～20；5～10。
采用上述技术方案，发明人通过对不同云南产的头顶一颗珠药材的大量研究，发现采用本方案的提取方法获得的甾体皂苷有效部位中，三种甾体皂苷的比例为70～80；10～20；5～10。并且，发明人通过实验验证，上述比例的三种甾体皂苷形成的混合物具有良好的止血凝血的效果，并且对功能失调性子宫出血具有良好的治疗效果。
进一步，所述甾体皂苷有效部位的剂量为一日三次，每次30mg，所述甾体皂苷有效部位的剂型为药学上可以接受的任何剂型。
采用上述技术方案，本方案的甾体皂苷有效部位可通过口服或者注射等多种方式达到止血、缩宫、抗炎作用，对功能性子宫出血具有良好的治疗作用。
进一步，一种治疗功能失调性子宫出血的头顶一颗珠有效部位的制备方法，头顶一颗珠药材依次经过醇浸提、石油醚萃取、大孔树脂纯化和醇沉步骤，获得甾体皂苷有效部位。
采用上述技术方案，首先使用醇作为溶剂对头顶一颗珠药材进行浸泡提取，使得药材中大量的甾体皂苷从药材中浸出；然后使用石油醚萃取的手段除去部分非极性杂质；通过大孔树脂吸附以及梯度洗脱的方法，将目的成分进一步分离富集；最后通过醇溶和沉淀的方式进一步除去杂质，纯化甾体皂苷有效部位。经过本方案提取获得的甾体皂苷有效部位中含有三种功效成分，即偏诺皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷和偏诺皂苷元-3--α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷。这三种功效成分联合作用，对凝血、促进子宫收缩和治疗功能失调性子宫出血有着显著疗效。
进一步，在所述醇浸提步骤中，将头顶一颗珠药材粉碎后获得粗粉，使用乙醇对所述粗粉进行冷浸提取，获得提取液；浓缩所述提取液获得浸膏Ⅰ。
采用上述技术方案，通过乙醇冷浸提取，可将头顶一颗珠药材中的甾体皂苷充分提取，为后面的分离、富集和纯化创造先决条件。
进一步，在所述醇浸提步骤中，使用乙醇对所述粗粉进行冷浸提取三次。
采用上述技术方案，多次浸提，将药材中的功效成分充分提取。
进一步，在所述石油醚萃取步骤中，将所述浸膏Ⅰ分散于水中，获得浸膏分散液；使用石油醚萃取所述浸膏分散液并取水层。
采用上述技术方案，使用石油醚萃取，除去浸膏分散液中的非极性成分，使得水层中的目的功效成分得以富集。
进一步，在所述大孔树脂纯化步骤中，使用大孔吸附树脂吸附所述水层，再使用乙醇和水进行梯度洗脱，收集乙醇和水的体积比为70:30时的洗脱液，浓缩所述洗脱液获得浸膏Ⅱ。
采用上述技术方案，使用大孔树脂吸附和梯度洗脱的方式，可在使用体积分数为70％的乙醇水溶液洗脱时，获得含有目的成分的洗脱液。根据后续功效实验研究，这一部分的洗脱液具有非常显著的促进凝血的效果，而使用其他比例的洗脱剂获得的洗脱液的促进凝血功效不佳。这说明了本方案的提取和纯化方式有效地获得了具有较强药效的甾体皂苷有效部位，对提升头顶一颗珠药材对于功能性子宫出血的治疗效果起到了促进作用。
进一步，在所述大孔树脂纯化步骤中，使用乙醇和水进行梯度洗脱时，乙醇的体积百分数由0增加至90％。
采用上述技术方案，通过梯度洗脱使得杂质逐步分离，而目的功效成分得到富集和纯化。通过本方案的大孔树脂吸附和梯度洗脱的方法，可以获得含有三种偏诺皂苷元糖苷的甾体皂苷有效部位，而该甾体皂苷有效部位具有优良的止血、缩宫和抗炎的效果，对功能性子宫出血具有良好的治疗作用。
进一步，在所述醇沉步骤中，将浸膏Ⅱ在加热的条件下溶解于乙醇溶液中，冷却后过滤取沉淀，沉淀经干燥处理后获得所述甾体皂苷有效部位。
采用上述技术方案，通过乙醇的加热溶解和降温沉淀的过程，可溶于乙醇的杂质被除去，甾体皂苷有效部位得到了进一步的纯化。
具体实施方式
实施例1
取头顶一颗珠药材50kg，粉碎成粗粉，分别用10倍量乙醇(粗粉：乙醇-1kg：10L)冷浸提取三次(48h、24h、24h)，合并提取液，减压浓缩得浸膏Ⅰ(8.55kg)(相对密度控制在1.25-1.30，本实施例中相对密度具体为1.26)；将浸膏Ⅰ用5倍量水(浸膏Ⅰ：水＝1kg：5L，即43L)搅拌溶解，获得浸膏分散液。再用与浸膏分散液等体积石油醚萃取3次，水层经大孔吸附树脂吸附(D101)，以乙醇和水(0：100～70：30)梯度洗脱，先用水洗脱130L，再分别用不同浓度乙醇(10％、30％、50％、70％、90％)洗脱，每个浓度洗脱130L，收集70％乙醇洗脱部分，获得含有目的成分的洗脱液，洗脱液经过减压浓缩得浸膏Ⅱ(4.8kg)(相对密度控制在1.25-1.30，本实施例中相对密度具体为1.28)。在浸膏Ⅱ中加5倍量的体积百分数为30％乙醇加热溶解(浸膏Ⅱ：30％乙醇＝1kg：5L)，放置24h，过滤，所得沉淀70℃干燥，得类白色粉末(2.6kg)，即得甾体皂苷有效部位。
通过核磁共振(NMR)和质谱检测(MS)，甾体皂苷有效部位的化学成分鉴定为：偏诺皂苷元-3-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-β-D-葡萄糖苷(化合物A)、偏诺皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(化合物B)和偏诺皂苷元-3--α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-O-α-L-吡喃鼠李糖基-[O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-O-β-D-葡萄糖苷(化合物C)。另外，甾体皂苷有效部位经HPLC分析，化合物A、化合物B和化合物C的质量比为76:16:8。
波谱数据具体如下：
化合物A：白色针晶。ESI-MS m/z：737[M-H]-，提示相对分子量为738。结合碳谱确定分子式为C39H62O13。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ：0.67(3H，d，J＝5.8Hz，H-27)，0.93(3H，s，H-18)，1.08(3H，s，H-19)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-21)，5.26(1H，brd，J＝5.0Hz，H-6)，1.76(3H，d，J＝6.2Hz，2'-O-Rha-H-6)，4.98(1H，brd，Glc-H-1)，6.37(1H，brd，2'-O-Rha-H-1)。
化合物B：白色针晶。ESI-MS m/z：883[M-H]-，提示相对分子量为884。结合碳谱确定分子式为C45H72O17。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ：0.67(3H，d，J＝5.3Hz，H-27)，0.95(3H，s，H-18)，1.07(3H，s，H-19)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-21)，5.28(1H，brd，J＝4.2Hz，H-6)，1.75(3H，d，J＝6.1Hz，2'-O-Rha-H-6)，1.62(3H，d，J＝6.1Hz，4'-O-Rha-H-6)，4.82(1H，brd，Glc-H-1)，5.85(1H，brd，2'-O-Rha-H-1)，6.39(1H，brd，4'-O-Rha-H-1)。
化合物C：白色针晶。ESI-MS m/z：1030，结合碳谱确定分子式为C51H82O21。1H-NMR(C5D5N，500MHz)δ：0.68(3H，d，J＝5.4Hz，H-27)，0.95(3H，s，H-18)，1.07(3H，s，H-19)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz，H-21)，5.29(1H，brd，J＝3.8Hz，H-6)，1.58(3H，d，J＝5.6Hz，4”-O-Rha-H-6)1.75(3H，d，J＝6.2Hz，2'-O-Rha-H-6)，1.61(3H，d，J＝6.5Hz，4'-O-Rha-H-6)，4.84(1H，brd，Glc-H-1)，5.82(1H，brd，2'-O-Rha-H-1)，6.38(1H，brd，4'-O-Rha-H-1)，7.05(1H，brd，4”-O-Rha-H-1)。
实施例2
采用实施例1的方法，对18个批次的头顶一颗珠药材进行了甾体皂苷有效部位的提取，并通过HPLC检测，不同批次的甾体皂苷有效部位中化学成分组成(质量)比例详见表1所示。
表1：实施例2的甾体皂苷有效部位制备和测试结果
序号
药材产地
批号
投料量(kg)
成分组成比例(A:B:C)
1
云南华坪
Y1701
20
76:16:8
2
云南华坪
Y1701
20
74:17:9
3
云南华坪
Y1801
20
78:15:7
4
云南华坪
Y1801
20
76:16:8
5
云南华坪
Y1802
15
72:19:9
6
云南华坪
Y1802
15
73:17:10
7
贵州凤冈
G1703
25
79:16:5
8
贵州凤冈
G1703
25
78:16:6
9
贵州凤冈
G1704
20
75:15:10
10
贵州凤冈
G1704
20
75:16:9
11
贵州凤冈
G1803
20
74:18:8
12
贵州凤冈
G1803
20
75:16:9
13
湖南恩施
H1705
30
70:20:10
14
湖南恩施
H1705
30
71:19:10
15
湖南恩施
H1804
20
75:17:8
16
湖南恩施
H1804
20
76:17:7
17
湖南恩施
H1805
20
80:10:10
18
湖南恩施
H1805
20
79:11:10
从以上表中结果可以看出，各化合物比例范围为是化合物A：70％～80％；化合物B：10％～20％；化合物C：5％-10％。
实施例3
取实施例1中所得甾体皂苷有效部位粉碎成细粉，称取300g，加入淀粉700g，混匀，填装胶囊10000粒，每粒100mg，其中含甾体皂苷有效部位30mg。功能性子宫出血患者口服，一日三次，每次1粒。
实验例1：甾体皂苷有效部位止血作用
1、样品
阳性对照组：宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，规格0.13g/每粒，产品批号ZMA1402)，用蒸馏水配制成3.38mg/ml，每日剂量0.3ml。浓度的混悬液；
样品高剂量组：取实施例1中所制备的样品加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
样品低剂量组：取实施例1中所制备的样品加水制成0.39mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
正常组：生理盐水
对照组1：取实施例1中水洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
对照组2：取实施例1中10％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
对照组3：取实施例1中30％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
对照组4：取实施例1中50％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml；
对照组5：取实施例1中90％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.78mg/ml的混悬液，每日剂量0.3ml。
2、实验动物
健康昆明种小鼠，体重19-23g。购至昆明医科大学实验动物中心。
3、试验方法及操作
按参考文献“妇科止血合剂治疗功能性子宫出血止血作用的实验研究”(许海：湖北中医学院硕士研究生论文，参见论文第9-10页，出、凝血时间实验)上的方法及操作进行试验。通过本实验测试药物对凝血的促进作用。
4、试验结果
实验结果如表2所示，结果表明，阳性对照组、样品低剂量组、样品高剂量组与正常对照组比较，出血、凝血时间明显缩短；而样品高剂量组、样品低剂量组与阳性对照组比较，出血、凝血时间明显缩短，其中高剂量组作用最好；其他洗脱段基本无作用。说明通过本法案的制备方法可以获取头顶一颗珠中具有最佳生物学功效的部分(甾体皂苷功效部位)。
表2：甾体皂苷有效部位对小鼠出、凝血时间的影响
组别
样本数(N)
出血时间(min)
凝血时间(min)
正常组
10
20.37±0.39
4.87±0.65
阳性对照组
10
16.76±0.52Δ
3.55±0.34Δ
样品低剂量组
10
14.37±0.74Δ*
3.07±0.45Δ*
样品高剂量组
10
12.15±0.68Δ*
2.46±0.28Δ*
对照组1
10
19.88±0.34
4.62±0.69
对照组2
10
20.71±0.36
4.91±0.52
对照组3
10
20.03±0.45
4.78±0.48
对照组4
10
20.61±0.42
4.82±0.58
对照组5
10
19.92±0.48
4.93±0.80
Δ与正常组比较P<0.05；*与对照组比较P<0.05
实验例2：甾体皂苷有效部位对子宫收缩作用
1、样品
阳性对照组：宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，规格0.13g/每粒，产品批号ZMA1402)，用蒸馏水配制成0.273mg/ml浓度的混悬液。家兔每日灌胃记录为100ml。
样品高剂量组：取实施例1中所制备样品加水制成0.021mg/ml，每日灌胃剂量为100ml；
样品低剂量组：取实施例1中所制备样品加水制成0.0105mg/ml，每日灌胃剂量为100ml；
正常组：生理盐水；
对照组1：取实施例1中水洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.021mg/ml的混悬液，每日剂量100ml；
对照组2：取实施例1中10％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.021mg/ml的混悬液，每日剂量100ml；
对照组3：取实施例1中30％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.021mg/ml的混悬液，每日剂量100ml；
对照组4：取实施例1中50％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.021mg/ml的混悬液，每日剂量100ml；
对照组5：取实施例1中90％乙醇洗脱液浓缩物(按照实施例1的方法制备成浸膏)，加水制成0.021mg/ml的混悬液，每日剂量100ml。
2、实验动物
健康未孕健康家兔，体重约1400-1600g。购至昆明医科大学实验动物中心。
3、试验方法及操作
按参考文献“妇科止血合剂治疗功能性子宫出血止血作用的实验研究”(许海：湖北中医学院硕士研究生论文，13-14页，子宫悬吊实验)上的方法及操作进行试验。通过本实验验证了药物对促进子宫收缩的作用。
4、试验结果
实验结果参见表3，结果表明，阳性对照组、样品组与正常对照组比较，对子宫均有显著收缩作用；而样品组与阳性对照组比较，对子宫收缩作用更显著；其他洗脱段基本无作用。
表3：甾体皂苷有效部位对家兔子宫收缩的影响
组别
样本数(N)
频率(次/min)
幅度(mm)
活动力
正常组
10
6.00±1.10
2.84±1.14
12.42±7.62
阳性对照组
10
7.33±1.75*
3.92±0.66
28.96±9.10**
样品低剂量组
10
9.67±2.25**
3.93±0.61
33.25±9.80**
样品高剂量组
10
10.50±2.07**
5.46±0.62**
46.55±9.99**
对照组1
10
5.88±1.25
2.97±1.05
11.68±5.87
对照组2
10
6.40±1.30
2.80±1.08
12.29±6.36
对照组3
10
5.93±1.22
2.75±1.26
12.06±7.45
对照组4
10
6.12±1.01
2.71±1.20
12.39±8.04
对照组5
10
6.39±1.04
2.95±1.28
12.90±7.78
*与正常组比较P<0.05；**与正常组比较P<0.01
实验例3：甾体皂苷有效部位安全性试验
取实施例1中甾体皂苷有效部位，用水混悬，ICR小鼠每天1次以1mg/kg/day剂量连续14天灌胃给予样品，未见一般状况、肝肾功能及主要脏器系数发生与给药相关的毒性变化。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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