一种来源于紫苏籽粕的ace抑制肽及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种来源于紫苏籽粕的ace抑制肽及其制备方法与应用 (ACE inhibitory peptide derived from perilla seed meal as well as preparation method and application thereof ) 是由 洪晶 陈雪芹 叶淑芳 陈彦彬 于 2021-07-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用。所述ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Gly-Ala-Tyr。通过体外ACE抑制活性测定发现,该紫苏籽粕ACE抑制肽的IC-(50)为0.861 mg/mL,其浓度为0.05 mg/mL时,能有效提高人脐静脉内皮细胞NO的释放量,并且对人脐静脉内皮细胞无毒副作用。本发明提供的紫苏籽粕ACE抑制肽具有结构简单、安全、活性强的特点,且易于进行生产,有望为制备高血压预防药物提供有效成分,或作为功能食品添加剂供高血压患者食用。(The invention discloses ACE inhibitory peptide derived from perilla seed meal and a preparation method and application thereof. Ammonia of the ACE inhibitory peptideThe sequence of the gene is Val-Gly-Ala-Tyr. The in vitro ACE inhibitory activity determination finds that the purple perilla seed meal ACE inhibitory peptide IC 50 Is 0.861 mg/mL, and when the concentration is 0.05 mg/mL, the release amount of human umbilical vein endothelial cells NO can be effectively improved, and the pharmaceutical composition has NO toxic or side effect on the human umbilical vein endothelial cells. The perilla seed meal ACE inhibitory peptide provided by the invention has the characteristics of simple structure, safety and strong activity, is easy to produce, and is expected to provide effective components for preparing hypertension prevention medicines or be used as a functional food additive for being eaten by hypertension patients.)
技术领域
本发明属于ACE抑制肽
技术领域
，具体涉及一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用。背景技术
高血压严重影响着人们的生命安全，根据数据显示，每年有1040万人因高血压而死。尽管大家对高血压的发病机理越来越清楚，也做出了大量的措施来避免，但是高血压的发病率在全球范围内仍在增加，由高血压引起的死亡率也仍在增加。调查结果显示，18～34岁的青年高血压患病率为10.1%、35～44岁的患病率为15.0 %。年龄在60岁以上的男性患者和女性患者占该年龄段人数的41.6%和38.4%。
目前高血压无法根治，患者必须长期服用降压药。临床上使用的降压药有卡托普利、依那普利、雷米普利等，这些合成药物属于血管紧张素转化酶抑制剂型（ACEI）降压药，同样也是通过抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性来实现血压的稳定。尽管降压药能够有效控制高血压，但合成药物价格昂贵，而且经常产生副作用，例如咳嗽，血管性水肿，味觉障碍和皮疹。由于经济性和安全性的需要，开发安全有效的治疗高血压的新型ACEI是非常必要的。食品源的ACE抑制肽，对高血压具有定向抑制功能，且不影响正常血压，相对于传统降血压药而言，对人体无毒、无副作用。
紫苏可以做药用和香料用，其种子可以榨油，营养价值较高。现阶段国内外对于紫苏籽活性肽的研究主要集中于抗氧化、抗肿瘤、抗炎和抗过敏活性，以及制备紫苏籽蛋白呈味肽，而紫苏籽降压肽几乎没有报道。本发明旨在对紫苏籽粕潜在的价值进行开发利用，首次对紫苏籽粕ACE抑制肽进行研究，丰富紫苏籽粕在功能食品中的应用，增加紫苏籽粕的附加值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用，提高紫苏籽粕的附加价值，实现资源的综合利用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽，其氨基酸序列为：Val-Gly-Ala-Tyr，缩写为VGAY，即缬氨酸-甘氨酸-丙氨酸-酪氨酸，通过数据库BIOPEP、NCBI、biopepDB、UniProt比对，发现其为新型肽。
进一步，上述ACE抑制肽来源于紫苏籽粕天然提取或人工合成。
一种制备上述紫苏籽粕ACE抑制肽的方法，具体操作步骤如下：
（1）碱提酸沉法制备紫苏籽粕粗蛋白：粉碎后的紫苏籽粕与石油醚按照1：3（w/v）的比例混合，磁力搅拌6 h除去油脂，溶剂挥发后过80目筛即得脱脂紫苏籽粕粉；将脱脂紫苏籽粕粉与蒸馏水以1：11.6（w/v）的料液比混合，调节pH到9.4，58℃下水浴60 min，水浴结束后，于4℃条件下10000 r/min离心20 min，上清pH调到紫苏籽蛋白等电点4.0，沉淀1 h后，4℃条件下10000 r/min 离心15 min，沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到紫苏籽粕粗蛋白；
（2）酶解制备粗紫苏籽粕ACE抑制肽：选用中性蛋白酶酶解紫苏籽粕粗蛋白，酶解条件为：加酶量7100 U/g、温度55℃、pH值6.5、底物浓度1% w/v、酶解时间2 h，酶解后沸水浴10 min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下10000 rpm离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得到粗紫苏籽粕ACE抑制肽；
（3）紫苏籽粕ACE抑制肽的分离纯化：将粗紫苏籽粕ACE抑制肽加入蒸馏水配成浓度为50 mg/mL的溶液，将溶液过0.22μm滤膜后，用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分在214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳ACE抑制活性的峰，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0-3min，5%（v/v）乙腈；3-43 min，5%-40%（v/v）乙腈；43-53 min，40%（v/v）乙腈；流速为2.0 mL/min，检测波长214 nm，收集洗脱时间为23-24 min的洗脱峰，真空冷冻干燥即得所述ACE抑制肽。
上述一种紫苏籽粕ACE抑制肽在制备高血压预防药物中的应用。
上述一种紫苏籽粕ACE抑制肽在制备降血压保健食品中的应用。
附图说明
图1：紫苏籽粕ACE抑制肽Sephadex G-25色谱图。
图2：Sephadex G-25洗脱峰F4的半制备反相高效液相色谱图。
图3：紫苏籽粕ACE抑制肽VGAY质谱图。
图4：VGAY的ACE抑制活性IC50。
图5：不同浓度的VGAY对人脐静脉内皮细胞毒性的影响。
图6：不同浓度的VGAY对人脐静脉内皮细胞NO释放的影响。
图7：VGAY与ACE的分子对接结果。其中，A为ACE与VGAY分子对接结果图；B为相互作用位点放大图；C为相互作用的二维显示图，无虚线连接的ACE上的氨基酸与VGAY的相互作用为范德华力。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本发明所述ACE抑制肽的分离纯化包括Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。
碱提酸沉法制备紫苏籽粕粗蛋白：粉碎后的紫苏籽粕与石油醚按照1：3（w/v）的比例混合，磁力搅拌6 h除去油脂，干燥后过80目筛以备后续提取紫苏籽蛋白；将脱脂紫苏籽粕粉与蒸馏水以1：11.6（w/v）的料液比混合，调节pH到9.4，58℃下水浴60 min，水浴结束后，于4℃条件下10000 r/min离心20 min，将上清pH调到紫苏籽蛋白等电点4.0，沉淀1 h后，4℃条件下10000 r/min 离心15 min，沉淀复溶，pH调到7.0，冷冻干燥即得到紫苏籽粕粗蛋白。
酶解制备紫苏籽粕粗多肽：选用中性蛋白酶酶解上述紫苏籽粕粗蛋白，酶解条件为：加酶量7100 U/g、温度55℃、pH值6.5、底物浓度1% w/v、酶解时间2 h，酶解后沸水浴10min灭酶，冷却后调节pH至中性，于4℃条件下10000 rpm离心20 min，取上清液冷冻干燥，即得到粗紫苏籽粕ACE抑制肽。
凝胶过滤色谱（Sephadex G-25）分离：将上述粗紫苏籽粕ACE抑制肽溶解于去离子水中，使其浓度为50 mg/mL，于4℃条件下10000 rpm离心10 min。取上清液用0.22 μm微滤膜过滤除杂后上样。Sephadex G-25凝胶柱（1.6 cm×100 cm）用去离子水平衡，将已过滤的样品上柱。用去离子水洗脱，流速0.3 mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制洗脱曲线，如图1所示。收集各组分进行ACE抑制活性测定，以检测ACE抑制肽不同分子量的组分的ACE抑制活性情况。组分F4的ACE抑制率最高，其值为70.36%，于是对F4进行富集，以备后续反相高效液相色谱分离纯化。
反相高效液相（RP-HPLC）色谱分离纯化：去离子水溶解上述组分F4冻干粉，浓度为40 mg/mL，采用高效液相色谱柱Gemini 5μ C18 （250mm×10mm）（Phenomenex，UK）进行进一步分离纯化，用水和乙腈（含0.1%（v/v）的三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。参数选择二元泵，A泵为超纯水，B泵为乙腈（含0.1%（v/v）三氟乙酸）；流动相时间参数：0-3 min，5%B；3-43 min，5-40% B；43-53 min，40% B。柱温为25℃，流速为2 mL/min，上样体积为100 μL，紫外检测波长为214 nm，共得到21个洗脱峰，如图2所示。收集7号洗脱峰，冷冻干燥后即得所述紫苏籽粕ACE抑制肽。委托复旦大学对7号峰进行液相色谱质谱联用（LC-ESI-MS/MS）分析和鉴定，所得紫苏籽粕ACE抑制肽的氨基酸序列为Val-Gly-Ala-Tyr（VGAY），质谱图如图3所示。
实施例2
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上， 测定其ACE抑制活性IC50方法如下：ACE及N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（FAPGG）均使用100 mM、pH 8.3的硼酸缓冲溶液（含300 mM NaCl）配制，样品组分别依次加入50 μL 1 mM的FAPGG、40 μL不同终浓度（0.05、0.1、0.25、0.5、1和2 mg/mL）的VGAY硼酸缓冲溶液、10 μL0.1 U/mL的ACE（以硼酸缓冲溶液替代多肽溶液作为空白组）到96孔板中，随即测各孔340nm处的吸光度 A0（反应前），接着将96孔板置于37℃培养箱中反应30 min，30 min结束后继续测340 nm吸光度 A1（反应后），平行三次取平均值。分别计算反应前后的吸光度的变化值ΔA（ΔA=A0-A1），ACE抑制活性用吸光度在单位时间内的变化值来表示，ACE抑制率的计算公式为：
式中，ΔAa表示样品孔30 min前后吸光度的变化值；ΔAb表示空白孔30 min前后吸光度的变化值；
如图4所示，得到VGAY的ACE抑制活性IC50为0.861 mg/mL。
实施例3
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上，测定其对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）毒性：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液。分别设置样品组、对照组、空白组（无细胞），每个组3个复孔。培养24 h细胞贴壁后，弃旧培养基，空白组和对照组加入100μL DMEM培养基，样品组加入100 μL配制好的含有梯度浓度（0.125、0.25、0.5、1 mg/mL）VGAY的DMEM培养基。继续培养24 h，弃旧培养基，各孔均加入100 μL新的DMED培养基和10 μL的CCK-8 Solution，置于培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测450 nm波长处的吸光度。细胞存活率公式如下：
公式中：A：样品组吸光度；B：对照组吸光度；C：空白组吸光度；
由图5可以发现，当VGAY浓度为0.125、0.25 mg/mL时，对HUVEC细胞不仅没有毒性而且在一定程度上促进了HUVEC细胞的生长；VGAY浓度为0.5、1 mg/mL时，HUVEC细胞存活率略微有下降的趋势，存活率为98.64%、91.88%，但与对照组相比差异不显著。
实施例4
委托上海吉尔生化有限公司固相合成VGAY，纯度为98%以上，测定其降血压功能：选择生长状态良好的HUVEC细胞，加入DMEM培养基，制成单细胞悬液，用血细胞计数板计数，以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL细胞悬液。分别设置促血管生成素Ⅱ（Ang Ⅱ）组、多肽+Ang Ⅱ组和对照组（不添加多肽和Ang Ⅱ），每个组3个复孔。培养24 h细胞贴壁后，弃旧培养基，空白组和对照组加入100 μL DMEM培养基，样品组加入100 μL配制好的含有VGAY梯度浓度（0.05、0.1 mg/mL）的DMEM培养基。培养2 h后，Ang Ⅱ组、多肽+AngⅡ组分别加入终浓度为0.1 mg/mL的Ang Ⅱ，对照组不做任何处理，继续培养24 h后，取上清50 μL，根据NO检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明书测定HUVEC细胞NO的释放量。
由图6可以发现，与Ang II刺激组相比，VGAY预处理组NO释放量显著增加，并且呈现出剂量依赖性，随着VGAY浓度的增加，NO释放量显著增加。说明在高剂量下多肽VGAY能够促进内皮细胞NO的释放，保护细胞，减少血管收缩剂Ang II对细胞的影响，起到一定的降血压的作用。
实施例5
紫苏籽粕ACE抑制肽VGAY与ACE的分子对接：ACE晶体结构（ID：1O8A）从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得，使用AutoDock Tools 1.5.6结合AutoDock Vina对蛋白和多肽进行对接，对接位点坐标为：x：40.79，y：33.61，z：43.48。由图7可以发现，VGAY与ACE的残基Tyr 146、His 353、Thr 282、Asn 277、Glu 376形成6个氢键，与Asp 453、Glu 376通过静电相互作用结合，与Trp 279、Leu 161、Glu 162分别以π-π、π-烷基、π-阴离子作用力结合，从而起到抑制ACE的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种来源于紫苏籽粕的ACE抑制肽及其制备方法与应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Val Gly Ala Tyr
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