盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途
阅读说明：本技术 盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途 (Application of chlorpromazine hydrochloride in preparation of cyclin inhibitor ) 是由 夏勇 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途。本发明证明盐酸氯丙嗪能够抑制结直肠癌细胞的增殖,促进其凋亡,在此过程中能明显减少细胞增殖相关的AKT和p44/p42 MAPK蛋白的磷酸化,可以降低结直肠癌细胞中细胞周期相关的cyclin D1,cyclin B1,cdc2,cdc25c,cyclin E,cyclin A2,c-Myc的表达,增加p-cdc(Tyr15)和p21的表达,可以降低CT26、HCT116两种细胞中细胞凋亡相关的pro-caspase 3,Bcl2的表达,增加细胞凋亡相关的cleaved caspase 3,Bax和p53的表达。盐酸氯丙嗪不仅能够用于制备细胞周期素蛋白抑制剂,还能用于制备治疗癌症的药物,特别是治疗结直肠癌的药物,具有广阔的应用前景。(The invention provides an application of chlorpromazine hydrochloride in preparing a cyclin protein inhibitor. The invention proves that chlorpromazine hydrochloride can inhibit proliferation of colorectal cancer cells and promote apoptosis of the colorectal cancer cells, phosphorylation of AKT and p44/p42MAPK proteins related to cell proliferation can be obviously reduced in the process, expression of cycle D1, cycle B1, cdc2, cdc25c, cycle E, cycle A2 and c-Myc related to cell cycle in the colorectal cancer cells can be reduced, expression of p-cdc (Tyr15) and p21 can be increased, expression of pro-caspase 3 and Bcl2 related to apoptosis in CT26 and HCT116 cells can be reduced, and expression of clear caspase3, Bax and p53 related to apoptosis can be increased. The chlorpromazine hydrochloride can be used for preparing cyclin protein inhibitors and medicaments for treating cancers, particularly colorectal cancers, and has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途。
背景技术
细胞周期素蛋白又称细胞周期素，是细胞周期调节分子，这类蛋白质通过活化周期蛋白依赖激酶调节细胞周期各时相的转换与进行。细胞周期的主要周期素有：cyclin A,cyclin B,cyclin D及cyclin E。在G1期→S期调控蛋白为细胞周期蛋白D1(cyclin D1)以及细胞周期蛋白E(cyclin E)，s期→G2期调控蛋白为细胞周期蛋白A(cyclin A)，G2期→M期调控蛋白为细胞周期蛋白B(cyclin B)。
结直肠癌是全世界癌症死亡的主要原因，每年造成大约83万人死亡。治疗结直肠癌的主要治疗方法包括手术切除、化疗、放疗、靶向治疗以及免疫治疗。虽然近些年结直肠癌的治疗有很多进步，但是对于更有效的治疗结直肠癌的方法还是有很大的需求。
结直肠癌的治疗方式中，对于没有发生远处转移的早期结直肠癌，根治性手术切除是主要的治疗手段。化疗药物主要包括5-FU、甲酰四氢叶酸钙、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康等，但是化疗与放疗都存在骨髓毒性、消化道毒性等明显的毒副作用，且很多病人对治疗不响应或者耐药等。近年来，一些靶向药物也开始用于治疗结直肠癌，如靶向表皮生长因子受体(EGFR)的西妥昔单抗和帕尼单抗、针对血管内皮生长因子受体(VEGFR)的贝伐单抗、阿柏西普，以及蛋白激酶抑制剂瑞戈非尼等，它们给晚期结直肠癌患者带来了一些生存获益，提高了临床疗效。免疫治疗也正在被用于结直肠癌的治疗上，比如免疫检查点抑制剂PD-1单抗Pembrolizumab和Nivolumab被推荐用于具有dMMR(错配修复蛋白缺失)/MSI-H(高度的微卫星不稳定性)分子表型的结直肠癌的末线治疗。但是这些靶向治疗和免疫治疗也存在价格昂贵、病人对治疗不响应以及治疗耐药等问题。因此，需要有更多的有可能成为临床治疗结直肠癌的药物被开发出来。
盐酸氯丙嗪是一个噻嗪类中枢多巴胺受体的阻断剂，可用于精神分裂症、躁狂症或其他精神病性障碍的治疗，还可以用于治疗各种原因所致的呕吐。但将其用于治疗结直肠癌的报道几乎没有。
发明内容
本发明的目的是提供盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途。
本发明提供了盐酸氯丙嗪在制备细胞周期素蛋白抑制剂中的用途。
进一步地，所述细胞周期素蛋白为cyclin D1、cyclin B1、cyclin E、cyclin A2。
进一步地，所述抑制剂用于降低cdc2、cdc25c、c-Myc的表达；和/或，增加p-cdc(Tyr15)、p21的表达。
进一步地，所述抑制剂用于制备治疗癌症的药物；优选地，所述癌症为结直肠癌。
进一步地，所述药物为抑制结直肠癌细胞增殖的药物；和/或，所述药物为诱导结直肠癌细胞凋亡的药物。
进一步地，所述药物为降低结直肠癌细胞增殖相关的AKT蛋白、p44/p42MAPK蛋白的磷酸化的药物。
进一步地，所述药物为引起结直肠癌细胞G2/M周期阻滞的药物。
进一步地，所述药物为降低细胞凋亡相关的pro-caspase 3，Bcl2的表达，增加细胞凋亡相关的cleaved caspase 3，Bax和P53的表达的药物。
进一步地，所述药物是以盐酸氯丙嗪为活性成分，加入药学上可接受的辅料和/或辅助性成分制备而成的制剂。
进一步地，所述制剂为注射制剂。
体外实验表明，盐酸氯丙嗪能以浓度和时间依赖的方式抑制小鼠结直肠癌细胞(CT26)、人结直肠癌细胞(HCT116和SW620)的增殖，也能够抑制HCT116和SW620细胞在6孔板里面形成克隆的能力，并使得细胞增殖相关的AKT和p44/p42 MAPK蛋白的磷酸化减少。盐酸氯丙嗪还能以浓度和时间依赖的方式诱导结直肠癌细胞CT26和HCT116发生G2/M细胞周期阻滞，并降低细胞周期相关的cyclin D1,cyclin B1,cdc2,cdc25c,cyclin E,cyclin A2,c-Myc的表达，增加p-cdc(Tyr15)和p21的表达。此外，盐酸氯丙嗪还可以诱导结直肠癌细胞发生凋亡，降低细胞凋亡相关的pro-caspase 3，Bcl2的表达，增加细胞凋亡相关的cleavedcaspase 3，Bax和P53的表达。盐酸氯丙嗪也能降低CT26和HCT116的线粒体膜电位并增加细胞胞内活性氧含量。动物实验进一步证明，盐酸氯丙嗪能够明显抑制裸鼠体内人HCT116结直肠癌皮下瘤和Balb/c小鼠体内CT26皮下瘤的生长，并降低小鼠皮下肿瘤内肿瘤细胞的增殖(Ki67阳性细胞比例降低)，增加小鼠皮下肿瘤内肿瘤细胞的凋亡(cleaved caspase 3阳性染色细胞比例增加)。而且，相比于结直肠癌细胞，盐酸氯丙嗪对人正常肠上皮细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的毒性较小，盐酸氯丙嗪的体内给药也对小鼠的体重没有产生明显的降低，因此安全性良好。
综上所述，本发明发现了盐酸氯丙嗪具有潜在的抑制细胞周期素蛋白表达和治疗结直肠癌的作用，盐酸氯丙嗪不仅能够用于制备细胞周期素蛋白抑制剂，还能用于制备治疗结直肠癌的药物，具有显著的临床和社会意义。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞SW620细胞增殖抑制率图。
图2为实施例1盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞HCT116细胞增殖抑制率图。
图3为实施例1盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26细胞增殖抑制率图。
图4为实施例1盐酸氯丙嗪对人结肠上皮细胞HCoEpiC细胞增殖抑制率图。
图5为实施例1盐酸氯丙嗪对小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3细胞增殖抑制率图。
图6为实施例1盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞SW620和HCT116细胞克隆形成抑制图。
图7为实施例1盐酸氯丙嗪对人结肠上皮细胞HCoEpiC和小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3细胞克隆形成抑制图。
图8为实施例1盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞HCT116和小鼠结直肠癌细胞CT26的细胞增殖相关的AKT和p44/p42 MAPK蛋白的磷酸化的影响图。
图9为实施例2盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26细胞周期的影响图。
图10为实施例2盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞HCT116细胞周期的影响图。
图11为实施例2盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26细胞周期相关蛋白表达的影响图。
图12为实施例2盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞HCT116细胞周期相关蛋白表达的影响图。
图13为实施例3盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116凋亡的流式结果图。
图14为实施例3盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116凋亡相关蛋白表达的影响。
图15为实施例4盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116线粒体膜电位的影响(流式结果)。
图16为实施例4盐酸氯丙嗪对小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116胞内活性氧含量的影响(流式结果)。
图17为实施例5盐酸氯丙嗪在小鼠皮下模型上对小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116的抑制效果图。
图18为实施例5盐酸氯丙嗪在小鼠皮下模型上治疗小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116期间小鼠的体重变化图。
图19为实施例5盐酸氯丙嗪治疗小鼠皮下人结直肠癌细胞HCT116模型12天后小鼠肿瘤组织中Ki67免疫组化染色结果图。
图20为实施例5盐酸氯丙嗪治疗小鼠皮下人结直肠癌细胞HCT116模型12天后小鼠肿瘤组织中cleaved caspase3免疫组化染色结果图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
其中，盐酸氯丙嗪(英文名chlorpromazine hydrochloride,CPZ)，CAS号：69-09-0，结构如下：
实施例1、盐酸氯丙嗪抑制结直肠癌的细胞实验
一、实验原理
肿瘤的一大特征就是不受控制的生长，如果能够减少肿瘤细胞的数量，将能够产生抗肿瘤效果。肿瘤细胞具有从一个细胞分裂增殖形成细胞克隆的能力，如果能够抑制肿瘤细胞形成克隆的能力，也可以产生抗肿瘤效果。本实施例将从以上两个方面证实盐酸氯丙嗪对肿瘤细胞抑制能力。
二、实验方法
1、细胞的培养
人结直肠癌细胞系SW620、HCT116和小鼠结直肠癌细胞系CT26用10％FBS的1640培养基培养，人结肠上皮细胞系HCoEpiC和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养，以上细胞系在培养和实验过程中均需要加入100U/mL的青霉素和链霉素，培养在环境条件为37℃、5％CO2的孵箱中(正常培养)。
2、MTT法检测盐酸氯丙嗪对上述细胞增殖的影响
分别消化并收集指数生长期的上述细胞，铺于96孔板，正常培养。选取对数期生长状态良好的细胞，根据细胞生长速度接种96孔板，每孔2000个细胞，每孔100μL，在37℃、5％CO2培养箱培养。接种第二天，每孔加入100μL用相应培养基稀释过的盐酸氯丙嗪，使其终浓度为0μg/mL(简称0μM)、1.88μM、3.75μM、7.5μM、15μM、30μM，相同浓度设置3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱分别培养48，72h后，每孔中加入MTT储存液20μL(5mg/mL)后放入培养箱培养3h，轻轻吸走细胞上清液，每孔加入150μL的DMSO，放置在水平摇床上90r/min摇晃5min，酶标仪于570nm处测定OD值。实验重复三次，整理数据，根据吸光度值得出生长抑制率，计算出IC50。
3、通过克隆形成实验检测盐酸氯丙嗪对SW620、HCT116细胞增殖的影响
取对数生长期的SW620、HCT116细胞，以800个/孔的密度接种于6孔板中。培养24小时后，将细胞培养基换为相同体积含有不同浓度盐酸氯丙嗪(3.75μM、7.5μM和15μM)的培养基，然后置于37℃、5％CO2孵箱中培养10天。小心吸弃培养基，之后用PBS溶液洗2次，再用4％多聚甲醛固定15分钟。使用含有0.5％结晶紫的甲醇溶液染色15分钟，最后分别用PBS溶液和去离子水洗1次，晾干。然后在灯箱上照相，并于倒置显微镜下计数克隆的数量(以大于50个细胞的集落为一个克隆)，并按以下公式计算克隆形成抑制率：克隆形成抑制率＝[1-(给药组克隆数量/溶剂对照组克隆数量)]×100％。每组设三个复孔，实验重复3次。溶剂对照组为细胞中不添加药物，只正常培养。
4、检测盐酸氯丙嗪对结直肠癌细胞CT26、HCT116的增殖相关蛋白表达的影响
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以60万个/皿的密度接种于10cm直径培养皿中，培养24小时后，使用相同体积不同浓度(0μM、10μM和20μM)的盐酸氯丙嗪处理细胞48小时，然后使用4℃预冷的PBS洗细胞3次，马上将各组细胞于冰上用RIPA裂解液裂解30分钟，然后使用细胞刮刮下所有贴壁细胞，将RIPA裂解液吸入1.5mL EP管内，再使用超声破碎仪裂解细胞(1秒一次，每次间隔1秒，共10次)，然后于4℃下离心15分钟(13000rpm)。取上清液于新的1.5mL EP管中保存备用。按照BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)说明书对所得的蛋白样品进行定量：调整蛋白浓度至适宜(蛋白浓度能被检测出)的相同浓度，加入蛋白上样缓冲液(5×)后煮沸5分钟，分装后放入-20℃冰箱内冷冻保存。按照SDS-PAGE凝胶试剂盒的步骤，配制10％或12.5％的凝胶，凝胶浓度根据目的蛋白的大小决定。每孔上样量为40μg，120V电泳90min。电泳结束后，将与分离胶大小相当的NC膜放入转膜缓冲液中。将凝胶和NC膜按照(红面)海绵→3张滤纸→PVDF膜→凝胶→3张滤纸→海绵(黑面)的顺序制成转膜“三明治”结构，排除各层之间的气泡，并迅速插入转膜夹中，恒流300mA进行转膜，转膜时间由目的蛋白分子量大小决定。转膜结束后，将膜放入封闭缓冲液中，室温封闭1h。封闭过后的膜用TBST洗膜液洗五分钟，然后根据抗体说明书用一抗稀释液将相应的一抗稀释至合适的浓度，把膜放入稀释过后的一抗当中，4℃振荡过夜。之后将膜取出置于水平摇床上，用TBST洗膜液洗3次，每次5min，用封闭液稀释二抗，室温孵育膜1h。取出膜，TBST中洗3次，每次5分钟，将显影液均匀滴加到PVDF膜上，在曝光仪中曝光。
三、实验结果
盐酸氯丙嗪对人结直肠癌细胞系SW620、HCT116，小鼠结直肠癌细胞系CT26，人结肠上皮细胞系HCoEpiC和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3细胞增殖的影响实验结果见图1～5。从图1可以看出，盐酸氯丙嗪能以浓度和时间依赖的方式抑制SW620细胞增殖。从图2可以看出，盐酸氯丙嗪能以浓度和时间依赖的方式抑制HCT116细胞增殖。从图3可以看出，盐酸氯丙嗪能以浓度和时间依赖的方式抑制鼠源CT26细胞增殖。从图4和图5可以看出，同等浓度的盐酸氯丙嗪对人结肠上皮细胞系HCoEpiC和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3的抑制作用低于SW620、HCT116和CT26细胞。
盐酸氯丙嗪对HCT116和SW620细胞在六孔板上的克隆形成的影响实验结果见图6。从图6可以看出，培养10天后，没有使用药物盐酸氯丙嗪的HCT116和SW620都能在六孔板上形成很多明显的细胞克隆，而使用盐酸氯丙嗪能明显减少细胞克隆的数量。从图7可以看出，同等浓度的盐酸氯丙嗪对人结肠上皮细胞系HCoEpiC和小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3的克隆形成的抑制作用低于SW620、HCT116和CT26细胞。
盐酸氯丙嗪对HCT116和CT26细胞的增殖相关蛋白表达的影响实验结果见图8。从图8可以看出，盐酸氯丙嗪作用2天能明显减少细胞增殖相关的AKT和p44/p42 MAPK蛋白的磷酸化。
实施例2、：盐酸氯丙嗪诱导结直肠癌细胞周期阻滞的细胞实验
一、实验原理
碘化丙啶(Propidium，简称PI)是一种双链DNA的荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布，从而计算出各个期的百分含量。肿瘤的一大特征就是不受控制的生长，如果能够减慢肿瘤细胞的增殖速度，将其细胞周期阻滞在某一个时期，细胞不能进入下一个分裂阶段，因此将能够产生抗肿瘤效果。
二、实验方法
1、盐酸氯丙嗪对结直肠癌细胞CT26、HCT116细胞周期分布的影响
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以10万个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，使用相同体积含不同浓度(0μM、7.5μM和15μM)盐酸氯丙嗪的培养基处理细胞12和24小时。然后用胰酶消化并收集细胞并在75％乙醇中固定24小时。在避光条件下用含有50μg/mL碘化丙啶(PI)和0.1％Triton X-100的溶液孵育15分钟后，通过流式细胞仪测量并分析细胞周期分布。
2、盐酸氯丙嗪对结直肠癌细胞CT26、HCT116细胞周期相关蛋白表达的影响
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以60万个/皿的密度接种于10cm直径培养皿中，培养24小时后，使用相同体积含不同浓度(0μM、7.5μM和15μM)盐酸氯丙嗪的培养基处理细胞24小时。然后使用4℃预冷的PBS洗细胞3次，马上将各组细胞于冰上用RIPA裂解液裂解30分钟，然后使用细胞刮刮下所有贴壁细胞，之后的步骤如实施例1中的实验方法的第4条。
三、实验结果
从图9和图10可以看到，盐酸氯丙嗪处理12和24小时后，CT26、HCT116两种细胞中都出现了明显的G2/M阻滞，还观察到G0/G1和S期细胞的同时减少。从图11和图12同时可以看到，盐酸氯丙嗪处理24小时可以降低CT26、HCT116两种细胞中细胞周期相关的cyclinD1,cyclin B1,cdc2,cdc25c,cyclin E,cyclin A2,c-Myc的表达，增加p-cdc(Tyr15)和p21的表达。
实施例3、盐酸氯丙嗪诱导结直肠癌细胞周期凋亡的细胞实验
一、实验原理
Annexin V是一种钙离子依赖性的磷脂结合蛋白，当细胞发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸会从膜内外翻，Annexin V与外翻后的磷脂酰丝氨酸具有很高的亲和力。PI是核酸染料，不能穿过活细胞膜，当细胞膜出现破损时，PI可进入细胞并结合核酸。当将FITC这种荧光蛋白标记在Annexin V上，Annexin V和PI联用便可以利用流式细胞仪对细胞凋亡进行检测。如果能够让肿瘤细胞发生凋亡，将能减少肿瘤细胞数量，因此将能够产生抗肿瘤效果。
二、实验方法
1、盐酸氯丙嗪对结直肠癌细胞CT26、HCT116细胞凋亡的影响
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以10万个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，使用相同体积含不同浓度(0μM、7.5μM、15μM和30μM)盐酸氯丙嗪的培养基处理癌细胞24小时。然后用胰酶消化并收集细胞，按照试剂盒分别加入Annexin V-FITC和PI，然后通过流式细胞仪测量并分析细胞凋亡。
2、盐酸氯丙嗪对结直肠癌细胞CT26、HCT116细胞凋亡相关蛋白表达的影响
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以60万个/皿的密度接种于10cm直径培养皿中，培养24小时后，使用相同体积含不同浓度(0μM、10μM和20μM)盐酸氯丙嗪的培养基处理细胞24小时，然后使用4℃预冷的PBS洗细胞3次，马上将各组细胞于冰上用RIPA裂解液裂解30分钟，然后使用细胞刮刮下所有贴壁细胞，之后的步骤如实施例1中的实验方法的第4条。
三、实验结果
从图13的流式检测可以看到，盐酸氯丙嗪处理24小时后，CT26、HCT116两种细胞中都出现了浓度依赖性的细胞凋亡。从图14同时可以看到，盐酸氯丙嗪处理24小时，可以降低CT26、HCT116两种细胞中细胞凋亡相关的pro-caspase 3，Bcl2的表达，增加细胞凋亡相关的cleaved caspase 3，Bax和p53的表达。
实施例4、盐酸氯丙嗪降低结直肠癌细胞线粒体膜电位和提高活性氧的细胞实验
一、实验原理
细胞凋亡分为内在凋亡和外在凋亡途径。维持线粒体膜完整性和线粒体膜电位对于预防内在细胞凋亡是必不可少的。如果完整性受损，线粒体膜电位下降，细胞色素c就会从线粒体中释放出来进入细胞质，启动细胞内在凋亡。肿瘤细胞由于持续不断的快速分裂等，处于氧化应激状态，细胞内的活性氧水平较高，如果胞内活性氧水平继续升高，细胞将可能由于不能承受的氧化应激发生凋亡。活性氧水平升高也参与了细胞内在凋亡途径。
二、实验方法
1、细胞线粒体膜电位的测定
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以10万个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，用相同体积含不同浓度(0μM、10μM和20μM)盐酸氯丙嗪的培养基分别处理CT26、HCT116两种细胞24小时后，将细胞与5μg/mL罗丹明-123[Rh123，Sigma-Aldrich(Shanghai)Trading Company]在37℃下避光孵育30分钟。然后用冷PBS洗涤细胞，用流式细胞仪检测Rh123发出的荧光信号。
2、细胞内活性氧水平的测定
取对数生长期的CT26、HCT116细胞，以10万个/孔的密度接种于6孔板中，培养24小时后，用相同体积含不同浓度(0μM、10μM和20μM)盐酸氯丙嗪的培养基分别处理CT26、HCT116两种细胞24小时后，将细胞与DCFH-DA(10μM)在37℃在避光孵育30分钟。用PBS洗涤后，通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度以测量癌细胞中的ROS水平。
三、实验结果
从图15可以看到，盐酸氯丙嗪处理24小时后，CT26、HCT116两种细胞中都出现了浓度依赖性的细胞线粒体膜电位的下降。从图16同时可以看到，盐酸氯丙嗪处理24小时后，CT26、HCT116两种细胞中的活性氧都呈现了浓度依赖性的提高，这说明盐酸氯丙嗪可能诱导了这两种结直肠癌细胞的内在凋亡。
实施例5、盐酸氯丙嗪抑制小鼠结直肠癌模型生长的动物体内实验
一、实验原理
动物体内抗肿瘤实验相对于细胞系上的结果更能反映抗肿瘤化合物的潜在抗肿瘤效果。我们采用国际通用的方法，给BALB/c小鼠皮下注射CT26小鼠结直肠癌细胞，给BALB/c裸鼠皮下注射HCT116人结直肠癌细胞建立小鼠体内的结直肠癌模型，当小鼠皮下肿瘤平均体积达到大约100mm3的时候开始使用盐酸氯丙嗪治疗，通过肿瘤体积的变化来判定盐酸氯丙嗪的抗结直肠癌的效果，通过给药后小鼠体重的变化情况初步判断化合物的毒性情况，结束实验时取小鼠肿瘤进行免疫组化染色，初步判定化合物体内抗肿瘤的作用方式。
二、实验方法
1、小鼠结直肠癌模型的建立：给8-10周的BALB/c雌性小鼠皮下注射100万个CT26小鼠结直肠癌细胞，给8-10周的BALB/c雌性裸鼠皮下注射1000万个HCT116人鼠结直肠癌细胞，约7-14天后，小鼠皮下肿瘤会长到大概100mm3。
2、溶解盐酸氯丙嗪的溶剂配方如下：2.5％DMSO，12.5％Cremophor EL以及85％的生理盐水。
3、给药剂量、途径和给药频率：盐酸氯丙嗪治疗组小鼠每天一次腹腔注射盐酸氯丙嗪(盐酸氯丙嗪使用溶剂溶解)，剂量为10mg/kg；溶剂对照组小鼠每天一次腹腔注射等量溶剂。
4、实验结束时处理方法：当皮下肿瘤平均体积达到大概2000mm3时，停止给药，使用过量二氧化碳处死小鼠。取HCT116模型的小鼠肿瘤，放在4％多聚甲醛溶液中浸泡48小时，然后通过免疫组化染色对肿瘤内Ki67和cleaved caspase 3蛋白进行染色。
三、实验结果
图17：给药12天和13天后，盐酸氯丙嗪对HCT116模型和CT26模型的抑制率都大于60％。
图18，给药12天和13天后，盐酸氯丙嗪的治疗没有对BALB/c雌性小鼠和裸鼠的体重造成明显的下降。
图19，实验结束后HCT116模型中免疫组化染色结果显示：相比于溶剂对照组，盐酸氯丙嗪能降低Ki67阳性肿瘤细胞的比例，这说明盐酸氯丙嗪能够在小鼠体内抑制肿瘤细胞的增殖；
图20，相比于溶剂对照组，盐酸氯丙嗪能增加cleaved caspase 3阳性肿瘤细胞的比例，这说明盐酸氯丙嗪能够在小鼠体内诱导肿瘤细胞的凋亡。
综上，本发明证明盐酸氯丙嗪能够抑制结直肠癌细胞的增殖，促进其凋亡，在此过程中能明显减少细胞增殖相关的AKT和p44/p42 MAPK蛋白的磷酸化，可以降低结直肠癌细胞中细胞周期相关的cyclin D1,cyclin B1,cdc2,cdc25c,cyclin E,cyclin A2,c-Myc的表达，增加p-cdc(Tyr15)和p21的表达，可以降低CT26、HCT116两种细胞中细胞凋亡相关的pro-caspase 3，Bcl2的表达，增加细胞凋亡相关的cleaved caspase 3，Bax和p53的表达。盐酸氯丙嗪不仅能够用于制备细胞周期素蛋白抑制剂，还能用于制备治疗癌症的药物，特别是治疗结直肠癌的药物，具有广阔的应用前景。
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