一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用

文档序号：824759 发布日期：2021-03-30 浏览：48次 >En<

阅读说明：本技术 一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用 (Recombinant alginate lyase with thermal stability and high enzyme activity and application thereof ) 是由牟海津杨敏朱常亮于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明是提供一种具有更好热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO5；本发明所提供的突变酶用于制备褐藻胶寡糖。本发明利用基因改造的重组褐藻胶裂解酶,定向制备褐藻胶寡糖,与现有酸法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比,克服了破坏性大的缺点,与现有的酶法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比,运用改造的重组褐藻胶裂解酶,可减少加酶量、缩短酶解时间、提高酶解效率。本发明的酶具有高酶活力和高热稳定性,更适合应用于工业上酶解褐藻胶制备褐藻胶寡糖。所制备的褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效,可用于食品及保健品领域,具有广泛的应用前景。(The invention provides an alginate lyase with better thermal stability and high enzyme activity, and the amino acid sequence of the alginate lyase is SEQ ID NO. 3 or SEQ ID NO 5; the mutant enzyme provided by the invention is used for preparing alginate oligosaccharides. Compared with the existing method for preparing the alginate oligosaccharides by enzymatic hydrolysis, the modified recombinant alginate lyase is used, so that the enzyme adding amount can be reduced, the enzymolysis time can be shortened, and the enzymolysis efficiency can be improved. The enzyme of the invention has high enzyme activity and high thermal stability, and is more suitable for preparing alginate oligosaccharides by industrially hydrolyzing algin. The prepared alginate oligosaccharide has the effects of resisting tumor, resisting inflammation, reducing blood fat, improving immunity and the like, can be used in the fields of food and health care products, and has wide application prospect.)

技术领域

本发明属于褐藻胶酶技术领域，具体涉及一种具有更好热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶。

背景技术

褐藻胶寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻胶经水解而得到的聚合度小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等多种生理活性，可广泛应用在食品、医药及化妆品等领域，具有巨大的应用和开发价值。最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻胶寡糖的制备方法主要有酸法水解和酶法水解。酸法水解会不同程度破坏褐藻胶寡糖的结构，而酶法水解具有反应条件温和等优点，因此，酶法水解制备褐藻胶寡糖受到广泛关注。海洋微生物是褐藻胶裂解酶的重要来源，一些褐藻胶裂解酶相继从弧菌、交替单胞菌、假交替单胞菌中分离出来。但由于海洋环境的特殊性，导致海洋微生物产生的褐藻胶裂解酶产量低、酶活力不能满足制备褐藻胶寡糖的需求。目前，已有很多褐藻胶裂解酶被克隆表达，其表达量、酶活力较原始酶均有所提升，但其酶学性质，如热稳定性、酶活力仍需进一步提升。在工业制备褐藻胶寡糖时，提高酶的热稳定性可以减少酶的用量，提高酶解效率，增加寡糖得率。因此，寻找酶学性质优且可高效降解褐藻胶的褐藻胶裂解酶仍是研究者关注的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶，以及应用该酶来制备褐藻胶寡糖的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的褐藻胶裂解酶D59C-A267C，其氨基酸序列为MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPICGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYCLEQSHD(SEQ ID NO:3)；

编码基因序列如下：

ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTCGTACTGTCTGCTTGTATTGCCAGTGCCAACGCAGACAACAATGGCGATGGCAAGGCCGACTCCATCAAGGAAAATGACCTGAATGCAGGCTATGCAGATGGCACCTACTTCTATACTGCTGCCGATGGCGGCATGGTGTTCCGCTGCCCGATCTGTGGCTATAAAACATCGACCAACACGTCCTATACCCGCACCGAGCTGCGCGAGATGCTACGTCGTGGCGACACCAGCATTGCCACCCAGGGGGTCAATGGAAACAACTGGGTATTCGGCTCCGCACCCGCTTCGGCACGTGAAGCAGCCGGCGGTGTCGACGGTGTTTTACGCGCAACCCTCGCGGTAAACCATGTCACCACTACCGGAGATAGCGGCCAGGTTGGACGGGTGATTGTTGGACAGATTCACGCCAACAACGACGAACCGCTGCGTCTTTACTACCGCAAGTTACCGGGCCACAGCAAAGGTTCTGTGTATATCGCCCATGAGCCAAACGGCGGCAGCGACAGCTGGTACGACATGATTGGCAGCCGTTCCAGCAGCGCCTCGGACCCGTCCGACGGTATCGCACTGGATGAAGTCTGGAGCTACGAGGTCAAGGTTGTCGGTAACACCCTCACCGTGACCATCTTCCGTGCTGGTAAAGACGATGTGGTACAGGTTGTGGATATGGGCAACAGCGGTTACGACGTCGCCGACCAGTACCAGTACTTCAAGGCCGGGGTGTACAACCAGAACAACACCGGCAATGCCAGTGACTATGTCCAGGTGACCTTCTACTGCCTGGAGCAGTCGCACGATTAA(SEQ IDNO:4)；

本发明还提供的另一种褐藻胶裂解酶G60C-T70C，其氨基酸序列为MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDCYKTSTNTSYCRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD(SEQ ID NO5)；

编码基因的序列如下：

ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTCGTACTGTCTGCTTGTATTGCCAGTGCCAACGCAGACAACAATGGCGATGGCAAGGCCGACTCCATCAAGGAAAATGACCTGAATGCAGGCTATGCAGATGGCACCTACTTCTATACTGCTGCCGATGGCGGCATGGTGTTCCGCTGCCCGATCGATTGCTATAAAACATCGACCAACACGTCCTATTGCCGCACCGAGCTGCGCGAGATGCTACGTCGTGGCGACACCAGCATTGCCACCCAGGGGGTCAATGGAAACAACTGGGTATTCGGCTCCGCACCCGCTTCGGCACGTGAAGCAGCCGGCGGTGTCGACGGTGTTTTACGCGCAACCCTCGCGGTAAACCATGTCACCACTACCGGAGATAGCGGCCAGGTTGGACGGGTGATTGTTGGACAGATTCACGCCAACAACGACGAACCGCTGCGTCTTTACTACCGCAAGTTACCGGGCCACAGCAAAGGTTCTGTGTATATCGCCCATGAGCCAAACGGCGGCAGCGACAGCTGGTACGACATGATTGGCAGCCGTTCCAGCAGCGCCTCGGACCCGTCCGACGGTATCGCACTGGATGAAGTCTGGAGCTACGAGGTCAAGGTTGTCGGTAACACCCTCACCGTGACCATCTTCCGTGCTGGTAAAGACGATGTGGTACAGGTTGTGGATATGGGCAACAGCGGTTACGACGTCGCCGACCAGTACCAGTACTTCAAGGCCGGGGTGTACAACCAGAACAACACCGGCAATGCCAGTGACTATGTCCAGGTGACCTTCTACGCCCTGGAGCAGTCGCACGATTAA(SEQ IDNO:6)。

本发明另一个方面还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体中插入了上述的编码基因核酸片段。

本发明还提供一种基因工程菌，是用于重组表达上述的突变酶。

本发明所提供的突变酶用于制备褐藻胶寡糖。

本发明还提供一种制备褐藻胶寡糖的方法，包括如下的步骤：

1)底物配制：将褐藻胶原料与水混合，配制成浓度为2％-8％、pH为7.0-8.0的酶解底物溶液；

2)分步酶解：加入褐藻胶裂解酶，于50-65℃下搅拌酶解1-2h，再次加入0.5％-2％的褐藻胶裂解酶，搅拌酶解，总酶解时间为2-4h；

3)低聚糖制备：酶解结束后，过滤或离心，上清液浓缩、冷冻干燥得到海藻低聚糖。

本发明利用基因改造的重组褐藻胶裂解酶，定向制备褐藻胶寡糖，与现有酸法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，克服了破坏性大的缺点，与现有的酶法水解制备褐藻胶寡糖的方法相比，运用改造的重组褐藻胶裂解酶，可减少加酶量、缩短酶解时间、提高酶解效率。本发明的酶具有高酶活力和高热稳定性，更适合应用于工业上酶解褐藻胶制备褐藻胶寡糖。所制备的褐藻胶寡糖有抗肿瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效，可用于食品及保健品领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：原始酶cAlyM及其突变体的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为突变酶D59C-A267C；泳道2为突变酶G60C-T70C；

图2：原始酶cAlyM及其突变体D59C-A267C、G60C-T70C酶的最适反应温度(左图)、最适反应pH(右图)；

图3：原始酶cAlyM及其突变体D59C-A267C、G60C-T70C在45℃下的热稳定性图；

图4：45℃(左图)50℃(右图)条件下X33-cAlyM和X33-D59C-A267C的热稳定性图；

图5：酶解产物质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：构建突变体及其在大肠杆菌中的表达

为了提高褐藻胶裂解酶的热稳定性和活性，申请人对如下氨基酸序列的原始褐藻胶裂解酶进行改造：

MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD(SEQ ID NO:1)

原始褐藻胶裂解酶，其编码基因的核苷酸序列如下：

ATGAAAGTAAGTTGCGCTGTCGTACTGTCTGCTTGTATTGCCAGTGCCAACGCAGACAACAATGGCGATGGCAAGGCCGACTCCATCAAGGAAAATGACCTGAATGCAGGCTATGCAGATGGCACCTACTTCTATACTGCTGCCGATGGCGGCATGGTGTTCCGCTGCCCGATCGATGGCTATAAAACATCGACCAACACGTCCTATACCCGCACCGAGCTGCGCGAGATGCTACGTCGTGGCGACACCAGCATTGCCACCCAGGGGGTCAATGGAAACAACTGGGTATTCGGCTCCGCACCCGCTTCGGCACGTGAAGCAGCCGGCGGTGTCGACGGTGTTTTACGCGCAACCCTCGCGGTAAACCATGTCACCACTACCGGAGATAGCGGCCAGGTTGGACGGGTGATTGTTGGACAGATTCACGCCAACAACGACGAACCGCTGCGTCTTTACTACCGCAAGTTACCGGGCCACAGCAAAGGTTCTGTGTATATCGCCCATGAGCCAAACGGCGGCAGCGACAGCTGGTACGACATGATTGGCAGCCGTTCCAGCAGCGCCTCGGACCCGTCCGACGGTATCGCACTGGATGAAGTCTGGAGCTACGAGGTCAAGGTTGTCGGTAACACCCTCACCGTGACCATCTTCCGTGCTGGTAAAGACGATGTGGTACAGGTTGTGGATATGGGCAACAGCGGTTACGACGTCGCCGACCAGTACCAGTACTTCAAGGCCGGGGTGTACAACCAGAACAACACCGGCAATGCCAGTGACTATGTCCAGGTGACCTTCTACGCCCTGGAGCAGTCGCACGATTAA(SEQ IDNO:2)。

对原始酶的位点做进一步分析后，选取第59位、60位、70位、267位氨基进行突变。在SEQ ID NO:2的编码基因的序列上，以突变碱基为中心，左右各选择10-15个碱基作为正向引物序列，反向引物序列与其完全反向互补。使用DNAMAN 6.0验证引物的质量。引物设计结果如下：

D59C-F GCTGCCCGATCTGTGGCTATAAAAC、

D59C-R GTTTTATAGCCACAGATCGGGCAGC、

A267C-F CACCGGCAATTGCAGTGACTATGTC、

A267C-R GACATAGTCACTGCAATTGCCGGTG、

G60C-F GCCCGATCGATTGCTATAAAACATCG、

G60C-R CGATGTTTTATAGCAATCGATCGGGC、

T70C-F CACGTCCTATTGCCGCACCGAGCTG、

T70C-R CAGCTCGGTGCGGCAATAGGACGTG；

用细菌质粒小提试剂盒提取包含有SEQ ID NO:2的编码基因片段的DH5α-HTa-cAlyM的质粒，置于超低温冰箱长期保存，用作PCR的模板。利用突变引物扩增质粒全长，

扩增体系的组成如下：

扩增条件如下：

通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增结果，扩增产物用DpnⅠ消化，消化体系如下，消化时间为3h。

将DpnⅠ消化产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，37℃过夜培养，每个突变体挑选3-5个重组菌，送至公司测序。提取测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，于37℃过夜培养。挑选阳性重组菌于含有100μg/mL AMP的LB培养基中37℃过夜培养，以此为种子液接种至发酵培养基，并诱导表达。发酵液离心，收集上清作为粗酶，将沉淀的细胞悬浮于100mM pH7.0的磷酸盐缓冲液中，超声破碎获得胞内酶。

将胞外粗酶液过0.22μm滤膜，用Ni-NTA亲和层析柱(1.6×5cm)进行纯化，收集各阶段的洗脱峰，用12％的SDS-PAGE检测纯化程度同时验证分子量。电泳结果显示，纯化后得到了单一条带，且突变体与原始酶的分子量一致，均为35Kda(图1)。

配制溶于50mM、pH＝7.0的磷酸缓冲液的海藻酸钠底物，在不同温度(40-60℃)下测定重组酶的酶活力以确定重组酶的最适反应温度。

将海藻酸钠分别溶于50mM、柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)、磷酸缓冲液(pH＝6.0–8.0)和甘氨酸缓冲液(pH＝9.0)，以此为底物，在最适温度下测定重组酶的酶活力以确定重组酶的最适反应pH；将纯化后的突变酶在45℃下温育6h，并分别在0.5h、1h、2h、3h和6h取样检测残余酶活力，以确定酶的热稳定性。

结果表明突变体D59C-A267C(氨基酸序列为SEQ ID NO:3，编码基因序列为SEQ IDNO:4)和突变体G60C-T70C(氨基酸序列为SEQ ID NO:5，编码基因序列为SEQ ID NO:6)的最适反应温度为55℃，与原始酶一致，而最适反应pH为8.0，高于原始酶7.0(图2)。

在同样的反应条件下，突变体D59C-A267C的胞内酶活力是原始酶的3.1倍，总酶活力是原始酶的2.6倍。

将原始酶、突变体D59C-A267C和突变体G60C-T70C酶在45℃水浴中孵育，结果显示原始酶在45℃下的半衰期(t1/2，45℃)为1.90h，突变体D59C-A267C酶和G60C-T70C酶的t1/2，45℃分别为4.15和3.06h(图3)。

实施例2：重组酶在毕赤酵母中的表达

以质粒HTa-cAlyM和HTa-D59C-A267C为模板，设计引物扩增原始酶和改造酶的基因，引物如下：

EcoR Ⅰ-F:5’-agagaggctgaagctgaattcATGAAAGTAAGTTGCGCTGTC-3’

Not Ⅰ-R:5’-tgttctagaaagctggcggccgcTTAATCGTGCGACTGCTCCAG-3’

扩增体系如下：

扩增条件如下：

PCR扩增结束后，用浓度1％的琼脂糖凝胶电泳验证，判断PCR产物条带大小长度是否与目的长度相符，随后用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。将实验室保存的pPICZαA空质粒使用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，37℃水浴保温1-3h，80℃灭活20min。酶切体系如下：

用ⅡOne Step Cloning Kit将目的基因与线性化载体进行重组连接，37℃反应30min，完成后将重组产物立即置于冰上冷却。

20μL重组反应体系如下：

取20μL重组质粒加入至100μL E.coli DH5α感受态细胞中，轻轻混匀并于冰上放置30min。42℃水浴热激45-60s后，立即置于冰上冷却3min。加入900μL无抗LLB培养基，置于37℃、180r/min的摇床震荡培养45min。复苏结束后，在LLB平板(含25μg/mL Zeocin)上进行涂布，37℃恒温培养16h。挑取单菌落进行菌落PCR验证，将阳性菌落PCR产物送样测序，选择测序结果正确的菌落，用质粒提取试剂盒提取重组质粒pPICZαA-cAlyM和pPICZαA-D59C-A267C。

重组载体用限制性内切酶SacⅠ对重组载体进行线性化处理，50μL线性化体系如下：

37℃水浴保温1-3h后，用PCR产物纯化试剂盒对酶切产物进行纯化。

取15μL线性化重组表达载体加入到100μL P.pastoris X33感受态细胞中，轻轻混匀并于冰上静置10min，转移至预冷电转杯进行电转化，电转化条件为2.00KV、1pulse。电转化结束后立即加入1mL预冷1mol/L山梨醇，吹打混匀后转移至灭菌1.5mL EP管中，30℃恒温孵育1h。复苏结束后，在YPDS平板(含100μg/mL博莱霉素)上涂布，30℃恒温培养2-3d。从平板上随机挑选毕赤酵母单菌落，接种于20mL的YPD液体培养基，30℃、200r/min振荡培养24h。取1mL菌液至20mL BMGY液体培养基，30℃、200r/min振荡培养，每隔24h添加1％的甲醇进行诱导，共诱导3次。诱导完成后，取菌液4℃、5000r/min离心10min后，上清液作为粗酶液测定酶活，挑选酶活力较高的菌株分别命名为X33-cAlyM和X33-D59C-A267C。

用DNS法测酶活，X33-cAlyM和X33-D59C-A267C粗酶液比活力分别为268.7和349.6U/mg。

将酶孵育在45℃和50℃下检测酶的热稳定性，45℃水浴处理X33-cAlyM和X33-D59C-A267C的半衰期分别为2.0h和5.2h，突变体半衰期为原始酶的2.6倍；50℃水浴处理X33-cAlyM和X33-D59C-A267C的半衰期分别为0.3h和3.5h，突变体半衰期为原始酶的11.7倍。

实施例3：制备褐藻胶寡糖

将褐藻胶溶于由NaOH调节的pH＝7.5的水中，配制200mL浓度为6％的褐藻胶溶液，加入0.6mL或0.8mL重组褐藻胶裂解酶D59C-A267C或cAlyM，于50℃温浴搅拌酶解1.5h，再加入0.2mL或0.6mL重组褐藻胶裂解酶D59C-A267C或cAlyM，继续于50℃温浴搅拌酶解1h。酶解液经8000rpm离心10min，去除渣子，上清液即酶解产物。

褐藻胶裂解酶D59C-A267C酶解产物经4倍醇沉，得到目标产物，目标产物经旋转蒸发、冷冻干燥后得到褐藻胶寡糖粗品，得率为84.3％；用ESI-MS测定低聚糖聚合度，ESI-MS图谱显示，酶解终产物主要为二糖、三糖和四糖。而原始酶cAlyM的褐藻胶寡糖粗品得率为69.5％。结果表明本发明的突变酶相比于原始酶具有更高的酶解效率，且酶的用量大大减少。

序列表

<110> 中国海洋大学中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120> 一种具有更好热稳定性和高酶活力的褐藻胶裂解酶

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 5

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Lys Val Ser Cys Ala Val Val Leu Ser Ala Cys Ile Ala Ser Ala

1 5 10 15

Asn Ala Asp Asn Asn Gly Asp Gly Lys Ala Asp Ser Ile Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Asp Gly Thr Tyr Phe Tyr Thr Ala Ala

35 40 45

Asp Gly Gly Met Val Phe Arg Cys Pro Ile Asp Gly Tyr Lys Thr Ser

50 55 60

Thr Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Arg

65 70 75 80

Gly Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Gly Asn Asn Trp Val

85 90 95

Phe Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ala Gly Gly Val Asp

100 105 110

Gly Val Leu Arg Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Gly

115 120 125

Asp Ser Gly Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly Gln Ile His Ala Asn

130 135 140

Asn Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly His Ser

145 150 155 160

Lys Gly Ser Val Tyr Ile Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp Ser

165 170 175

Trp Tyr Asp Met Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro Ser

180 185 190

Asp Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Trp Ser Tyr Glu Val Lys Val Val

195 200 205

Gly Asn Thr Leu Thr Val Thr Ile Phe Arg Ala Gly Lys Asp Asp Val

210 215 220

Val Gln Val Val Asp Met Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Val Ala Asp Gln

225 230 235 240

Tyr Gln Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly Asn

245 250 255

Ala Ser Asp Tyr Val Gln Val Thr Phe Tyr Ala Leu Glu Gln Ser His

260 265 270

Asp

<210> 6

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgaaagtaa gttgcgctgt cgtactgtct gcttgtattg ccagtgccaa cgcagacaac 60

aatggcgatg gcaaggccga ctccatcaag gaaaatgacc tgaatgcagg ctatgcagat 120

ggcacctact tctatactgc tgccgatggc ggcatggtgt tccgctgccc gatcgatggc 180

tataaaacat cgaccaacac gtcctatacc cgcaccgagc tgcgcgagat gctacgtcgt 240

ggcgacacca gcattgccac ccagggggtc aatggaaaca actgggtatt cggctccgca 300

cccgcttcgg cacgtgaagc agccggcggt gtcgacggtg ttttacgcgc aaccctcgcg 360

gtaaaccatg tcaccactac cggagatagc ggccaggttg gacgggtgat tgttggacag 420

attcacgcca acaacgacga accgctgcgt ctttactacc gcaagttacc gggccacagc 480

aaaggttctg tgtatatcgc ccatgagcca aacggcggca gcgacagctg gtacgacatg 540

attggcagcc gttccagcag cgcctcggac ccgtccgacg gtatcgcact ggatgaagtc 600

tggagctacg aggtcaaggt tgtcggtaac accctcaccg tgaccatctt ccgtgctggt 660

aaagacgatg tggtacaggt tgtggatatg ggcaacagcg gttacgacgt cgccgaccag 720

taccagtact tcaaggccgg ggtgtacaac cagaacaaca ccggcaatgc cagtgactat 780

gtccaggtga ccttctacgc cctggagcag tcgcacgatt aa 822

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Val Ser Cys Ala Val Val Leu Ser Ala Cys Ile Ala Ser Ala

1 5 10 15

Asn Ala Asp Asn Asn Gly Asp Gly Lys Ala Asp Ser Ile Lys Glu Asn

20 25 30

Asp Leu Asn Ala Gly Tyr Ala Asp Gly Thr Tyr Phe Tyr Thr Ala Ala

35 40 45

Asp Gly Gly Met Val Phe Arg Cys Pro Ile Cys Gly Tyr Lys Thr Ser

50 55 60

Thr Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Thr Glu Leu Arg Glu Met Leu Arg Arg

65 70 75 80

Gly Asp Thr Ser Ile Ala Thr Gln Gly Val Asn Gly Asn Asn Trp Val

85 90 95

Phe Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ala Arg Glu Ala Ala Gly Gly Val Asp

100 105 110

Gly Val Leu Arg Ala Thr Leu Ala Val Asn His Val Thr Thr Thr Gly

115 120 125

Asp Ser Gly Gln Val Gly Arg Val Ile Val Gly Gln Ile His Ala Asn

130 135 140

Asn Asp Glu Pro Leu Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys Leu Pro Gly His Ser

145 150 155 160

Lys Gly Ser Val Tyr Ile Ala His Glu Pro Asn Gly Gly Ser Asp Ser

165 170 175

Trp Tyr Asp Met Ile Gly Ser Arg Ser Ser Ser Ala Ser Asp Pro Ser

180 185 190

Asp Gly Ile Ala Leu Asp Glu Val Trp Ser Tyr Glu Val Lys Val Val

195 200 205

Gly Asn Thr Leu Thr Val Thr Ile Phe Arg Ala Gly Lys Asp Asp Val

210 215 220

Val Gln Val Val Asp Met Gly Asn Ser Gly Tyr Asp Val Ala Asp Gln

225 230 235 240

Tyr Gln Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn Asn Thr Gly Asn

245 250 255

Ala Ser Asp Tyr Val Gln Val Thr Phe Tyr Cys Leu Glu Gln Ser His

260 265 270

Asp

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaagtaa gttgcgctgt cgtactgtct gcttgtattg ccagtgccaa cgcagacaac 60

aatggcgatg gcaaggccga ctccatcaag gaaaatgacc tgaatgcagg ctatgcagat 120

ggcacctact tctatactgc tgccgatggc ggcatggtgt tccgctgccc gatctgtggc 180