一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用
阅读说明：本技术 一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用 (Application of berberine in preparation of medicine for influencing bone metabolism ) 是由 宁光 张志国 姚霜霜 方钱华 香敏琪 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用,小檗碱可减少骨骼肌中异位脂质沉积,增强线粒体功能,提高机体基础代谢率。(The invention relates to an application of berberine in preparing a medicine for influencing skeletal metabolism, which can reduce ectopic lipid deposition in skeletal muscle, enhance mitochondrial function and improve basal metabolic rate of an organism.)
技术领域
本发明属于小檗碱的应用领域，特别涉及一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用。
背景技术
骨骼肌是调控全身糖脂代谢的重要器官。研究表明餐后人体内大部分葡萄糖经胰岛素刺激后在骨骼肌进行转化代谢，主要通过糖酵解途径和三羧酸循环途径分解代谢产生ATP为机体提供能量，其余则以糖原的形式储存在肝脏和骨骼肌中，在饥饿状态时为机体供应血糖。当血液中的葡萄糖升高时，在胰岛素的作用下骨骼肌可快速摄取葡萄糖，以维持血糖的稳定。因此，骨骼肌在能量代谢调节中极为重要。
小檗碱(berberine，BBR)又名为黄连素，因其抗感染作用在临床上广泛用于治疗腹泻等消化道感染性疾病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用。
本发明的一种小檗碱在制备影响骨骼代谢药物中的应用。
所述小檗碱促进PGC1a转录因子的表达。
所述小檗碱配以药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂使用。
所述制剂选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、缓释剂中的一种。
有益效果
本发明中探索小檗碱对骨骼肌异位脂质沉积和骨骼肌细胞线粒体功能的影响，通过对db/db肥胖小鼠和C2C12细胞进行小檗碱干预处理，观察小檗碱对骨骼肌能量代谢的影响。实验结果显示小檗碱可降低骨骼肌甘油三酯含量，增加骨骼肌细胞线粒体数量，增强线粒体功能。通过分子生物学分析，实验结果表明小檗碱可通过AMPK途径促进PGC1a转录因子的表达。同时，实验结果显示小檗碱可增加C2C12细胞最大耗氧率，表明小檗碱能增强线粒体氧化功能。本发明结果证明小檗碱可减少骨骼肌中异位脂质沉积，增强线粒体功能，提高机体基础代谢率。
附图说明
图1为小檗碱影响db/db小鼠能量代谢相关指标；其中(a)两组小鼠体重变化。(b)小鼠血清甘油三酯含量。(c)小鼠肌肉组织甘油三酯含量。
图2为小檗碱增加db/db小鼠骨骼肌中线粒体的数量；(a)腓肠肌透射电镜结果。(b)腓肠肌中线粒体DNA拷贝数。(c)腓肠肌柠檬酸合成酶活性。
图3为小檗碱增加骨骼肌中能量代谢和线粒体生成相关基因和蛋白的表达。(a)骨骼肌线粒体生成相关基因的表达。(b)骨骼肌线粒体功能相关基因的表达。(c)骨骼肌脂肪酸氧化相关基因的表达。(d)骨骼肌线粒体生成及能量代谢相关蛋白的表达。
图4为小檗碱增加C2C12细胞中线粒体数量。(a)C2C12细胞中线粒体染料mito-track green染色结果。(b)细胞中线粒体含量。(c)细胞中线粒体DNA拷贝数。(d)细胞中柠檬酸合成酶活性。
图5为小檗碱通过PGC1α影响线粒体数量和能量代谢。(a)C2C12细胞中PGC1α基因表达。(b)C2C12细胞中PGC1α蛋白表达。(c)siRNA-PGC1α的干扰效率验证。(d)C2C12细胞中线粒体生成及功能相关基因的表达。
图6为小檗碱依赖AMPK促进PGC1α的表达(a)C2C12细胞中AMPK、PGC1α等蛋白的表达。(b)C2C12细胞中线粒体DNA拷贝数。(c)PGC1α启动子的活性。(d)细胞中线粒体DNA拷贝数。(e)细胞中柠檬酸合成酶活性。
上述附图中的实验数据用均数±标准误表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
(1)遗传缺陷肥胖小鼠是8周龄、雄性、健康SPF级B6.BKS(D)Leprdb/JNju(db/db)小鼠，购自南京大学模式动物研究所。小鼠饲养于上海交通大学医学院的内分泌研究所动物房，采用普通饲料(65％碳水化合物，22％蛋白质，5％脂肪，8％纤维素，热量3.3kcal/g)喂养，不限制饮水和摄食量。环境温度为恒温22℃，12小时光照周期(8:00-20:00光照，20:00-8:00黑暗)
(2)超声仪超声处理1％体积DMSO 15分钟；加入20％体积聚乙二醇(PEG)，继续超声处理15分钟；再加入79％体积生理盐水，超声处理15分钟，并将此溶液作为对照溶剂(Vehicle)；小檗碱溶于上述溶液中，经搅拌混匀制成BBR混悬液。
实施例1
20只db/db小鼠饲养在上海交通大学医学院的内分泌研究所动物房，环境温度设置为22℃，12小时照明，12小时黑暗，待db/db小鼠适应性饲养1周后，将其随机分组，并按体重进行校准。分组后对小鼠进行小檗碱干预。每天记录小鼠的体重和进食量，注射后第3周对小鼠行胰岛素耐量试验(Insulin Tolerance Test,ITT)，第4周行丙酮酸耐量试验(Pyruvate Tolerance Test,PTT)。再过1周后，于取材前一天17点撤去饲料，更换垫料(避免垫料中残存的饲料)，使小鼠禁食16小时，麻醉后处死小鼠，收集小鼠全血，并快速剪取肝脏，腓肠肌，腹股沟脂肪，附睾脂肪等组织并称重，之后选择部分组织放入有4％多聚甲醛的EP管中，固定24小时后做HE染色。剩余组织放入液氮中进行预冷，之后存放于-80℃冰箱长期保存。
然后进行后续电镜组织形态观察；骨骼肌TG含量检测；线粒体mito-track green染色；线粒体DNA拷贝数检测；柠檬合成酶CS活性检测；C2C12细胞培养；质粒扩增、抽提、双荧光素酶报告基因。
1.小檗碱对db/db小鼠能量代谢影响
对小鼠进行给药小檗碱后，记录小鼠体重变化，发现小檗碱组小鼠体重低于对照组小鼠，且随给药时间延长，体重差异逐渐变大(图1a)。小檗碱干预4周后，小檗碱组小鼠血清甘油三酯含量明显低于对照组小鼠(图1b)，肌肉组织中甘油三酯含量也明显低于对照组小鼠(图1c)，差异具有统计学意义。
2.小檗碱对db/db小鼠骨骼肌中线粒体的数量影响
小檗碱对骨骼肌中线粒体的影响。骨骼肌的电镜结果显示，小檗碱组小鼠腓肠肌中的线粒体数量明显增多(图2a)。同时检测线粒体DNA拷贝数，以观察小檗碱对骨骼肌线粒体的影响，发现小檗碱组骨骼肌线粒体DNA的拷贝数明显增加(图2b)。为检测骨骼肌线粒体的功能，对柠檬酸合成酶(CS)活性进行检测，发现与对照组小鼠相比，小檗碱组小鼠柠檬酸合成酶活性明显增强(图2c)。
3.小檗碱增加骨骼肌中能量代谢和线粒体生成相关因子的表达
对腓肠肌组织的RNA进行real time PCR分析，结果显示与对照组小鼠相比，小檗碱组腓肠肌中PGC1α、NRF-1、ERRα、mtTFA等线粒体生成相关因子明显上调(图3a)，同时小檗碱组腓肠肌中CS、cyt C、UCP3等线粒体功能相关因子的表达明显上调(图3b)。另外，在检测小鼠骨骼肌中脂质代谢相关基因的表达时，发现与对照组相比，小檗碱组小鼠腓肠肌中FATP1、PTK4、ACOX1等脂肪酸氧化相关基因表达均上调(图3c)。
对腓肠肌组织中蛋白进行Western blot分析，结果显示，小檗碱组线粒体生成相关蛋白、线粒体功能相关蛋白以及脂肪酸氧化相关蛋白的表达均显著增加(图3d)。
4.小檗碱增加C2C12细胞中线粒体数量
在体外对C2C12骨骼肌细胞进行小檗碱干预处理，以验证其对骨骼肌线粒体的影响。线粒体染料mito-track green染色结果显示小檗碱干预后细胞中线粒体数量明显高于对照组，其中AMPK特异性激动剂(AICAR)和白藜芦醇(RSV)均被证实可促进线粒体生成，在此实验中作为阳性对照(图4a)。同时，对细胞中线粒体含量、线粒体DNA拷贝数和柠檬酸合成酶活性进行检测，发现与对照组相比，小檗碱干预组均明显升高(图4b，4c，4d)。
5.小檗碱通过PGC1α影响线粒体数量和功能
PGC1α参与调控线粒体生成和功能，并起关键作用。在上述小鼠腓肠肌组织分析的结果中可发现，与对照组小鼠相比，小檗碱组PGC1α基因与蛋白表达均增加(图3a，3d)。同时对C2C12细胞进行PGC1α检测，结果显示PGC1α基因表达上调，PGC1α蛋白表达上调，且与阳性对照组上调程度相似(图5a，5b)。
为验证PGC1α的作用，使用小干扰RNA(siRNA)抑制C2C12细胞中PGC1α的表达，以观察对线粒体的影响。首先验证了siRNA-PGC1α的干扰效率(图5c)，然后检测C2C12细胞线粒体生成(mtTFA、NRF-1)，线粒体功能(cytC、COXIV)及能量代谢(PDK4、CPT1β)等相关基因表达，发现PGC1α的表达受到抑制后，小檗碱不能上调线粒体相关基因的表达(图5d)。
6.小檗碱依赖AMPK促进PGC1α的表达
利用腺病毒介导作用，构建两种AMPK突变型(K45R和K157A)以阻断C2C12细胞中的AMPK活性，结果显示PGC1α蛋白表达明显减少，且小檗碱无法促进PGC1α的表达(图6a)。进一步检测线粒体DNA的拷贝数，发现AMPK活性被阻断后，小檗碱不能增加C2C12细胞线粒体DNA的拷贝数(图6b)，说明在C2C12细胞中，小檗碱激活AMPK而上调PGC1α的表达，进而促进骨骼肌中线粒体的生成及功能。
小檗碱通过激活AMPK进而促进PGC1α的表达，为此分别构建两种报告基因质粒，含有野生型PGC1α启动子的过表达质粒和AMPK特异性磷酸化位点突变失活的PGC1α启动子的过表达质粒(PGC1α-2A)。双荧光素酶报告基因结果显示，C2C12细胞中小檗碱促进PGC1α基因表达，过表达PGC1α质粒可明显增强自身基因表达(图6c)。对C2C12细胞加入过表达PGC1α质粒的同时加以小檗碱处理，结果显示PGC1α基因表达比单独加入过表达PGC1α质粒更明显增强，提示小檗碱除了直接作用于PGC1α启动子，还存在间接作用(图6c)。而在C2C12细胞中加入AMPK特异性磷酸化位点突变的质粒时，小檗碱不能促进PGC1α基因的表达(图6c)。同时，检测C2C12细胞在上述两种过表达质粒的干预下，小檗碱对线粒体生成的功能的影响，结果显示线粒体DNA拷贝数以及柠檬酸合成酶活性与PGC1α基因表达趋势一致(图6d，6e)。
综上，小檗碱可改善骨骼肌脂质沉积，并促进线粒体生成及功能，可使与能量代谢密切相关的因子表达增加。小檗碱通过AMPK和PGC1α调节线粒体生成和功能，为临床治疗骨骼代谢药物提供了理论依据。