一种检测mcr基因的试剂盒、检测方法及其应用
阅读说明：本技术 一种检测mcr基因的试剂盒、检测方法及其应用 (Kit for detecting MCR gene, detection method and application thereof ) 是由 胡双芳 柯跃斌 吕子全 彭长凤 项秋梅 汪洋 沈建忠 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测MCR基因的试剂盒、检测方法及其应用。该试剂盒包括如下的5组引物对,SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:9所示的引物对。本发明将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7后,不仅通过HRM法完成细小的差异的区分分型,还有效的简化了多重PCR体系,能达到良好的扩增效果；同时对于混合有mcr-1和mcr-3的临床样品采用本发明的多重PCR试剂盒也能够快速有效地检测及鉴别。弥补了目前市面上还没有出现实现临床样本中所有MCR基因的有效分型与检测的多重PCR试剂盒的空白,特别是能有效鉴别分型mcr-8和mcr-10功能的多重PCR试剂盒的空白。(The invention discloses a kit for detecting MCR gene, a detection method and application thereof. The kit comprises 5 groups of primer pairs as shown in SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2, primer pairs as shown in SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4, primer pairs as shown in SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6, primer pairs as shown in SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 8 and primer pairs as shown in SEQ ID No. 7 and SEQ ID No. 9. The invention is to mcr‑8 And mcr‑10 after the specific primer pair of (1) adopts a unified pre-primer sequence SEQ ID No. 7, not only the differential typing of small differences is completed by an HRM method, but also a multiple PCR system is effectively simplified, and a good amplification effect can be achieved; at the same time as for mixing mcr‑1 And mcr‑3 the clinical samples can be quickly and effectively detected and identified by adopting the multiplex PCR kit. Makes up for the fact that the effective typing and detection of all MCR genes in clinical samples do not appear in the market at presentBlanks of the multiplex PCR kit, in particular for efficient differential typing mcr‑8 And mcr‑10 blank for functional multiplex PCR kit.)
技术领域
本发明属于医疗卫生以及微生物检测领域，特别涉及了一种检测MCR基因的试剂盒、检测方法及其应用。
背景技术
多黏菌素（polymyxin）是发现于多黏类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）培养液中的抗菌性多肽，有A、B、C、D、E等五种，其中多黏菌素E（colistin）和多黏菌素B（PMB）是临床中最常用的两种多黏菌素。由于其存在一定的神经毒性，在临床上的使用受到严格限制，但在亚洲、欧洲和北美，多黏菌素广泛应用于禽畜养殖业中。
近几年在临床、养殖厂、动物性食物、甚至健康人群样本中，均发现对多黏菌素耐药的可转移性耐药性MCR（mobile colistin resistance）基因。自mcr-1首次报道以来，已在临床和环境样本中多次发现，全世界范围内共有10类MCR基因（mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr- 4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8、mcr-9、mcr-10）被报道发现，且每个基因可能含有多个基因变异类型，其中mcr-1已发现多达30种基因变异类型。由于多黏菌素在养殖业中的广泛使用，使得多粘菌素耐药基因通过动物性食品到人群的食物链进入到健康人群体中。MCR基因的可转移性、高携带率和大范围分布引起社会极大的关注和不安。多粘菌素耐药的肠杆菌科细菌在医学临床不断出现并流行传播，成为全球卫生工作者的关注热点。
然而目前在临床样本中发现的只有mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10单独存在的样本，以及mcr-1和mcr-3同时存在的样本，说明部分MCR基因型尚不具备在人群中传播的能力，而携带了在临床中流行的MCR类型的“超级细菌”严重威胁了多黏菌素作为临床治疗中“最后一道防线”的作用。但是，对于MCR基因临床的检测预警以及具体分型，传统的微生物培养法和药敏试验法因耗时长、繁琐的操作过程、对仪器设备要求高等原因未能在临床上大规模推广使用。因此，寻找一种能有效鉴别携带各种MCR基因的“超级细菌”的方法迫在眉睫，同时临床上对能快速鉴别与监测目前在临床中流行的高危型MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的检测方法尤为重要。
发明内容
本发明的首要目的在于，提供一种检测可移动多黏菌素耐药性MCR基因的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的方法。
本发明的又一目的在于提供一种如上述的检测MCR基因的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的应用。
本发明的还一目的在于提供一种用于检测及鉴别临床样品中MCR基因分型的多重PCR引物组。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
第一方面，一种检测MCR基因的试剂盒，其包括如下的5组引物对，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对、SEQ ID No:5和SEQID No:6所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQ ID No:7和SEQID No:9所示的引物对。
作为本发明提供的所述的检测MCR基因的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光染料EvaGreen以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
作为本发明提供的所述的检测MCR基因的试剂盒的一种优选实施方式，所述试剂
盒为20~50μL荧光PCR反应体系的试剂盒，各组分及其含量如下：
PCR反应体系 组分 终浓度 PCR缓冲液 1× Mg<sup>2＋</sup>浓度 2.0mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.15mmol/L Taq酶 2U 20×EvaGreen荧光染料 1× SEQ ID No:1所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:2所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:3所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:4所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:5所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:6所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:7所示引物 0.20μmol/L SEQ ID No:8所示引物 0.10μmol/L SEQ ID No:9所示引物 0.10μmol/L DNA模板 2μL 补水至 20~50μL
第二方面，一种非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的方法，其包括下述步骤：
（1）提取待测样品中的DNA；
（2）分别配置具有如上述5组引物对的PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板加入到PCR反应体系中，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测；当PCR反应体系的实际溶解曲线Tm值与任一种类MCR基因的标准溶解曲线Tm值相符时，则待测样品具有MCR基因；其中所述任一种类MCR基因是指mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10基因的任一种类。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的方法的一种优选实施方式，步骤（1）具体包括如下步骤：取20μL待测样品，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200μL，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的方法的一种优选实施方式，所述试剂盒还包括：2×PCR缓冲液、Taq酶、dNTP、MgCl2、荧光染料EvaGreen以及FTA试纸片、10%SDS溶液、TE缓冲液。
作为本发明提供的所述的非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的方法的一种优
选实施方式，所述PCR反应体系为20~50μL荧光PCR反应体系，各组分及其含量如下：
PCR反应体系 组分 终浓度 PCR缓冲液 1× Mg<sup>2＋</sup>浓度 2.0mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.15mmol/L Taq酶 2U 20×EvaGreen荧光染料 1× SEQ ID No:1所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:2所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:3所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:4所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:5所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:6所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:7所示引物 0.20μmol/L SEQ ID No:8所示引物 0.10μmol/L SEQ ID No:9所示引物 0.10μmol/L DNA模板 2μL 补水至 20~50μL
第三方面，一种如上述的检测MCR基因的试剂盒在临床或环境监测中非疾病诊断和治疗用途的检测MCR基因的应用。
第四方面，一种用于检测及鉴别临床样品中MCR基因分型的多重PCR引物组，其包括：SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物对以及SEQ ID No:7和SEQ ID No:9所示的引物对。
作为本发明提供的所述的用于检测及鉴别临床样品中MCR基因分型的多重PCR引物组的一种优选实施方式，还包括如下的2组引物对，SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物对和SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的引物对。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）针对目前在临床样品中流行的MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的检测及鉴别分型的多重PCR检测技术，现有技术均没有相关的报道，而且当采用常规多重PCR检测方案（即分别设计mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的特异性引物对，引物均不同）检测临床样品时发现引物对之间存在相互干扰，使得扩增效率降低，无法得到有效的扩增曲线与溶解曲线，无法有效检测到样本中的产物，产物之间也无法区分的新的技术问题（见对比例1）。在HRM方法（高分辨熔解曲线分析）中通过引物的设计以透过熔解曲线Tm值的差异进而区别单个碱基的差异，故引物设计时技术人员均会选择相距较远的扩增片段，即在多重PCR的检测与分型中，设计上是尽量避开相似的片段序列，使得溶解曲线差异较大更容易区分。但本发明人反而采用相反的设计思路，利用这一原本引物设计上的难点，将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7，意外发现：将mcr-8与mcr-10的特异性引物对采用了统一的前引物序列SEQ ID No:7后，不仅通过HRM法（高分辨熔解曲线分析）完成细小的差异的区分分型，还有效的简化了多重PCR体系，能达到良好的扩增效果；同时对于混合有mcr-1和mcr-3的临床样品采用本发明的多重PCR试剂盒也能够快速有效地检测及鉴别。弥补了目前市面上还没有出现实现临床样本中所有MCR基因的有效分型与检测的多重PCR试剂盒的空白，特别是能有效鉴别分型mcr-8和mcr-10功能的多重PCR试剂盒的空白。
（2）本试剂盒应用于临床场景中，不仅能够有效检测出MCR基因，而且能够有效鉴别临床样品中流行的所有MCR基因类型，能快速地进行溯源，了解主要流行类型。
（3）本试剂盒特别适合于医疗临床监测场景中，能够快速简便有效的对粪便样本中的MCR基因进行检测预警，对PCR产物进行实时监测，将大大降低监测可移动性多粘菌素耐药基因的人力和物力消耗，简化日常生产生活中大批量的临床样品的抽检与监测，因此本试剂盒及其检测方法在医疗临床监测场景中具有较大的应用价值，也可应用到环境监测场景中监测预警危险度高的MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）。
（4）本发明提供的引物对于不含有mcr的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。
附图说明
图1为对NCBI数据库中46条MCR基因的SeqMan序列分析图；
图2为采用本发明试剂盒检测mcr-1（其特异性引物对为SEQ ID No:3所示引物、SEQ ID No:4所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-1)=84.8℃；
图3为采用本发明试剂盒检测mcr-3（其特异性引物对为SEQ ID No:5所示引物、SEQ ID No:6所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-2)=87.8℃；
图4为采用本发明试剂盒检测mcr-8（其特异性引物对为SEQ ID No:7所示引物、SEQ ID No:8所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-8)=88.2℃；
图5为采用本发明试剂盒检测mcr-10（其特异性引物对为SEQ ID No:7所示引物、SEQ ID No:9所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-10)=88.5℃；
图6为具有mcr-1、mcr-3的混合模板样本采用本发明试剂盒检测得到的溶解曲线；
图7为具有mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的混合模板样本采用本发明试剂盒检测得到的溶解曲线；
图8为采用单重PCR检测mcr-8（其特异性引物对为SEQ ID No:10所示引物、SEQ IDNo:11所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-8)= 87.7℃；
图9为采用单重PCR检测mcr-10（其特异性引物对为SEQ ID No:12所示引物、SEQID No:13所示引物）得到的标准溶解曲线，包括三条阳性模板的溶解曲线，Tm(mcr-10)=75.1℃；
其中溶解曲线图的纵坐标为Derivative导数，具体为荧光强度的变化对温度的变化求导，即d(Fluorescence)/d(T)或d(荧光值)/d(温度)；横坐标为Temperature温度（℃），即溶解过程的每一个温度点。峰值处为溶解温度Tm。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、本发明试剂盒中的引物序列设计：通过分别对所有已知的临床样本中的MCR基因序列进行分析，对共59条基因采用SeqMan进行序列分析（图1），通过分析，找出高度保守的区段，通过premier 3.0选择无二级结构且高度保守的区段，设计多组引物，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列。引物列表1如下所示：
表1 引物与扩增片段序列列表（均为5'-3'）
目标基因 引物序列5’-3’ SEQ ID 产物长度（bp） 通用引物 F: 5’AGCTACGTACTCTGCGTGTGCTA-3’ 1 R: 5’GACGGTATTGACTGCTGTCTCG-3’ 2 <i>mcr-1</i> F:5’AGCACACGCAGAGTACGTAGCTCTCGTTGGCTTAGATGACT-3’ 3 <i>mcr-1:</i>216bp R: 5’CGAGACAGCAGTCAATACCGTCAAGTGCGAACATCAGTCC-3’ 4 <i>mcr-3</i> F:5’ATATGGGGAGAAAGGAGTTTGAT-3’ 5 <i>mcr-3:</i>207bp R:5’CACATGCTATGACGAGGTTGT-3’ 6 <i>mcr-8</i> F:5’TAGCACACGCAGAGTACGTAGCTCTGGTTAATACCTACGACAATAC-3’ 7 <i>mcr-8:</i>223bp R:5’CAAACACACATCCCGATG-3’ 8 <i>mcr-10</i> F:5’TAGCACACGCAGAGTACGTAGCTCTGGTTAATACCTACGACAATAC-3’ 7 <i>mcr-10:</i>241bp <i></i> R:5’CGAGACAGCAGTCAATACCGTCCAGACGCACATCCCGATG-3’ 9
反应体系的建立和优化：反应体系的建立和优化中所采用的靶区域模板以如下方法获得：分别取mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10携带株的大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌菌株复苏后培养48小时，取培养液1mL经过无菌水洗涤后复溶到1mL，采用酚-氯仿法或试剂盒分别提取基因组核酸，再用上述引物进行PCR扩增，并取其中Ct值24-27之间者作为以后反应体系优化时的模板。其中最初反应体系如表2所示：
表2最初设计的PCR反应体系
PCR反应体系 组分 终浓度 PCR缓冲液 1× Mg<sup>2＋</sup>浓度 2.0mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.15mmol/L Taq酶 2U 20×EvaGreen荧光染料 1× SEQ ID No:1所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:2所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:3所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:4所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:5所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:6所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:7所示引物 0.20μmol/L SEQ ID No:8所示引物 0.10μmol/L SEQ ID No:9所示引物 0.10μmol/L 模板 2μL 补水至 40μL
2.1引物浓度的优化：在反应体系中，将引物浓度分别从0.1μmol/L～0.8μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，通过试验结果的分析比较，确定最佳引物终浓度为反应：通用引物（SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示引物）浓度为0.6μmol/L，特异性引物（SEQ ID No:3至SEQ ID No:10所示引物）浓度为0.05~0.20μmol/L。
2.2镁离子浓度的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，将MgCl2的浓度从1 mmol/L～2.5 mmol/L以0.5 mmol/L递增，经过多次重复实验选定2.5 mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.3Taq DNA聚合酶（Taq酶）用量的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L、镁离子的终浓度为2.5 mmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，通过比较Taq酶用量（以单位Unit计）的优化实验结果，选定2U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.4dNTPs（脱氧核糖核苷三磷酸）浓度的优化：在引物的终浓度为0.2μmol/L、镁离子的终浓度为2.5 mmol/L以及反应体系中其它条件同表2的前提下，通过使用不同浓度的dNTPs进行检测，综合评估后选0.2 mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTPs的使用量。
由于本法所涉及的引物及目标片段众多，非饱和染料SYBRGREEN误差较大，无法区分单基因差异，因此本法采用饱和染料EvaGreen作为PCR过程中的荧光染料。Evagreen对qPCR干扰极小，无“染料重分布”，饱和性嵌入DNA双链，分辨效果远优于SYBR Green。利用上述引物及荧光染料进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为40μL体系，所需各组分及相应浓度见表3。
表3优化后的PCR反应体系
PCR反应体系 组分 终浓度 PCR缓冲液 1× Mg<sup>2＋</sup>浓度 2.0mmol/L dNTPs（含dUTP） 0.15mmol/L Taq酶 2U 20×EvaGreen荧光染料 1× SEQ ID No:1所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:2所示引物 0.6μmol/L SEQ ID No:3所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:4所示引物 0.05μmol/L SEQ ID No:5所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:6所示引物 0.15μmol/L SEQ ID No:7所示引物 0.20μmol/L SEQ ID No:8所示引物 0.10μmol/L SEQ ID No:9所示引物 0.10μmol/L 模板 2μL 补水至 40μL
注：在荧光PCR反应体积不同时，各试剂应按比例调整。
3、本发明试剂盒的检测方法，具体包括以下步骤：
（1）提取待测样品中的DNA；
由于已知的可移动MCR基因均在质粒上，因此可用煮沸法等较为激烈的方法提取样本中的DNA，具体步骤为：取20μL新鲜的待测样品如粪便样本，置于有直径2.0mmFTA滤膜片的离心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA滤膜片加入10%SDS溶液200微升，煮沸10min，用FTA专用缓冲液洗涤2次，然后再用TE缓冲液洗涤两次，56℃干燥后，可作为PCR反应模板。
（2）按表3配置具有引物的PCR反应体系；
（3）将步骤（1）提取的DNA作为模板按表3加入到PCR反应体系中，进行PCR扩增反应并进行荧光PCR检测，PCR检测中对PCR扩增产物进行高分辨率溶解分析，程序为：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s，溶解速率为0.2℃/s；当PCR-A反应体系和PCR-B反应体系中的任一体系的实际溶解曲线Tm值与任一种类MCR基因的标准溶解曲线Tm值相符时，则待测样品具有MCR基因。
其中，PCR扩增反应程序条件如下：95℃ 2 min，1个循环；95℃ 5 sec、60℃ 40sec， 40个循环。
本实施例中荧光PCR检测使用赛默飞世尔科技有限公司产的Applied BiosystemsABI 7500型的实时荧光定量PCR仪，但不局限于此。选择仪器的检测通道：在进行荧光PCR反应时，应对所用仪器中反应管荧光信号的收集进行设置，选择的荧光检测通道，具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
实施例2
选取实施例1中表1的所述引物对，将待检的细菌培养液和其他非目标菌株共33株菌的培养液用采用酚-氯仿法或试剂盒提取各种来源样品中细菌的基因组DNA。其中标准菌株为华南理工大学食品安全与检测实验室购买或保藏菌株；分离株来源于深圳市各养殖场、农贸市场与健康人群粪便中，并采用Shen, et al.（2018）的方法鉴定菌株中有无MCR基因的存在，且所述菌株均经过16S测序或质谱鉴定。
在40μL荧光PCR反应体系（按表3配制）中，加入以上提取的不同菌株的基因组DNA2 μL，根据实施例1中的PCR反应条件进行荧光PCR检测。
实验结果如下表4所示。
表4不同菌株的荧光定量qPCR结果
菌株 来源<sup>b</sup> qPCR Shen, et al.(2018)<sup>c</sup> 目标菌株(n=14) 克雷伯氏菌属<i>Klebsiella</i>(n=3) 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> 粪便分离株1 ＋<sup>a</sup> ＋ 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> 粪便分离株2 ＋ ＋ 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i>ssp. <i>rhinoscleromatis</i> 粪便分离株3 ＋ ＋ 大肠埃希氏菌属<i>Escherichiacoli</i>(n=11) ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株1 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株2 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株3 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株4 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株5 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株6 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株7 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株8 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株9 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株10 ＋ ＋ 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> 粪便分离株11 ＋ ＋ 非目标菌株(n=19) 肠杆菌属<i>Enterbacter</i>(n=4) 阴沟肠杆菌<i>Enterbacter cloacae</i> CICC No.21539 - - 阪崎肠杆菌<i>Enterbactersakazakii</i> ATCC No.29544 - - 产气肠杆菌<i>Enterbacteraerogenes</i> CICC No.10293 - - 产气肠杆菌<i>Enterobacteraerogenes</i> ATCCNo.13408 - - 大肠埃希氏菌属<i>Escherichiacoli</i>(n=12) 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 CICC No.21530 - - 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 SZCIQ No.13813 - - 大肠杆菌<i>E. coli</i> O157:H7 ADCPC No.931 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> ATCC No.9637 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> SZCIQNo.eco3 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> SZCIQNo.eco5 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> SZCIQNo.jm109 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> CMCC No.44104 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> CMCC No.44105 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> CMCC No.44106 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> CMCC No.44111 - - 大肠杆菌<i>Escherichiacoli</i> CGMCC No.1.129 - - 克雷伯氏菌属<i>Klebsiella</i>(n=2) 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i> CMCC No.46102 - - 肺炎克雷伯氏菌<i>Klebsiellapneumonia</i> CICC No.10781 - - 沙门氏菌属<i>Salmonella</i>（n=1） - - 都柏林沙门氏菌<i>Salmonella dublin</i> GZCDCNo.dbl1a - -
a.+，阳性； -，阴性
b.ATCC，美国菌种保藏中心，美弗吉尼亚洲马纳萨斯镇丹佛大学美国菌种保藏中心，邮编10801；CMCC，中国医学微生物菌种保藏中心，北京市大兴区生物医药产业基地华佗路31号院，邮编102629；CGMCC，中国普通微生物菌种保藏中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101；CICC，工业微生物菌种保藏管理中心，北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮编：100015；SZCIQ，深圳出入境检验检疫局，广东省深圳市福田区福强路1011号，邮编518000；ADCPC，重庆动物疾病控制和预防中心，重庆市渝中区长江二路8号，邮编：400042。其中来自于ATCC、CMCC、CGMCC、CICC的菌种均可以购买得到。来自于SZCIQ与ADCPC的菌株由这些机构分别惠赠；这些菌株已在文献“Xing-long Xiao,Li Zhang,Hui Wu et.al.,Simultaneous Detection ofSalmonella,Listeriamonocytogenes,andStaphylococcusaureusby Multiplex Real-Time PCR Assays Using High-Resolution Melting [J]. Food Analytical Methods, 2014,7(10):1960-1972”中公开。
c. MCR检测方法参考文献“Yingbo, S. , Hongwei, Z. , Jiao, X. ,Yongqiang, W. , Qijing, Z. , & Walsh, T. R. , et al. (2018). Anthropogenicand environmental factors associated with high incidence of mcr-1 carriage inhumans across china.Nature Microbiology.”。
经检测，若待检培养液中含有MCR variants（MCR的基因变异型，即mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）中任意一种或以上则显示阳性扩增曲线，且溶解曲线Tm值与mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10任一标准溶解曲线的Tm值相符，其中mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的标准溶解曲线如图2-5所示；若待检培养液中不含有MCR variants则无扩增信号，提示上述引物对具有良好的灵敏度和特异性。对表4中的菌株进行检测，结果表明含目标基因的菌株均有检出，而非目标菌株均为无扩增曲线为阴性，说明本法具有良好的特异性。
为了确定待测样品中的MCR种类，则需要通过熔解曲线对待测样本进行鉴定。使用Tm值作为判读标准，如图2-5所示不同种类MCR基因对应的标准溶解曲线的峰值，当测得的Tm值为84.8、87.8、88.2、88.5时，则对应耐药基因分别为mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10，说明本法具有良好的分辨率。
针对临床样品中存在同时出现mcr-1、mcr-3的情况，进一步对混合DNA模板进行了检测，如图6所示，当mcr-1和mcr-3同时存在时，PCR反应体系可得到Tm值为84.8℃与87.8℃的双峰溶解曲线，与Tm(mcr-1)与Tm(mcr-3)一致。
综上，本发明试剂盒检测方法不仅可有效的检出待测样本中的所有临床样本中发现的MCR（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的任一种，当临床样品中同时存在mcr-1与mcr-3时，也能够有效检测及鉴别出MCR基因类型。
进一步地，为了验证本发明试剂盒可以对mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10的任意组合MCR基因进行有效的检测预警，发明人人为的将mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10混合形成4种mcr基因类型混合DNA模板，通过本发明的PCR反应体系可得到Tm值为84.8℃与88.5℃的双峰溶解曲线（如图7所示），与Tm(mcr-1)与Tm(mcr-10)一致，故当mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10同时存在时，本发明试剂盒也能够同时检出多个MCR基因型的功能，起到有效的检测预警的作用。
实施例3
本实施例所述粪便为采用华大智造粪便采集套装采集的健康人群新鲜粪便样本共112份，悬浮于保存液中，并置于4℃保存不超过一周的粪便样本。
选取实施例1中表1的引物对，将使用实施例1所述煮沸法所提取到的粪便细菌总DNA和采用实施例2中所述Shen, et al.（2018）的方法提取到的DNA模板作为不同的DNA模板进行PCR检测对比。结果表明，Shen, et al.（2018）的方法检出阳性率为12.5%（14/112），而本法检出阳性率为13.4%（15/112）。说明本发明采用煮沸法提取待测样品中的DNA作为模板具有良好的检出率。
需要说明的是：图2-7，均为2-3次平行实验，从每张图中的溶解曲线虽然看起并未重合，但每条溶解曲线根据PCR检测仪器的软件自动算出来的Tm均是一样的，故同一DNA样本进行3次平行实验的3次溶解曲线形态存在细微差别属于本领域正常现象。
对比例1
该对比例与实施例1不同之处在于：将表1修改为如下表5，具体地，
表5引物与扩增片段序列列表（均为5'-3'）
目标基因 引物序列5’-3’ SEQ ID 产物长度（bp） 通用引物 F: 5’AGCTACGTACTCTGCGTGTGCTA-3’ 1 R: 5’GACGGTATTGACTGCTGTCTCG-3’ 2 <i>mcr-1</i> F:5’AGCACACGCAGAGTACGTAGCTCTCGTTGGCTTAGATGACT-3’ 3 216bp R: 5’CGAGACAGCAGTCAATACCGTCAAGTGCGAACATCAGTCC-3’ 4 <i>mcr-3</i> F:5’ATATGGGGAGAAAGGAGTTTGAT-3’ 5 207bp R:5’CACATGCTATGACGAGGTTGT-3’ 6 <i>mcr-8</i> F:5’AGCTACGTACTCTGCGTGTGCTACAGTCTGCCAATATTTCTTTTCTGCT-3’ 10 214bp R: 5’GACGGTATTGACTGCTGTCTCGGTTTTGCACCATGCTGCGGTC -3’ 11 <i>mcr-10</i> F:5’AGCTACGTACTCTGCGTGTGCTACGCTACCTGCTCAAACCCTTCTTTGCCCTGT-3’ 12 232bp <i></i> R: 5’GACGGTATTGACTGCTGTCTCGGAATGCCCATGAAGACCAGCCACAGCA -3’ 13
将表5中mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10各自特异性引物及通用引物的组合进行单重PCR检测时，均能在单一PCR体系中特异性识别目标片段，其中mcr-8和mcr-10进行单重PCR检测得到Tm值分别为87.7和75.1，与mcr-8和mcr-10标准溶解曲线的Tm值相符（mcr-8和mcr-10的标准溶解曲线如图8、9所示），则对应耐药基因分别为mcr-8和mcr-10。为了更有利于通过Tm值进行分型，针对mcr-8和mcr-10的引物对，选择了相距较远的扩增片段。但当将表5的引物对组合应用到多重PCR体系中时，发现引物对之间存在相互干扰，使得扩增效率降低，无法得到有效的扩增曲线与溶解曲线，无法有效检测到样本中的产物，产物之间也无法区分分型。
虽然现有技术中已有针对多种类型MCR基因的检测预警的多重PCR技术，其中用于检测各类型MCR基因的引物均不同而且选择了相距较远的扩增片段，以便于通过HRM方法（高分辨熔解曲线分析）的Tm值进行检测或分型。但是针对目前在临床中流行的MCR类型（mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10）的检测及鉴别分型，筛选出mcr-1、mcr-3、mcr-8和mcr-10各自对应的特异性引物对（单重PCR检测均能够很好的检测及鉴别出MCR基因），组合后进行多重PCR检测时发现引物对之间存在相互干扰，使得扩增效率降低，无法得到有效的扩增曲线与溶解曲线，无法有效检测到样本中的产物，产物之间也无法区分分型。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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