一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法
阅读说明：本技术 一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法 (Preparation method of miRNA marker of non-alcoholic steatohepatitis ) 是由 梁廷明 沈璐璐 马敏娟 段瑞 贾琳 于 2020-12-01 设计创作，主要内容包括：一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法,本发明涉及非酒精性脂肪性肝炎研究技术领域,从GEO数据库中筛选出2个符合条件的人NASH相关模型miRNA测序数据集和7个符合条件的小鼠NASH相关模型的miRNA测序数据集,下载这些数据集然后分别进行miRNA差异表达分析并取交集；构建蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠NASH模型,并记录小鼠体重；小鼠肝组织总RNA进行反转录；将得到的反转录产物为模板,检测得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA；将miRNA表达结果进行比对,选取表达趋势一致,且表达差异最明显的2种miRNA作为判断非酒精性脂肪性肝炎的标志物。(The invention relates to a preparation method of miRNA markers of non-alcoholic steatohepatitis, in particular to a preparation method of miRNA markers of non-alcoholic steatohepatitis, which comprises the steps of screening 2 qualified miRNA sequencing data sets of a human NASH-related model and 7 qualified miRNA sequencing data sets of a mouse NASH-related model from a GEO database, downloading the data sets, respectively carrying out miRNA differential expression analysis, and taking an intersection; constructing a methionine choline deficiency diet induced mouse NASH model, and recording the weight of the mouse; carrying out reverse transcription on the total RNA of the liver tissue of the mouse; detecting miRNAs which are differentially expressed in the NASH of the obtained human and the NASH of the mouse by taking the obtained reverse transcription product as a template; comparing the miRNA expression results, and selecting 2 miRNAs with consistent expression trends and most obvious expression differences as markers for judging the non-alcoholic steatohepatitis.)
技术领域
本发明涉及非酒精性脂肪性肝炎研究技术领域，具体涉及一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法。
背景技术
非酒精性脂肪性肝炎(NASH，nonalcoholic steatohepatitis)是非酒精性脂肪肝(NAFLD，nonalcoholic fatty liver)的一种极端发展形式，定义为伴随有炎症及肝细胞损伤的脂肪变性现象的出现，主要表现是无酗酒人群肝脏脂肪蓄积，进而导致炎症和纤维化，部分患者最后会进展成肝硬化甚至肝癌。NAFLD的发病率在国内外日益增加，已经成为了全球范围的威胁公共健康的重大问题。中国成年人群NAFLD患病率最高达27％，NAFLD已取代慢性乙型肝炎成为我国第一大慢性肝病。
NASH涉及营养代谢、免疫炎症、遗传和细胞应激修复等多个方面异常。目前NAFLD的发病机制被广泛接受的是“多重打击学说”，胰岛素抵抗和肝细胞内脂质堆积为第一次打击，随后触发了一系列的细胞毒性事件，如继发的炎症反应、氧化应激、内质网应激、细胞死亡等为第二次打击。虽然目前被广泛认可的“多重打击学说”能部分揭示NAFLD的发病机制，但其病因及病理机制非常复杂，至今仍未完全阐明。NASH在组织学上呈现出小叶炎症和肝细胞气球样变特征，与NAFLD相比，具有更快的纤维化进展速度。对肝脏脂肪变性NAFLD的诊断需要有组织学或者影像技术证据显示肝细胞脂肪变，即组织学检查显示≥5％肝细胞脂肪变或磁共振技术测定的质子密度脂肪分数(proton density fat fraction，PDFF)≥5.5％。microRNAs(miRNAs)通过多种途径参与NAFLD的发生发展，如调节碳水化合物代谢、肝细胞中脂质的分解代谢等。由于循环中的miRNAs非常稳定，在血浆或血清中具有高度重复性和一致性，是指示不同肝脏疾病肝损伤和肝损害的理想替代物。NASH的强异质性可能是造成单个基因指标诊断效能低及不一致的主要原因，通过多基因联合有望提高诊断效能。遗传学、表观遗传学和组学方法不仅揭示了NAFLD发生发展的机制，也提供了许多潜在的新标志物。需继续探索新标志和组合，并对现有标志或标志组合进行大规模验证。对NASH的标志物进行多非编码RNA基因，特别是针对miRNA的联合分析研究，从组学的角度出发，结合动物实验验证，显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种设计合理的非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，为临床在分子水平上开发非酒精性脂肪性肝炎提供了新的方法，同时为非酒精性脂肪性肝炎的治疗提供了新的药物靶点。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：它的操作步骤如下：
步骤一、从National Center for Biotechnology Information(NCBI)的GeneExpression Omnibus(GEO)数据库中筛选出2个符合条件的人非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关模型miRNA测序数据集和7个符合条件的小鼠NASH相关模型的miRNA测序数据集，下载这些数据集然后分别进行miRNA差异表达分析并取交集；
步骤二、分别对步骤一中得到的9个miRNA测序数据集进行差异miRNA的表达分析，得到9组差异表达miRNA；取9组差异表达miRNA的交集，得到在人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA；
步骤三、根据文献资料，构建蛋氨酸胆碱缺乏(Methionine and CholineDeficient L-Amino Acid Diet，MCD)饮食诱导的小鼠NASH模型，并记录小鼠体重；小鼠NASH模型构建成功后，进行小鼠眼球取血并通过颈椎脱臼法处死小鼠，进行解剖取组织样，一部分用甲醛固定，一部分放-80摄氏度冰箱保存待用；解剖时进行小鼠肝脏拍照；
步骤四、将步骤三中得到的血清进行甘油三脂和总胆固醇的检测，得到小鼠NASH模型中的血清学指标，再次确认小鼠模型构建成功；
步骤五、将步骤三中得到的一部分用甲醛固定小鼠肝组织进行苏木精伊红(HE)染色和油红染色，检测NASH模型鼠肝脏中脂质积累情况；
步骤六、将步骤三中得到的一部分放-80摄氏度冰箱保存待用的小鼠肝组织分别提取总RNA；
步骤七、将步骤六中得到的小鼠肝组织总RNA进行反转录；
步骤八、以步骤七中得到的反转录产物为模板，检测步骤二中得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA；
步骤九、将步骤八中得到的miRNA表达结果与步骤二中的表达结果进行比对，选取表达趋势一致，且表达差异最明显的2种miRNA作为判断非酒精性脂肪性肝炎的标志物。
进一步地，所述的步骤一中所述的NASH miRNA测序数据集，是从GEO数据库中搜索的数据集，经过条件筛选得到，筛选条件为：HFD、NAFLD、NASH、miRNA、tissue；每个数据集最少包含5个样本的正常组和5个样本的处理组；每个数据集有一个数据矩阵，行名为miRNA名称，列名为样本名称。
进一步地，所述的步骤二中分别对得到的9个miRNA测序数据集进行差异miRNA的表达分析，利用R语言中limma包进行差异miRNA的表达数据分析，上述差异miRNA表达分析的阈值条件均设置为：|log2FC|>1，且FDR<0.05；FC为差异倍数，FDR为伪发现率；满足阈值条件的基因为差异表达基因；分别得到9组差异表达的miRNA。
进一步地，所述的步骤二中得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA包括miR-210、miR-222、miR-301a-3p、miR-532-5p。
进一步地，所述的步骤三中的小鼠NASH模型是利用MCD饮食诱导构建的，周期为2-3周，所用小鼠为6-8周的C57BL/6J小鼠；血样是通过小鼠眼球取血获得，分为两份，一份用于检测血样中的甘油三脂TG、总胆固醇含量TC、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶含量；另一份用于检测血样中的miRNA。
进一步地，所述的步骤九中所检测miRNA在NASH小鼠模型肝脏中的表达趋势与步骤二中得到的在人和小鼠NASH中差异表达的miRNA表达趋势一致，分别是miR-301a-3p和miR-532-5p这两种miRNA。
采用上述方法后，本发明的有益效果是：本发明提供了一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，为临床在分子水平上开发非酒精性脂肪性肝炎提供了新的方法，同时为非酒精性脂肪性肝炎的治疗提供了新的药物靶点。
附图说明：
图1是本发明中NASH模型小鼠解剖图(左为正常鼠，右为NASH模型鼠)。
图2是本发明中NASH模型小鼠血清中ALT和AST的含量检测图表。
图3是本发明中NASH模型鼠小鼠肝脏油红染色和HE染色照片。
图4是本发明在NASH模型小鼠肝脏中筛选人和小鼠中都差异表达miRNA表达图表。
图5是本发明中所用的NASH相关模型人和小鼠miRNA测序数据集表。
具体实施方式
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下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本具体实施方式采用如下技术方案：它的操作步骤如下：
步骤一、从NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中筛选出2个符合条件的人非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相关模型miRNA测序数据集(条件：物种为人，样品为人的肝脏组织，数据类型为miRNA高通量测序数据，且有正常样本和NASH相关疾病配对样本)和7个符合条件的小鼠NASH相关模型的miRNA测序数据集(条件：物种为小鼠，样品为小鼠肝脏组织，数据类型为高通量测序数据，并含有正常样本和NASH相关模型配对样本)，并下载这些数据集(9个数据集见图5)；
步骤二、分别对步骤一中得到的9个miRNA测序数据集进行差异miRNA的表达分析，所用方法为R语言中的limma包，筛选，得到9组差异表达miRNA；取9组差异表达miRNA的交集，得到在人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA(包括miR-210、miR-222、miR-301a-3p、miR-532-5p)；上述差异基因表达分析的阈值条件均设置为：|log2FC|>1，且FDR<0.05；FC为差异倍数，FDR为伪发现率；满足阈值条件的基因为差异表达基因；
步骤三、根据文献资料，构建蛋氨酸胆碱缺乏(Methionine and CholineDeficient L-Amino Acid Diet，MCD)饮食诱导的小鼠NASH模型，所用小鼠为6-8周的C57BL/6J小鼠20只，其中10只对照，另外10只构建NASH模型，小鼠在SPF级动物中心饲养，每3天记录小鼠体重，模型鼠所用MCD饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司，模型构建时间为2-3周；小鼠NASH模型构建成功后，进行小鼠眼球取血并通过颈椎脱臼法处死小鼠，进行解剖取组织样，进行一部分用4％甲醛固定，一部分放-80摄氏度冰箱保存待用；解剖时进行小鼠肝脏拍照(如图1)；
步骤四、将步骤三中得到的血清放4摄氏度冰箱过夜，然后进行甘油三脂TG、总胆固醇含量TC、天门冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶含量检测，得到小鼠NASH模型中的血清学指标(如图2)，再次确认小鼠模型构建成功；这部分中测定小鼠NASH模型血液指标检测的甘油三脂测定试剂盒、总胆固醇测定试剂盒，天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST)测试盒、丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶ALT)测试盒均购自南京建成生物工程有限公司；
步骤五、将步骤三中得到的一部分用4％甲醛固定的小鼠肝组织进行苏木精伊红(HE)染色和油红染色，检测NASH模型鼠肝脏中脂质积累情况(如图3)；
步骤六、将步骤三中得到的另一部分放-80摄氏度冰箱保存待用的小鼠肝组织分别使用购自宝生物工程(大连)有限公司的Trizol试剂提取肝脏组织的总RNA；
步骤七、将步骤六中得到的小鼠肝组织总RNA进行反转录；此步骤反转录时用的是购自南京诺唯赞生物科技有限公司的miRNA 1st Strand Cdna Synthesis Kit(by stem-loop)反转录试剂盒，并按照试剂盒说明书操作；miRNA反转录primer由上海捷瑞生物公司合成；
步骤八、以步骤七中得到的反转录产物为模板，检测步骤二中得到的人和小鼠NASH中都差异表达的miRNA(mmu-miR-122(has-miR-122)、mmu-miR-210(has-miR-210)、mmu-miR-222(has-miR-222)、mmu-miR-301a(has-miR-301a-3p)、mmu-miR-532-5p(has-miR-532-5p)；进行相关miRNA的qRT-PCR检测；所用qRT-PCR试剂盒miRNA Universal SYBRQpcr Master Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，并按照试剂盒说明书操作。检测时U6snRNA作为内参。进行筛选出的miRNA表达量检测(如图4)。
步骤九、将步骤八中所检测miRNA在NASH小鼠模型肝脏中的表达趋势与步骤二中得到的在人和小鼠NASH中差异表达的miRNA表达趋势一致；分别是miR-301a-3p和miR-532-5p这两种miRNA，这两种miRNA可以作为判断非酒精性脂肪性肝炎的标志物。
采用上述方法后，本具体实施方式的有益效果如下：本发明提供了一种非酒精性脂肪性肝炎的miRNA标志物的制备方法，首次发现miRNA标志物miR-301a-3p和miR-532-5p可用于判断非酒精性脂肪性肝炎的进程和严重程度；经检验证明，miR-301a-3p和miR-532-5p可有效区分非酒精性脂肪性肝炎样本和正常样本；在此基础上，miR-301a-3p和miR-532-5p还可用于制备抑制非酒精性脂肪性肝炎的药物，为临床在分子水平上开发非酒精性脂肪性肝炎提供了新的方法，同时为非酒精性脂肪性肝炎的治疗提供了新的药物靶点。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。