具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型实施方式中，提供了下述任一应用：

A1、检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在制备筛查多发性骨骺发育不良患者产品中的应用；

A2、检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在制备检测多发性骨骺发育不良易感性产品中的应用；

A3、检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在制备检测与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

A4、检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

B1)人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型在制备筛查多发性骨骺发育不良患者产品中的应用；

B2)人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型在制备检测多发性骨骺发育不良易感性产品中的应用；

B3)检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在筛查多发性骨骺发育不良患者中的应用；

B4)检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在检测多发性骨骺发育不良易感性中的应用；

B5)检测人基因组中rs27044和/或rs30187的多态性或基因型的物质在检测与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性的中的应用；

B6)检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性的中的应用；

B7)人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型在筛查多发性骨骺发育不良患者中的应用；

B8)人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型在检测多发性骨骺发育不良易感性中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，上述用途中，所述检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质可为扩增包括SMOC2c.1076T>G在内的基因组DNA片段的PCR引物和/或检测SMOC2c.1076T>G的探针。

本发明的又一具体实施方式中，所述产品可包括所述PCR引物和/或所述检测SMOC2 c.1076T>G的探针。

本发明的又一具体实施方式中，上述用途中，所述多发性骨骺发育不良具体可为中国人群多发性骨骺发育不良。

本发明的又一具体实施方式中，还提供了含有检测人基因组中SMOC2c.1076T>G的多态性或基因型的物质的产品，为a)-d)中的任一种产品：

a)检测与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

b)鉴定或辅助鉴定与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

c)筛查多发性骨骺发育不良患者产品；

d)检测多发性骨骺发育不良易感性产品。

本发明的又一具体实施方式中，上述产品中，所述检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质可为扩增包括SMOC2c.1076T>G在内的基因组DNA片段的PCR引物。

本发明的又一具体实施方式中，上述产品中，所述多发性骨骺发育不良具体可为中国人群多发性骨骺发育不良。

本发明的又一具体实施方式中，本发明还提供了下述M1)或M2)的方法：

M1)筛查多发性骨骺发育不良患者的方法，包括：检测待测对象基因组中SMOC2c.1076T>G位点的基因型；

M2)检测多发性骨骺发育不良易感性的方法，包括：检测待测对象基因组中SMOC2c.1076T>G位点的基因型。

本发明的又一具体实施方式中，上述方法中，所述多发性骨骺发育不良具体可为中国人群多发性骨骺发育不良。

本发明的又一具体实施方式中，上述方法中，检测待测对象基因组中SMOC2c.1076T>G位点的基因型可采用所述检测SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质进行。

本发明在实际应用中，可将检测SMOC2 c.1076T>G的多态性(即等位基因)或基因型的物质与其它物质(如检测其它的与多发性骨骺发育不良相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备筛查多发性骨骺发育不良患者的产品。

其中，检测人基因组中SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一种方法确定rs27044和/或rs30187的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、微流控芯片技术、TaqMan探针技术和Sequenom MassArray技术。其中，利用Sequenom MassArray技术确定SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸引物、磷酸酶、树脂、芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laserdesorption/ionization–time of flight，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器；利用TaqMan探针技术确定rs27044和/或rs30187的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪、进行基因分型的模块和/或TaqMan探针技术所需要的其他试剂；SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片和/或基于荧光分子DNA结合反应的芯片。微流控芯片技术确定SMOC2 c.1076T>G的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括DNA提取微流控模块及试剂、DNA扩增模块及PCR引物对、核酸标记模块及相关试剂、SNP芯片及相关的杂交、洗脱和扫描微流控模块及试剂。

所述产品可为试剂或试剂盒，还可为由试剂或试剂盒和仪器组成的系统，如由引物和DNA测序仪组成的系统，由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统，由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的模块以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂组成的系统，由探针、PCR引物对以及连接酶检测反应(LDR)所需要的其他试剂和仪器组成的系统，由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪、进行基因分型的模块和/或Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系统。

采用PCR引物扩增包括SMOC2 c.1076T>G在内的基因组DNA片段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用所述检测SMOC2 c.1076T>G的探针对得到的延伸产物的序列进行检测，确定SMOC2 c.1076T>G的多态性(即等位基因)和基因型。所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包括SMOC2 c.1076T>G在内的基因组DNA片段即可。所述检测SMOC2c.1076T>G的探针可根据人基因组中SMOC2 c.1076T>G上下游设计，所述探针的序列覆盖人基因组中SMOC2 c.1076T>G的核苷酸。

本发明的又一具体实施方式中，所述PCR引物为SMOC2-F和SMOC2-R；

所述SMOC2-F是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA；

a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；

所述SMOC2-R是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：

b1)序列表中序列2所示的单链DNA；

b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；

b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1或序列2所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

本发明的又一具体实施方式中，上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。

本发明的又一具体实施方式中，SMOC2 c.1076T>G应用Taqman(Thermo Fisher)基因分型平台进行分型检测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用探针进行检测。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

在山东收集到一个骨骼发育异常家系，家系中共有四代38名成员，先证者为IV-9。经家系图谱分析，该家系中每一代都有患者且男女均有发病，符合常染色体显性遗传病的遗传特征(图1)。

家系的先证者为IV-9，该患者出生时正常，没有明显的临床症状。2岁后，家长发现其运动能力发育迟缓，4岁时出现膝关节内翻，膝关节肿胀、疼痛等症状。影像学表现为膝关节肿胀，股骨远端和胫骨近端骨骺骨化不均匀，呈“冰川裂隙”状，骨骺表面呈不规则的锯齿状(图2)。该家系其他患者均为成年人，都出现了身材轻度矮小的症状，身高在1.4米-1.6米之间。大部分患者的膝关节、髋关节等大关节僵硬，不能伸直；易疲劳，劳累后疼痛明显，不能下蹲或下蹲后需借助外力才能起身；季节变换时症状加重。部分患者出现骨质疏松症状，关节肿胀明显。II-7的指关节肿胀明显。III-14的X光片显示双侧髌骨上缘变尖，髌骨位置下移(图2)。最终临床诊断为多发性骨骺发育不良。

为寻找该家系的致病基因，我们采集了该家系中部分患者和正常者的外周血提取获得基因组DNA。首先通过选取与已知多发性骨骺发育不良基因致病基因紧密连锁的STR位点，以家系成员DNA为模板，进行PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行连锁分析，结果未发现连锁(图3)，排除了所有已知致病基因。

因此，我们对先证者IV-9进行全外显子组测序，结果发现在INSL5，MRPS5，ANXA5，SMOC2，KAT6B，MYO15A，DSCAM和PABPC3基因中各有一个变异位点。在ExAC(ExomeAggregation Consortium，http://exac.broadinstitute.org)数据库中检索这些变异位点，发现除了位于SMOC2和PABPC3基因的变异未能检索到，其他的变异均可在ExAC数据库中检索到(表1)。ExAC数据库是汇集60,706名不同种族个体的外显子测序结果的遗传变异数据库。若在此数据库中检索到变异且出现频率较高，提示该变异可能不是致病变异。因此，只有SMOC2和PABPC3可能是导致该家族患病的变异。但进一步Sanger测序分析发现PABPC3基因变异未在其他患者中检测到，该变异与表型不表现共分离，所以也被排除。

表1候选基因及其在正常人群中的频率

SPARC-related modular calcium binding 2(SMOC2)c.1076T>G(NM_001166412.2)变异位于SMOC2第11外显子，该错义突变导致其编码的第359位氨基酸由赖氨酸改变为精氨酸(p.L359R)。我们首先利用在线软件对该变异位点进行分析。利用ClustalOmega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)分析SMOC2基因编码的第359位氨基酸(赖氨酸)在进化上是否保守进行分析，结果显示在多物种中该位点的赖氨酸在各物种中都是保守的(图4)。生物信息学分析软件Polyphen2(图5，A)和mutation taster(图5，B)的分析结果均显示该位点的变异是致病的。

为了验证该变异是否导致本家系中患者发病，我们在该变异位点上游和下游设计了引物(SMOC2 forward 5’TGAGACACCAGGACCATGAG 3’，SEQ ID NO.1)；SMOC2 reverse 5’ACTCCCAGGCCATAAACACA 3’，SEQ ID NO.2)，以所提取的家系成员基因组DNA为模板，进行PCR扩增和Sanger测序。测序结果显示，在本家系中所有患者都为c.1076T>G变异杂合子，而正常成员中无该变异。因此，此杂合变异与家系中患者的表型是呈现共分离的(图6)。

以上结果提示，SMOC2 c.1076T>G；p.L359R错义突变是该常染色体显性多发性骨骺发育不良家系的致病突变，SMOC2基因是新的多发性骨骺发育不良的致病基因。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> Smoc2基因及其SNP标志物在多发性骨骺发育不良中的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgagacacca ggaccatgag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actcccaggc cataaacaca 20