hsa_circ_0008961作为痛风诊断标志物的应用
阅读说明：本技术 hsa_circ_0008961作为痛风诊断标志物的应用 (Application of hsa _ circ _0008961 as gout diagnosis marker ) 是由 青玉凤 张全波 戴菲 黄玉琴 郑建雄 唐乙萍 董曾荣 周闻君 于 2020-12-10 设计创作，主要内容包括：本发明具体涉及hsa-circ-0008961作为痛风诊断标志物的应用。circRNA在痛风的发生发展过程中具有重要的生理作用,为了进一步明确circRNA在痛风中的调节机制,开发具有痛风诊断意义的circRNAs。本发明通过基因芯片技术筛选分析了痛风患者和健康对照者外周血单个核细胞中差异表达的circRNA,并通过实时荧光定量PCR验证了芯片结果,表明hsa-circ-0008961可作为痛风诊断的生物标志物,公开的相应试剂或试剂盒对痛风病人的诊断灵敏性高、特异性好、检测方便,具有良好的临床应用价值。(The invention particularly relates to application of hsa _ circ _0008961 as a gout diagnosis marker. The circRNA has important physiological action in the occurrence and development process of gout, and in order to further define the regulation mechanism of the circRNA in the gout, the circRNAs with gout diagnosis significance are developed. According to the invention, circRNA differentially expressed in peripheral blood mononuclear cells of gout patients and healthy contrast persons is screened and analyzed by a gene chip technology, and a chip result is verified by real-time fluorescent quantitative PCR (polymerase chain reaction), which indicates that hsa _ circ _0008961 can be used as a biomarker for gout diagnosis, and the disclosed corresponding reagent or kit has high diagnostic sensitivity, good specificity and convenient detection on gout patients, and has good clinical application value.)
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，更具体的是涉及原发性痛风的分子标志物，可用于原发性痛风的诊断。
背景技术
痛风是人类常见自身炎症性疾病之一，其特征是嘌呤代谢紊乱和(或者)尿酸排泄障碍使体内尿酸水平升高，形成单钠尿酸盐结晶沉积于组织中，从而导致关节炎、软组织肿块(即痛风石)、尿酸性肾病等。其与明显的地理分布有关，一项涉及17476名研究对象的荟萃分析表明中国人群痛风的患病率为1.1％；美国流行病学调查显示2015年-2016年期间其痛风总体患病率为3.9％，且总受影响人口呈逐年上升趋势。
痛风的发病基础是高尿酸血症，但并非所有高尿酸血症都会进展成痛风。实际上，高尿酸血症患者中只有10％发生痛风。在痛风发作期间，血清尿酸也可能会降至正常水平。现阶段痛风的诊断大多依靠临床表现、血尿常规、血尿酸测定、关节超声和关节腔穿刺检查等，它们虽各有优势，但或为有创检查，或敏感性或特异性不足，或技术要求比较高，需要丰富的临床经验，不能满足临床需要。同时，由于痛风不仅会引起关节炎症，长期的痛风还可成为高血压、高血脂、心血管疾病及脑血管疾病的重要危险因素，因此，寻找敏感性、特异性高的标志物用于痛风诊断及早期治疗是十分必要的。
环状RNA(circle RNA，circRNA)是一类封闭环状的非编码RNA，其主要的生物学功能是通过与微小RNA(microRNA，miRNA)结合，发挥“海绵”作用，此外，还可调节蛋白质结合、参与转录调控和编码蛋白多肽，参与多种疾病的发生。在已有的研究中发现circRNA在疾病和正常人群间存在差异表达，并且有成为生物标志物的潜能。发明人通过微阵列芯片技术对痛风测序数据进行进一步挖掘和整合分析，用生物信息学方法构建circRNA-miRNA相互作用的生物信息调控网络，并对circRNA的来源基因分别进行GO功能分析和Pathway分析，寻找参与调控痛风的关键分子，发现了hsa_circ_0008961。
发明内容
用于原发性痛风诊断的circRNA标志物在制备原发性痛风诊断试剂盒中的应用。
所述的circRNA标志物为SEQ ID NO：1所示的hsa_circ_0008961。
采用荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0008961的表达水平。
所述hsa_circ_0008961在原发性痛风患者的外周血中表达量升高。
所述的circRNA标志物的引物对为针对hsa_circ_0008961的特异性引物。
所述的针对hsa_circ_0008961的特异性引物，包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物，如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。
所述试剂盒还包括逆转录酶、dNTP、MgC12、缓冲液、荧光染料、去核酸酶水、探针和/或Taq酶。
样本为外周血。
本申请的优点：本发明利用微阵列芯片技术检测外周血单个核细胞中差异表达的circRNA，并证实这些circRNA在原发性痛风患者和正常人中存在差异表达并且可以用作潜在的痛风诊断标志物，这将有助于探索痛风的发病机理，并为其诊断提供新的方向。通过对血液生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用，仅需要病人的血液而不需要任何其他组织，通过扩增外周血circRNA的表达水平，提高检测的灵敏度，可使得痛风的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。
附图说明
图1为差异表达的circRNA的火山图分析。
图2为差异表达的circRNA的层级聚类图分析。
图3为qRT-PCR检测has_circ_0008961在痛风患者外周血中表达上调。
图4为外周血中has_circ_0008961单独诊断效能。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
实施例1 微阵列芯片技术分析原发性痛风患者与正常人间差异表达的circRNA
1.材料
收集2018年4月到2020年9月川北医学院附属医院风湿免疫科门诊及住院部就诊的痛风患者共60例作为实验组。根据其是否有临床症状分为急性期痛风(active gout，AG)组与间歇期痛风(inactive gout，IG)组各30例。所有患者均符合1977年ACR或2015年ACR/EULAR制定的痛风诊断标准，排除药物、肿瘤、肾脏原发疾病等所致继发性痛风者。收集同期在川北医学院附属医院体检中心进行健康体检正常且无痛风及关节病史者30例，将其设为健康对照(healthy controls，HC)组。纳入研究的正常对照组及痛风患者组之间在年龄和性别构成上差异均无统计学意义。
2.实验方法
2.1总RNA提取与质量检测
使用肝素抗凝管采集所有研究对象清晨空腹外周血4ml，采用Ficoll密度梯度离心法分离PMBCs，根据Trizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明书提取PMBCs中总RNA。通过标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性，使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Agilent公司，美国)测试RNA的浓度及纯度。样品合格后分装保存于-80℃冰箱。
2.2微阵列芯片技术分析
选取RNA质量鉴定合格且年龄匹配的AG、IG、HC各3例进行基因芯片分析。根据Arraystar的标准方案进行样品制备和微阵列杂交：即用Rnase R(Epicentre公司，美国)消化总RNA，以去除线性RNA并富集环状RNA，根据Arraystar Super RNA标记试剂盒(Arraystar公司，美国)操作步骤将富集的环状RNA扩增并转录为荧光cRNA。将标记的cRNA与包含13617个人circRNA探针的Arraystar Human circRNA Array v2(8x15K)芯片(Arraystar公司，美国)杂交。清洗载玻片后，用Agilent扫描仪G2505C(Agilent公司，美国)进行阵列扫描。扫描所得图像由Agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)分析，使用R语言limma软件包执行分位数归一化和后续数据处理，以倍数变化(Fold change，FC)＞1.5且P＜0.05的标准来筛选差异表达的circRNAs。分析结果显示，痛风AG、IG、HC之间存在差异表达的circRNA，采用火山图(图1)、层次聚类图(图2)表达上述差异情况。其中，和HC组相比，AG组和IG组分别有93个和14个上调表达的circRNA，有23个和27个下调表达的circRNA；而与IG组相比，AG组上调表达86个circRNA，下调表达19个circRNA。
实施例2 RT-PCR验证痛风患者外周血单个核细胞中hsa_circ_0008961相对表达量
1.引物设计
hsa_circ_0008961引物：
上游引物：5’-CGGCTGCTCAACTCTGTGTG-3’
下游引物：5’-TGTTCCTCCCCCTGCTCAGTC-3’
目标基因扩增长度：191bp。
2.反转录
取性别、年龄无统计学差异的AG、IG、HC各30例，总RNA标本进行反转录。按照PimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)RR047A(Takara)说明书配置反转录反应体系，取2μl的总RNA用于逆转录合成cDNA。首先将各试剂进行瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，充分混匀，置于循环器内孵育将RNA反转为cDNA，其中第一步骤反转录条件为42℃2min，第二步骤反转录条件为42℃15min，最后4℃保存。
3.RT-PCR验证hsa_circ_0008961表达量
在PCR仪上进行qPCR。使用SYBR Premix Ex Taq(TakaRa)实时荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR检测，反应体系为：10μl TB Green Premix Ex Tap II，上下游引物各0.3μl，2μl cDNA，ddH20补充至20μl。反应条件为：第一步：95℃30sec 1个循环→循环℃5sec→60℃34sec共40个循环。第二步：95℃5sec→60℃60sec→95℃15sec共1个循环。反应结束后作溶解曲线，以β-actin做内参，每份标本均设复孔。采用相对定量法，以2-ΔΔc(t)作为circRNA相对表达量，以判读不同样本之间目的基因表达的差异。
4.统计学处理
采用统计学软件SPSS 23.0软件进行统计分析，连续变量采用平均值±标准差(x±SD)和中位数(Median)表示；两组比较采用t检验或Mann-Whitney U检验。通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC曲线)以及计算相应的曲线下面积(area under the ROC，AUC)来评价生物标志物的诊断效能，以P＜0.05为差异有统计学意义。
5.验证结果
结果显示；RT-PCR扩增曲线整体平行性好，说明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平且无上扬现象，曲线指数期斜率大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，说明扩增产物单一，是特异性扩增。hsa_circ_0008961在痛风患者外周血单个核细胞中表达量明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(P＜0.001)(图3)。ROC曲线分析显示hsa_circ_0008961的表达水平在痛风患者组和HC组之间差异具有统计学意义(p＜0.001)(图4)，其中AUC(95％IC)为0.839(0.741-0.937)，敏感性为85.2％，特异性为77.8％显示hsa_circ_0008961对痛风具有很好的诊断价值。
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