一种糖尿病合并冠心病的生物标志物
阅读说明：本技术 一种糖尿病合并冠心病的生物标志物 (Biomarker for diabetes complicated with coronary heart disease ) 是由 王兆平 王革 王颖翠 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种糖尿病合并冠心病的生物标志物,属于生物医药技术领域。本发明通过提取RNA发现,相较于健康人体血清,糖尿病合并冠心病患者血清中基因AC021188.4的表达量显著降低,且AC021188.4的表达量在单纯冠心病患者和单纯糖尿病患者血清中没有显著的变化,因此,可将AC021188.4作为诊断糖尿病合并冠心病的基因标志物。(The invention provides a biomarker for diabetes complicated with coronary heart disease, and belongs to the technical field of biological medicines. According to the invention, compared with the serum of a healthy human body, the expression level of the gene AC021188.4 in the serum of a patient with diabetes and coronary heart disease is obviously reduced by extracting RNA, and the expression level of AC021188.4 has no obvious change in the serum of the patient with simple coronary heart disease and the serum of the patient with simple diabetes, so that AC021188.4 can be used as a gene marker for diagnosing the patient with diabetes and coronary heart disease.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种糖尿病合并冠心病的生物标志物。
背景技术
随着人口老龄化的逐渐严重，冠心病和糖尿病的发病率正在逐年上升。相关的研究数据显示，糖尿病患者冠心病的发病几率是正常人群的2-4倍。与单纯冠心病患者相比，糖尿病合并冠心病患者冠状动脉病变更加弥漫和严重。可以看出，糖尿病合并冠心病已经成为严重威胁人类生命健康的主要疾病。因此，因此，实现糖尿病合并冠心病的早诊断将有助于实现糖尿病合并冠心病的早治疗，提高患者的治愈率。
lncRNA是一类大于200个核苷酸的非编码RNA，lncRNA在人体的各种生命活动中均具有广泛的调控作用。最近几年的研究表明，lncRNA的差异表达与人体的疾病的发生和发展有着密切的联系。目前，尚无lncRNA与糖尿病合并冠心病的相关报道，因此，研究糖尿病合并冠心病患者血液中的lncRNA差异表达将为诊断和治疗糖尿病合并冠心病提供新的方向。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种糖尿病合并冠心病患者血液中的差异lncRNA为糖尿病合并冠心病患者的诊断和治疗提供新的方向。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
其一，本发明提供了一种用于诊断糖尿病合并冠心病的标志物，所述标志物为基因AC021188.4，所述基因AC021188.4的转录本序列为ENST00000421534.1，所述ENST00000421534.1如SEQ ID NO.1所示。
其二，本发明提供了检测基因AC021188.4表达量的试剂在制备糖尿病合并冠心病预诊断产品中的应用。
优选地，所述产品为基因芯片，试剂盒或生物制剂。
优选地，所述试剂中包括AC021188.4的特异性引物，所述引物的序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
其三，本发明提供了一种糖尿病合并冠心病预诊断检测试剂盒，所述试剂盒包括检测AC021188.4表达量的特异性引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
其四，本发明提供了检测基因AC021188.4表达量的试剂在制备糖尿病合并冠心病预后评估产品中的应用。
优选地，所述产品为基因芯片，试剂盒或生物制剂。
优选地，所述试剂中包括AC021188.4的特异性引物，所述引物的序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。
其五，本发明提供了一种糖尿病合并冠心病预后评估检测试剂盒，所述试剂盒包括检测AC021188.4表达量的特异性引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现基因AC021188.4在糖尿病合并冠心病患者中低表达，而在单纯冠心病患者和单纯糖尿病患者中表达无显著差异，且AC021188.4作为糖尿病合并冠心病标志物具有优异的特异性和灵敏度，因此可将AC021188.4用于制备糖尿病合并冠心病预诊断试剂盒和糖尿病合并冠心病预后诊断试剂盒。
附图说明
图1 AC021188.4在健康人血清（A组），糖尿病合并冠心病患者血清（B组），单纯冠心病患者血清（C组）和单纯糖尿病患者血清（D组）中的表达差异。
图2 AC021188.4在健康人血清（A组）和糖尿病合并冠心病患者血清（B组）之间的ROC曲线。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1
提取血清RNA
（1）收集30例健康人体血液（设置为A组），22例糖尿病合并冠心病患者血液（设置为B组）和25例单纯冠心病患者血液（设置为C组）和20例单纯糖尿病患者血液（设置为D组）；
（2）将各组的血浆置于离心机中，3000rpm/min离心15min后，取上清，得到血清；
（3）各组分别取250ul血清置于离心管中，加入750ul的Invitrogen TRIzol试剂 ，吹打混匀之后，置于室温下静置5min；
（4）加入200ul氯仿，震荡混匀之后，放于室温下静置15min；
（5）将离心管置于低温离心机中，4℃ 12000rpm/min离心15min；
（6）吸取上清至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀之后，置于冰上静置10min；
（7）将离心管置于低温离心机中，4℃ 12000rpm/min离心15min；
（8）弃去上清，在沉淀中加入1ml DEPC水配置的75%乙醇，震荡离心管使沉淀悬浮于75%乙醇中；
（9）将离心管置于低温离心机中，4℃ 7000rpm/min 离心5min，弃去上清，置于超净工作台中，干燥8min，加入30ul DEPC水进行溶解；
（10）检测RNA的纯度和浓度用于后续实验。
实施例2
制备各组血清的cDNA
（1）去除基因组DNA
反应体系如下：
试剂
使用量
5×gDNA Eraser Buffer
2.0 μl
gDNA Eraser
1μl
Total RNA
1μg
RNase Free dH2O
up to 10 μl
反应条件如下：42℃ 2分钟，4℃。
（2）逆转录反应
反应体系如下：
试剂
使用量
步骤（1）的反应液
10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1.0μl
RT Primer Mix
1.0 μl
5×PrimeScript Buffer 2
4.0 μl
RNase Free dH2O
4.0 μl
Total
20 μl
反应条件如下：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃。
实施例3
检测AC021188.4在各组中的差异表达
（1）设计AC021188.4的特异性引物，引物序列如下：
AC021188.4上游引物：5’-CACATCGAGGCTCTAGTGACC-3’
AC021188.4下游引物：5’-GCTTGCCAGCACGATTTACAA-3’
GAPDH上游引物：5’-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3’
GAPDH下游引物：5’-TTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3’
（2）进行荧光定量PCR反应：
试剂
使用量
SYBR Green Premix Ex Taq（2×）
10μl
上游引物
0.4μl
下游引物
0.4μl
cDNA模板
2μl
无菌水
7.2μl
Total
20μl
反应条件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 35s，40个循环；70℃ 45s。
（3）使用2-△△Ct方法计算AC021188.4在各组中的差异表达水平。
实验结果如图1所示，从结果中可以看出，B组（糖尿病合并冠心病患者血清）AC021188.4的相对表达量为0.439±0.048，C组（单纯冠心病患者血清）AC021188.4的相对表达量为0.914±0.030，D组（单纯糖尿病患者血清）AC021188.4的相对表达量为0.983±0.041.
从上述结果可以看出，糖尿病合并冠心病患者血清中的AC021188.4的相对表达量显著低于健康人体血清且差异具有统计学意义；而单纯冠心病患者和单纯糖尿病患者血清中的AC021188.4的相对表达量则与健康人体血清中的AC021188.4表达量没有显著差异。
根据A组和B组的数据绘制ROC曲线，结果如图2所示，从图中可以看出，ROC曲线的AUC值为0.9621（Std.Error为0.02232,95% confidence interval 0.9184-1.006，P value< 0.0001），说明AC021188.4作为糖尿病合并冠心病标志物具有优异的特异性和灵敏度。
综上所述，AC021188.4在糖尿病合并冠心病患者中低表达，而在单纯冠心病患者和单纯糖尿病患者中表达无显著差异，且AC021188.4作为糖尿病合并冠心病标志物具有优异的特异性和灵敏度，因此可将AC021188.4用于制备糖尿病合并冠心病预诊断试剂盒和糖尿病合并冠心病预后诊断试剂盒。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东大学齐鲁医院（青岛）
<120> 一种糖尿病合并冠心病的生物标志物
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 740
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 1
ggcacatcga ggctctagtg accgcattat gaattagtcc tttccttttc tcctcatgtg 60
attgcagcga gcgctcgtct tgtttgtaaa tcgtgctggc aagccccgtt ttaaccaact 120
acgaatttca tttcggaatg aaaaaggaga cgcactttcg gacagggcag cggttgccgc 180
cggtccttcc tctgagctac cggtccctag aaggaagacc tgccttcgac cgatctggaa 240
atgagtccca gctgcaagcc cagggcggcg gaagccccac gggccgagcc gaagaaagac 300
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cgctcttccc cgagcggaca ggaaaaagct ctcctttgcc gctgcccatc ccccagggcc 420
caagcgatgc ttcctaaccg cgtggacgca gcttgatggg ggagaaagag ctctgggagc 480
agggcttaga gcctcgtctc gcctcctgcc aactcggtcc ggcaaggttc cgaacctccc 540
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gcccacagcc cagctgcatc tgtgaacatg aatgctactt ctacagaaac agagtggaat 660
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ataaaagtca gccttaagga 740
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacatcgagg ctctagtgac c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttgccagc acgatttaca a 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccatcacca tcttccagga g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttctccatgg tggtgaagac g 21
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