Pear1基因突变试剂盒及其应用
阅读说明：本技术 Pear1基因突变试剂盒及其应用 (PEAR1 gene mutation kit and application thereof ) 是由 崔一民 向倩 王哲 胡琨 常国栋 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及PEAR1基因突变试剂盒及其应用,所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒。本发明的PEAR1基因突变试剂盒能够成功地对PEAR1基因进行突变,通过突变能够降低PEAR1蛋白活性,通过降低PEAR1蛋白活性,有助于提高肺栓塞的存活率。(The invention relates to a PEAR1 gene mutation kit and application thereof, wherein the kit comprises TALEN endonuclease or a plasmid for coding TALEN endonuclease. The PEAR1 gene mutation kit can successfully mutate the PEAR1 gene, can reduce the activity of PEAR1 protein through mutation, and is favorable for improving the survival rate of pulmonary embolism by reducing the activity of PEAR1 protein.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及PEAR1基因突变试剂盒及其应用。
背景技术
血小板内皮聚集受体1(platelet endothelial aggregation receptor-1,PEAR1)是一种含有1034个氨基酸的跨膜蛋白，主要在巨核细胞、血小板和内皮细胞上表达。PEAR1在细胞外含有EMI结构域(蛋白-蛋白相互作用区域)，15个类似表皮生长因子的重复序列及胞质内多个酪氨酸和脯氨酸残基组成。
基于人群的多项研究中，多个独立的研究发现PEAR1基因可调控血小板功能并参与血栓相关事件的发生。其中多个全基因组关联研究(Genome-Wide-Association-Studies,GWAS)发现PEAR1基因突变可影响血小板的聚集能力。Juraj Sokol等人研究发现PEAR1单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNPs)可增加粘性血小板综合征的发病率，另一项研究纳入101例肺栓塞患者和匹配的132例健康人群，发现PEAR1基因rs778026543突变在肺栓塞患者与健康人群之间存在显著性差异。而在动物水平的研究中，Maarten等人通过PEAR1基因敲除小鼠实验，发现硫酸葡聚糖可以直接在体外活化PEAR1引起浓度依赖的血小板聚集，但是在体内的尾出血及静脉血栓中PEAR1基因未体现明显区别。其PEAR1基因敲除小鼠采用国际小鼠表型联盟基于C57BL/6N为背景的PEAR1基因敲除小鼠Pear1tm1a(KOMP)Wts，其使用Cre/loxP和Flp/FRT系统敲除PEAR1基因的7号和8号外显子构成PEAR1基因移码敲除小鼠模型，如图1所示。因此目前尚未有PEAR1基因突变的体外模型可以模拟人群中PEAR1基因突变对于血栓性疾病的作用。
发明内容
为了对PEAR1基因进行突变以及提供一种治疗肺栓塞的药物试剂盒，本发明提供PEAR1基因突变试剂盒及其应用。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：
本发明一方面涉及PEAR1基因突变试剂盒，所述试剂盒中包括TALEN内切酶或者编码TALEN内切酶的质粒，所述TALEN内切酶的靶点位置选自下述PEAR1-T1和/或PEAR1-T4；
PEAR1-T1：
TCACCACGACCACTAAGG agtcccacctgcgcccctt CAGCCTGCTCCCAGCTG A；
PEAR1-T4
TGGACTCCCGCCCACGC ctgcagtgctgtagg GGTTACTACGAGAGCAGA。
在本发明的一个优选实施方式中，所述PEAR1基因突变是指在TGCGCCCTTCAG前缺失两个碱基CC或缺失11个碱基TCCCACCTGCG。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒还包括基因突变成功的鉴定引物组，所述引物组包括：
PEAR1-sens：TGAGTACTGATTCTCTCCATGGTG；
PEAR1-anti：AACTGAAGGAGCAGACAGTAGC。
本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备PEAR1基因突变小鼠中的应用。
本发明另一方面还涉及一种治疗肺栓塞的药物试剂盒，所述试剂盒包括上述PEAR1基因突变试剂盒以及治疗肺栓塞的药物。优选地，所述治疗肺栓塞选自替格瑞洛、氯吡格雷、利伐沙班、达比加群、阿哌沙班抗血栓药中的一种或者多种。
本发明另一方面涉及上述药物试剂盒在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方式中，所述药物能够减少肺部栓塞的同时提高存活率。
本发明另一方面涉及PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。对于本发明的PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂，本领域的技术人员能够根据PEAR1的基因序列采用公知的方法确定。
在本发明的一个优选实施方式中，所述PEAR1基因突变试剂或PEAR1基因敲除试剂能够减少肺部栓塞的同时提高存活率。
本发明另一方面还涉及以PEAR1基因及其受体为靶点的试剂盒在制备治疗肺栓塞和/或抑制凝血药物中的应用。
本发明另一方面还涉及PEAR1基因突变小鼠在用于筛选治疗肺栓塞的药物中的应用。
有益效果
本发明的PEAR1基因突变试剂或基因敲除能够成功地对PEAR1基因进行突变，通过突变能够降低PEAR1蛋白活性，通过降低PEAR1蛋白活性，有助于提高肺栓塞的存活率。
附图说明
图1是示出TALEN质粒的示意图。
图2(a)是示出(a)Luciferase SSA检测TALEN活性原理的图；图2(b)是示出与参照比较，TALEN活性比值情况的图。
图3是示出PEAR1 TALEN的SSA活性结果的图。
图4是示出免疫蛋白印迹方法检测WT、Founder 1系、Founder 7系PEAR1表达的图。
图5是示出PEAR1基因移码突变小鼠基因检测结果的图。
图6是示出PEAR1基因敲除小鼠免疫印迹结果的图。
图7是示出肺栓塞实验PEAR1-/-小鼠与WT小鼠存活率对比的图。
图8(a)是示出肺栓塞小鼠肺部病理(a)WT小鼠正常肺部的图；图8(b)是示出PEAR1-/-小鼠正常肺部的图；图8(c)是示出WT小鼠肺栓塞的图；图8(d)是示出WT小鼠给予替格瑞洛1小时后肺栓塞的图；图8(d)是示出PEAR1-/-小鼠肺栓塞的图；图8(e)是示出PEAR1-/-小鼠给予替格瑞洛1小时后肺栓塞的图。
图9是示出尾出血实验PEAR1-/-小鼠与WT小鼠尾出血时间对比的图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1
1.PEAR1基因敲除小鼠构建策略及质粒构建
参考PEAR1基因组数据，发现PEAR1基因存在多个转录产物，对转录产物及蛋白保守区域进行分析，设计出能特异性识别PEAR1基因外显子功能区域DNA的TALEN内切酶，用TALEN内切酶剪切PEAR1基因组DNA，诱发DNA损伤，在同源重组修复过程中形成突变的位置，TALEN质粒如图1所示。
2.TALEN的SSA活性检测
TALEN质粒构建，根据PEAR1基因转录产物和蛋白保守区分析，移码突变设计从第一个保守区“EMI”前开始，因此TALEN靶点设计在ATG开始的公共外显子2或者3上。
TALEN质粒构建完成后，采用SSA Luciferase报道的基因方法检测其活性。LuciferaseSSA检测TALEN活性原理：终止子位于luciferase的编码区的中央位置(见图2)，其中luciferase并没有活性。TALEN的靶点序列被置于终止子的后面，从而检测出靶点序列的活性。通过TALEN，细胞的DNA进行了同源的重新组合，进而形成了一个新的具有活性的luciferase。计算活性数据/对照组活性，根据比值判断其TALEN剪切的活性状态。同时，将该质粒进行SSA活性检测，检测结果见图3。根据TALEN的SSA活性检测结果，选用活性较高的TALEN显微注射到小鼠的受精卵中，从而构建PEAR1-/-小鼠(PEAR1-T1和PEAR1-T4，靶点序列及位置如下)。
TALEN设计靶位点位置1：PEAR1-T1
tcaccacgaccactaagg agtcccacctgcgcccctt cagcctgctcccagctg a
TALEN设计靶位点位置4：PEAR1-T4
tggactcccgcccacgc ctgcagtgctgtagg ggttactacgagagcaga
3.PEAR1基因敲除首建鼠(Founder)的构建
将TALEN质粒对PEAR1-T1和PEAR1-T4，质粒线性化后，根据载体所带启动子选择相应试剂盒进行体外转录，转录为mRNA后，将其显微注射至小鼠受精卵中(共80个)，出生14只。两周龄后，提取鼠尾DNA测序，根据测序结果判定小鼠基因型。共有2只小鼠(Founder 1和Founder 7)发生移码突变，见表1。
表1首建鼠(Founder)的构建
选取Founder 1(m-pe-1，♂)小鼠与野生型C57BL/6雌鼠交配，Founder 7(m-pe-7，♀)小鼠与野生型C57BL/6雄鼠交配。出生的小鼠两周龄后进行基因型鉴定，并建立F1代小鼠。对Founder 1系PEAR1+/-杂合小鼠和Founder 7系PEAR1+/-杂合小鼠分别进行交配，繁殖出实验所需的具有PEAR1(1系，K01)和PEAR1(7系，K07)基因型的小鼠。同时进行蛋白水平的鉴定，蛋白印迹结果显示PEAR1蛋白在Founder 1(K01)小鼠和Founder 7(K07)小鼠的表达均较野生型(WT)小鼠弱，因此，我们选择表达最低的Founder 7(K07)作为实验用小鼠品系，蛋白印迹结果见图4。
4.小鼠的繁育饲养和实验伦理
构建基因敲除小鼠品系为C57BL/6J北京。小鼠由北京大学第一医院实验动物中心管理和饲养，均为SPF级(Specific Pathogen Free,无特定病原体)。将基因鉴定为PEAR1-/-型的小鼠按♂:♀＝1:2比例配笼，使其大量繁殖，子代小鼠3周龄断奶后与亲代分离，将小鼠雌雄分笼，进行基因型鉴定。鉴定所得PEAR1-/-小鼠作为实验用小鼠，通过北京维通利华实验动物技术有限公司购买同周龄的C57BL/6J野生型小鼠(WT)作为对照组。
剪刀用酒精消毒，采用剪脚趾的方法对幼鼠编号。
实验经北大医院实验动物福利伦理审查委员会审查通过(受理编号201548、201746)。
5.PEAR1基因和蛋白水平检测
5.1PEAR1基因提取与检测
5.1.1实验方法
5.1.1.1裂解鼠尾及提取基因组DNA
(1)小鼠编号后剪长约0.5cm鼠尾放入1.5ml EP管中。剪过鼠尾的剪刀用酒精擦拭，避免交叉污染。小鼠鼠尾基因提取按照天根鼠尾基因组提取试剂盒说明书操作。
(2)向装有鼠尾的EP管中加入200μl缓冲液GA。
(3)加入20μl Proteinase K溶液，使鼠尾浸泡在溶液中。
(4)置于56℃烘箱裂解鼠尾过夜。
(5)向已裂解好的鼠尾EP管中加入200μl缓冲液GB，颠倒混匀，70℃水浴10min，离心30s去除管壁水珠。
(6)加入200μl无水乙醇，震荡器上混匀15s，离心30s，去除管壁水珠。将EP管中液体全部转入吸附柱中，将吸附柱放置于收集管中，12000转离心30s，倒掉废液，再将吸附柱放回收集管中。
(7)加入500μlGD(确认加过乙醇的)到吸附柱中，12000转离心30s，弃废液。
(8)加入600μlPW(确认加过乙醇的)到吸附柱中，12000转离心30s，弃废液。
(9)重复步骤(8)。
(10)吸附柱放到收集管中，12000转离心2min后取出，弃废液。把吸附柱放置于新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖子放入烘箱2-5min晾干。
(11)向吸附柱中加入50μl TE，合上吸附柱盖子放入烘箱2-5min充分溶解。
(12)12000转离心2min后取出，随机测几个基因组的浓度，若没问题，弃吸附柱。
5.1.2PCR扩增和测序
(1)PEAR1-/-小鼠基因型鉴定的PCR引物：PCR片段长度为710bp。
PEAR1-sens：tgagtactgattctctccatggtg
PEAR1-anti：aactgaaggagcagacagtagc
(2)PCR反应体系：PEAR1基因型鉴定的反应体系见表2。
表2 PEAR1基因鉴定PCR反应体系
(3)基因鉴定的PCR程序：
1)94℃2min
2)98℃10sec
3)60℃30sec
4)68℃1min
5)重复2)-4)35个循环
6)68℃10min
7)16℃2min
(4)4℃保存后进行测序。
5.1.3实验结果
PEAR1基因敲除小鼠敲除在第5号外显子，tcccacctgcg，共11个碱基敲除后，发生移码突变，基因检测结果见图5。
5.2蛋白水平检测
5.2.1实验方法
5.2.1.1样品制备
(1)取WT小鼠、PEAR1基因敲除小鼠脾脏，称量约20mg，每10mg脾脏加入100μl蛋白裂解液。用玻璃研磨器于冰上研磨。
(2)将液体转移至预冷的新的1.5ml离心管中，冰上放置15min，使蛋白充分裂解。
(3)4℃，12000rpm离心10min。
(4)用移液枪吸取上清溶液，分装到新的0.5ml的EP管中，-20℃冻存。
5.2.1.2蛋白浓度测定
(1)根据样品数量，将BCA试剂A液和B液按50:1的比例混合，摇匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
(2)制备蛋白标准品，浓度为0.5mg/ml。将配置好的标准品加到96孔板中，每孔按0、1、2、4、8、12、16、20μl体积，不足20μl的孔用生理盐水补足到20μl。
(3)加入2μl蛋白样品到96孔板中，然后加入生理盐水补足至20μl。
(4)向各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30min。
(5)测定A562波长。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
5.2.1.3蛋白印迹实验
(1)清洗制胶板，按照目标蛋白的分子量确定胶的浓度，由于PEAR1的相对分子量为150kD，实验采用10％分离胶和4％浓缩胶。
(2)将配好的聚丙烯酰胺凝胶固定，蛋白样品和蛋白Marker上样，样品每孔20μl，Marker 3-5μl。
(3)连接电泳仪，电泳条件为80V，30min；后为120V，75min。
(4)剪刀剪取与凝胶大小相近的PVDF膜，在甲醇中浸泡10min。同时准备同样大小的滤纸和海绵，浸泡在电转液中。
(5)取下凝胶，将多余部分去除，按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序放好，不要有气泡产生。
(6)对准正负极，负极处对应凝胶，正极处对应PVDF膜，倒入电转液，调至恒定电流，转膜约75min。
(7)取下膜，在TBST溶液中漂洗1次，5min，以除去缓冲液。
(8)将膜浸入到配制好的封闭液中，摇床上室温孵育1小时。
(9)用封闭液将抗PEAR1抗体稀释，稀释倍数为1:200，然后把PVDF膜与一抗一同孵育，4℃摇床上孵育过夜。孵育结束，TBST洗3次，每次5min。
(10)将膜置于用封闭液稀释的HRP标记的二抗(稀释比例1:10000)，摇床上室温孵育1小时。后取出膜，用TBST洗3次，每次5min。
(11)ECL曝光：使用ECL化学发光显色液。
5.2.2实验结果
蛋白免疫印迹结果显示PEAR1基因敲除小鼠中繁殖后代不存在PEAR1蛋白，结果见图6。
6.PEAR1功能实验。
6.1实验方法
(1)准备15-20w周龄实验组PEAR1-/-小鼠和对照组WT小鼠各20只，称重。
(2)取实验组和对照组小鼠各10只，使用生理盐水按照0.01ml/g灌胃。另取实验组和对照组小鼠各10只，使用替格瑞洛按照27mg/kg剂量，0.01ml/g灌胃，等待1小时。
(3)将小鼠眼球凸起，按照250mg/kg剂量眼眶静脉注射ADP 0.005ml/g。
(4)观察小鼠在30分钟后的生存情况。
(5)未死亡小鼠使用20％乌拉坦0.01ml/g腹腔注射麻醉后固定，死亡小鼠直接固定，取小鼠肺组织，在生理盐水中洗去表面血液，存放于4％多聚甲醛溶液内。
(6)小鼠肺组织使用HE染色法，观察肺部血管内血栓情况。
(7)使用Origin软件作柱状图，结果以平均数±标准平均误差表示(mean±SD)，并采用Student t检验方法计算P值。
6.2实验结果
最终纳入PEAR1-/-小鼠替格瑞洛给药组10只，生理盐水对照组9只；WT小鼠替格瑞洛给药组10只，生理盐水对照组10只。PEAR1-/-小鼠生理盐水组与WT生理盐水组体重与周龄无统计学差异。
肺栓塞结果见表3和图7，肺组织病理结果见图8。结果发现：
①WT组小鼠正常肺部大血管及小血管未见明显血栓，肺栓塞造模后大血管遍布血栓，导致小鼠死亡。
②WT组小鼠给予替格瑞洛后进行肺栓塞造模，存活率明显提高，肺部大血管可见部分血栓。
③PEAR1-/-小鼠正常情况下肺部大血管可见部分血栓，肺栓塞造模后大血管遍布血栓，但小鼠存活率较WT组小鼠明显升高。
④PEAR1-/-小鼠给予替格瑞洛后进行肺栓塞造模，与未给药组相比，存活率未见明显提高，肺部血栓减少。
表3 PEAR1-/-小鼠与WT小鼠肺栓塞实验
7.尾出血实验
7.1实验方法
(1)准备14-19w周龄实验组PEAR1-/-小鼠和对照组WT小鼠各16只，称重。
(2)取实验组和对照组小鼠各8只，使用生理盐水按照0.01ml/g灌胃。另取实验组和对照组小鼠各8只，使用替格瑞洛按照27mg/kg浓度，0.01ml/g灌胃，等待30min。
(3)将小鼠使用20％乌拉坦0.01ml/g腹腔注射麻醉，适当固定。
(4)用尺子在尾根部开始测量，在2cm处用记号笔标记。以锋利手术刀在标记处割一深度约为2mm的伤口，血液自然流出的时间作为零点。
(5)观察小鼠的尾出血情况，每30s用滤纸轻擦鼠尾剪断位置，待滤纸上不再有小鼠血液为终点时间。
(6)分别记录PEAR1-/-小鼠及WT小鼠的鼠尾出血时间，使用Origin软件作柱状图，结果以平均数±标准平均误差表示(mean±SD)，并采用Student t检验方法计算P值。
7.2实验结果
最终纳入PEAR1-/-小鼠替格瑞洛给药组7只，生理盐水对照组8只；WT小鼠替格瑞洛给药组8只，生理盐水对照组8只。PEAR1-/-小鼠生理盐水组与WT生理盐水组体重存在统计学差异。
尾出血时间见表4和图9。结果发现：
表4 PEAR1-/-小鼠与WT小鼠尾出血实验
①对比WT生理盐水组与替格瑞洛给药组，出血时间显著延长，证明替格瑞洛给药模型构建成功。
②PEAR1-/-小鼠生理盐水组与WT生理盐水组相比，出血时间明显延长，说明PEAR1基因可能促进小鼠体内凝血过程，敲除基因导致小鼠凝血功能下降。
③PEAR1-/-小鼠替格瑞洛给药组与生理盐水组相比，出血时间虽然延长，但未见显著性差异，说明PEAR1基因可能影响替格瑞洛药效。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
序列表
<110> 北京大学第一医院
<120> PEAR1基因突变试剂盒及其应用
<130> CP20790
<141> 2020-12-29
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> TALEN
<400> 1
tcaccacgac cactaaggag tcccacctgc gccccttcag cctgctccca gctga 55
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> TALEN
<400> 2
tggactcccg cccacgcctg cagtgctgta ggggttacta cgagagcaga 50
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> PEAR1
<400> 3
tgagtactga ttctctccat ggtg 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> PEAR1
<400> 4
aactgaagga gcagacagta gc 22
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> PEAR1
<400> 5
tcccacctgc g 11