阅读说明：本技术 甲氨蝶呤的检测方法 (Method for detecting methotrexate ) 是由 贾永娟 刘杏立 刘春冉 倪君君 于 2020-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了甲氨蝶呤的检测方法,包括：制备具有甲氨蝶呤和内标物的至少三种浓度的标准溶液,标准溶液中的内标物的量相同；利用液质联用仪在检测条件下检测每一种标准溶液,获得标准溶液对应的第一检测结果；根据各个第一检测结果、标准溶液中甲氨蝶呤的浓度和内标物的浓度,拟合甲氨蝶呤的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入内标物和沉淀蛋白试剂,涡旋混匀,并离心,取离心后的第二上清液作为待测样品；利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品,获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果,得到待测样品中甲氨蝶呤的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。(The invention provides a detection method of methotrexate, which comprises the following steps: preparing standard solutions having at least three concentrations of methotrexate and an internal standard, the amount of internal standard in the standard solutions being the same; detecting each standard solution by using a liquid chromatograph-mass spectrometer under a detection condition to obtain a first detection result corresponding to the standard solution; fitting a standard curve equation of the methotrexate according to each first detection result, the concentration of the methotrexate in the standard solution and the concentration of the internal standard substance; taking a first supernatant after a sample to be treated is centrifuged; adding an internal standard substance and a precipitated protein reagent into the first supernatant, uniformly mixing by vortex, centrifuging, and taking the centrifuged second supernatant as a sample to be detected; detecting the sample to be detected by using a liquid chromatograph-mass spectrometer under the detection condition to obtain a second detection result of the sample to be detected; and obtaining the concentration of the methotrexate in the sample to be detected based on the standard curve equation and the second detection result. The scheme can shorten the sample detection time.)

甲氨蝶呤的检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及甲氨蝶呤的检测方法。

背景技术

甲氨蝶呤是一种叶酸还原酶抑制剂，为橙黄色结晶性粉末，易溶于稀碱、酸或碱金属的碳酸盐溶液，微溶于稀盐酸，几乎不溶于水、乙醇、氯仿、乙醚。

目前，检测样品中甲氨蝶呤含量通常采用的方法为高效液相色谱法。而高效液相色谱法检测通常需要对待测样品进行较复杂的前处理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。

发明内容

本发明提供了甲氨蝶呤的检测方法，能够缩短样品检测时间。

为了解决上述问题，本发明实施例提供了甲氨蝶呤的检测方法，包括：

制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有甲氨蝶呤和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中甲氨蝶呤的浓度和内标物的浓度，拟合甲氨蝶呤的标准曲线方程；

对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

向所述第一上清液内加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；

利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中甲氨蝶呤的浓度。

优选地，为了更准确地检测出待测样品中甲氨蝶呤的浓度，标准溶液和待测样品中的内标物均为甲氨蝶呤-d3，采用目标物的同位素作为内标物，可以避免在对目标物检测时内标物与目标物发生反应，而影响目标物的检测，同时，最大程度地降低基质效应的影响，从而提高检测结果的准确度。

需要说明的是，第一上清液包括血清或血浆。

具体地，系列浓度的标准溶液制备方式如下：

(1)标准储备液的配制

精确称取甲氨蝶呤标准品置于容量瓶中，用氢氧化钠水溶液进行溶解，并定容至容量瓶标线，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为24个月。

(2)标准工作液的配制

取适量步骤(1)中标准储备液，用含有40-60％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有100-50000ng/mL甲氨蝶呤的标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月。

(3)内标储备液的配制

取100μg/mL的内标物甲氨蝶呤-d3标准品作为内标储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为24个月。

(4)内标工作液的配制

取步骤(3)中内标储备液，用稀释液进行稀释，得到含甲氨蝶呤-d3的内标工作液，并在-80℃保存，有效期为12个月。

(5)标准溶液的标定

分别移取步骤(2)中不同浓度的标准工作液和步骤(4)中的内标工作液置于离心管中，分别向各个离心管中加入沉淀蛋白试剂，混合制成至少三种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀0.5-1.5min后，并离心，移取离心后的第二上清液作为标准溶液。

为了降低甲氨蝶呤和甲氨蝶呤-d3的工作溶液的挥发性，所以稀释液为含有40-60％甲醇的水溶液。

甲氨蝶呤常温下可溶解于0.1％甲酸水溶液、0.1M盐酸水溶液和氢氧化钠水溶液中，但是溶解于酸性条件中的甲氨蝶呤在低温条件下易析出，而且再恢复至室温后也无法保证甲氨蝶呤能再次溶解，因此，为了保证甲氨蝶呤的充分溶解，选择氢氧化钠水溶液对甲氨蝶呤进行溶解和稀释。

优选地，所述检测条件中的液相条件，包括：反相色谱柱；

洗脱流动相中的水相包括：含有0-0.5％甲酸、0-10mM的缓冲盐的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：含有0-0.5％甲酸、0-1mM的缓冲盐的乙腈溶液或含有0-0.5％甲酸、0-1mM的缓冲盐的甲醇溶液；

柱温为18-60℃；流速为0.25-0.6mL/min。

优选地，待测样品的进样量为0.1-20μL。当进样量为0.1μL时信噪比为32.2，可满足定量要求，当进样量超过20μL测试信号饱和。

具体地，液相条件的色谱柱包括Waters Atlantis-dC18色谱柱(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Agilent ZORBAX-Extend-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Agilent ZORBAX XDB-C8(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、SHIMADZU-SP-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径2.6μm)、Agilent SB-Aq-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Waters Atlantis-T3(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)、Agilentporoshell 120SB-C18(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径2.7μm)、IncertSustain-C8(内径2.1mm×柱长50mm、填料的粒径5μm)。

针对洗脱流动相来说，可以是由甲醇溶液和水相组成的洗脱流动相，也可以是由乙腈溶液和水相组成的洗脱流动相，还可以是由水相与甲醇溶液和乙腈溶液以任意比例混合后组成的洗脱流动相。

具体地，洗脱流动相的水相或者有机相中可以加入甲酸也可以不添加甲酸。当洗脱流动相中加入甲酸，由于质谱检测器为ESI(+)检测模式，因此，通过该洗脱流动相对待测样品进行检测，可以增加待测样品的离子化程度，提高目标物质谱峰的强度。

具体地，当洗脱流动相中的水相中的甲酸含量大于0.5％，且有机相中的甲酸含量大于0.5％时，洗脱流动相中的甲酸含量过多，导致洗脱流动相的pH值过低，从而对色谱柱造成不可逆的损伤。因此，洗脱流动相中的水相包括：含有0-0.5％甲酸；有机相包括：含有0-0.5％甲酸。

具体地，洗脱流动相的有机相中可以加入缓冲盐也可以不添加缓冲盐，当添加缓冲盐时，缓冲盐的添加量应小于1mM，以防止缓冲盐析出、沉积甚至损害色谱柱。

针对洗脱流动相中的甲酸来说，含有0％-0.5％甲酸是指含有0％至0.5％范围内任一值的甲酸，比如，水相和/或有机相中含有0％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％以及0.5％的甲酸。

针对水相中的缓冲盐来说，含有0-10mM的缓冲盐是指水相中含有0mM至10mM范围内任一值的缓冲盐，比如，含有0mM、2mM、4mM、6mM、8mM、以及10mM的缓冲盐。

针对有机相中的缓冲盐来说，含有0-1mM的缓冲盐是指有机相中含有0mM至1mM范围内任一值的缓冲盐，比如，含有0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、以及1mM的缓冲盐。

优选地，洗脱流动相中的缓冲盐包括甲酸铵或乙酸铵。

针对柱温来说，18℃-60℃是指18℃到60℃范围内的任一值，比如，18℃、20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃、40℃、43℃、45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、以及60℃。

针对流速来说，0.25-0.6mL/min是指0.25mL/min到0.6mL/min范围内的任一值，比如，0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min、0.4mL/min、0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min以及0.6mL/min。

优选地，当所述有机相与所述水相采用等度洗脱时，所述有机相与所述水相的体积比包括：22％:78％-40％:60％；当所述有机相与所述水相采用梯度洗脱时，所述有机相与所述水相的体积比包括：0.00min：10％:90％-40％:60％；0.01min：30％:70％-100％:0％；1.00min：30％:70％-100％:0％；1.01min：10％:90％-40％:60％；3.00min：10％:90％-40％:60％。

具体地，洗脱流动相可以采用等度洗脱或梯度洗脱的分析方式。

针对等度洗脱的有机相和水相的体积比22％:78％-40％:60％，是指22％:78％至40％:60％范围内的任一比例，比如，22％:78％、30％:70％、35％:65％以及40％:60％。

针对梯度洗脱中有机相与水相在0.00min、1.01min以及3.00min的体积比，10％:90％-40％:60％是指10％:90％至40％:60％范围内的任一比例，比如，10％:90％、15％:85％、20％:80％、25％:75％、30％:70％、35％:65％以及40％:60％。

针对梯度洗脱中有机相与水相在0.01min以及1.00min的体积比，30％:70％-100％:0％是指30％:70％至100％:0％范围内的任一比例，比如，30％:70％、40％:60％、50％:50％、60％:40％、70％:30％、80％:20％、90％:10％以及100％:0％。

例如，当0min有机相与水相的体积比为10％:90％，0.01min有机相与水相的比例为80％:20％时，那么在0min至0.01min时间段内，有机相由占比10％逐渐增加至80％，水相则由占比90％逐渐降低至10％。

由于有机相与水相在洗脱流动相中占比的总和为1，因此，当有机相在洗脱流动相中的占比增加，水相在洗脱流动相中的占比则相应降低。

具体地，当采用等度洗脱时，有机相在洗脱流动相中体积占比小于22％时，甲氨蝶呤的保留时间增大，会增大甲氨蝶呤的检测时间；有机相在洗脱流动相中体积占比大于40％时，甲氨蝶呤的保留时间小，0.5min之前就出峰，容易产生基质效应，因此，采用等度洗脱时洗脱流动相中的有机相与水相的体积比为22％:78％-40％:60％。

具体地，当采用梯度洗脱时，若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比小于10％时，柱压短时间内无法恢复，导致对待测样品的分析时间过长；若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比大于40％时，甲氨蝶呤的保留时间小，0.5min之前就出峰，容易产生基质效应。

优选地，所述检测条件中的质谱条件，包括：

所述液质联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；

所述液质联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):8-12，雾化气流速(L/min):25-35，加热气温度(℃):300-350，毛细管电压(V):3000-4000。

针对加热气流速来说，8-12L/min是指8L/min至12L/min范围内的任意值，比如，8L/min、9L/min、10L/min、11L/min以及12L/min。

针对雾化气流速来说，25-35L/min是指25L/min至35L/min范围内的任意值，比如，25L/min、27L/min、30L/min、32L/min以及35L/min。

针对加热气温度来说，300-350℃是指300℃至350℃范围内的任意值，比如，300℃、310℃、320℃、330℃、340℃以及350℃。

针对毛细管电压来说，3000-4000V是指3000V至4000V范围内的任意值，比如，3000V、3100V、3200V、3300V、3400V、3500V、3600V、3700V、3800V、3900V以及4000V。

优选地，所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述标准溶液中甲氨蝶呤的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中甲氨蝶呤的浓度与内标物的浓度的比值。

具体地，若甲氨蝶呤的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的x值(即自变量)时，甲氨蝶呤的浓度与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)。

若甲氨蝶呤的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的y值(即因变量)时，甲氨蝶呤的浓度与内标物的浓度的比值则为标准曲线方程的x值(即自变量)。

优选地，为了更好地去除杂质，对目标物进行提纯，对加入内标物后的第一上清液进行蛋白沉淀的沉淀蛋白试剂包括：甲醇溶液、乙腈溶液、三氯乙酸、磺基水杨酸和高氯酸中的至少一种。

优选地，为了更好的去除杂质，所述第一上清液与所述沉淀蛋白试剂的体积比包括1:1-1:240。

针对第一上清液和沉淀蛋白试剂的体积比来说，1:1-1:240是指1:1至1:240范围内的任一比例，比如，1:1、1:3、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:50、1:100、1:150、1:200、以及1:240。

具体地，当第一上清液的体积为100μL，那么沉淀蛋白试剂的体积可以是100μL至24000μL范围内的任一值。当第一上清液和沉淀蛋白试剂的体积比为1:240时，信噪比为16.0，可满足定量要求。

优选地，

所述对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液，包括：

将待处理样品在3000-4000rpm的转速下离心8-12min，取离心后的上清液作为第一上清液。

具体地，通过离心对待处理样品进行处理，以去除部分杂质。可以理解的是，第一上清液包括血清、血浆或其他样本。

优选地，所述向所述第一上清液内加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第二上清液作为待测样品，包括：

向所述第一上清液内加入内标物，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合0.5-1.5min；

顺次加入沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，并在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，取离心后的第二上清液作为待测样品。

具体地，在向第一上清液内加入内标物后，为了使得两者混合更均匀，可先涡旋混合，再向混合后的第一上清液内加入沉淀蛋白试剂，并涡旋混匀，进行蛋白沉淀，以通过沉淀蛋白试剂对混合后的第一上清液进行提纯。然后进行高速离心，取离心后的第二上清液，实现将杂质和目标物分离的目的。由于无需利用液液萃取即可对待测样品进行提纯，如此使得对待检测样品的前处理过程操作更加简单，同时减少前处理所需时间。

针对涡旋转速来说，1500-2000rpm是指1500rpm至2000rpm范围内的任一转速，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm以及2000rpm。

针对加入内标物之后的涡旋时间来说，0.5-1.5min是指，0.5min至1.5min范围内的任一时间，比如，0.5min、0.6min、0.7min、0.8min、0.9min、1.1min、1.2min、1.3min、1.4min以及1.5min。

针对加入沉淀蛋白试剂之后的涡旋时间来说，4-6min是指，4min至6min范围内的任一时间，比如，4min、4.5min、5min、5.5min以及6min。

针对离心转速来说，10000-15000rpm是指10000rpm至15000rpm范围内的任一转速，比如，10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm以及15000rpm。

针对加入沉淀蛋白试剂之后的离心时间来说，8-12min是指8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min以及12min。

本发明提供了甲氨蝶呤的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓度的甲氨蝶呤的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物甲氨蝶呤-d3，因此，基于各种浓度标准溶液中的甲氨蝶呤的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到甲氨蝶呤的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂进行蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中甲氨蝶呤的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过液液萃取等复杂前处理过程便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一实施例提供的甲氨蝶呤的检测方法的流程图；

图2是本发明一实施例提供的标准溶液中的甲氨蝶呤和内标物的色谱图；

图3是本发明一实施例提供的待测样品中的甲氨蝶呤和内标物的色谱图；

图4是本发明一实施例提供的待测样品的进样量为0.1μL的色谱图；

图5是本发明一实施例提供的待测样品的进样量为10μL的色谱图；

图6是本发明一实施例提供的待测样品的进样量为20μL的色谱图；

图7是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.2mL/min时的色谱图；

图8是本发明一实施例提供的柱温18℃，流速0.25mL/min时的色谱图；

图9是本发明一实施例提供的柱温20℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图10是本发明一实施例提供的柱温25℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图11是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速0.3mL/min时的色谱图；

图12是本发明一实施例提供的柱温30℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图13是本发明一实施例提供的柱温35℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图14是本发明一实施例提供的柱温35℃，流速0.5mL/min时的色谱图；

图15是本发明一实施例提供的柱温35℃，流速0.6mL/min时的色谱图；

图16是本发明一实施例提供的柱温40℃，流速0.6mL/min时的色谱图；

图17是本发明一实施例提供的柱温50℃，流速0.6mL/min时的色谱图；

图18是本发明一实施例提供的柱温60℃，流速0.6mL/min时的色谱图；

图19是本发明一实施例提供的柱温60℃，流速0.4mL/min时的色谱图；

图20是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为甲醇溶液时的色谱图；

图21是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为乙腈溶液时的色谱图；

图22是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为含有5％三氯乙酸的水溶液时的色谱图；

图23是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为含有6％高氯酸的水溶液时的色谱图；

图24是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相体积比为20％:80％时的色谱图；

图25是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相体积比为25％:75％时的色谱图；

图26是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相体积比为22％:78％时的色谱图；

图27是本发明一实施例提供的洗脱流动相中有机相与水相体积比为40％:60％时的色谱图；

图28是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；

图29是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；

图30是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；

图31是本发明一实施例提供的一种梯度洗脱的色谱图；

图32是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图33是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图34是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图35是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图36是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图37是本发明一实施例提供的一种洗脱流动相下的色谱图；

图38是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent ZORBAX-XDB-C8的色谱图；

图39是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent ZORBAX-Extend-C18的色谱图；

图40是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Atlantis-T3的色谱图；

图41是本发明一实施例提供的色谱柱为Waters Atlantis-dC18的色谱图；

图42是本发明一实施例提供的色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18的色谱图；

图43是本发明一实施例提供的色谱柱为SHIMADZU-SP-C18的色谱图；

图44是本发明一实施例提供的色谱柱为IncertSustain-C8的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

目前，通常采用高效液相色谱对待测样品进行检测，待测样品采用噻氯匹定或氨基蝶呤作为内标物，但是二者均不能最大程度的消除基质效应的影响，影响待测样品检测的准确性，进而影响甲氨蝶呤的检测方法的实际应用和推广普及。

并且，待测样品储备液配制过程中未加入碱，使得待测样品储备液难以稳定保存，影响待测样品检测的准确性。并且待测样品的前处理通常使用液液萃取，导致前处理过程较为复杂，前处理过程所需时间较长，从而导致待测样品中甲氨蝶呤整体的检测时间较长。

基于上述问题，本发明实施例提供了甲氨蝶呤的检测方法，如图1所示，包括：

步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有甲氨蝶呤和内标物的溶液，所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；

步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；

步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中甲氨蝶呤的浓度和内标物的浓度，拟合甲氨蝶呤的标准曲线方程；

步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；

步骤105：向所述第一上清液内加入内标物和沉淀蛋白试剂，涡旋混匀，并离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；

步骤106：利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；

步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中甲氨蝶呤的浓度。

在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的甲氨蝶呤的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，由于标准溶液中含有内标物，因此，基于各种浓度标准溶液中的甲氨蝶呤的浓度、内标物的浓度和多个检测结果拟合得到甲氨蝶呤的标准曲线方程。通过对待处理样品进行离心处理，即可得到离心后的血清或血浆，顺次加入内标物和沉淀蛋白试剂进行蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品。利用液质联用仪在与标准溶液相同的检测条件下进行检测，得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中甲氨蝶呤的含量。由于通过蛋白沉淀即可完成对目标物的提纯，而无需通过液液萃取便可完成检测，因此能够缩短待测样品的检测时间。

下面以几个实施例对甲氨蝶呤的检测方法进行详细说明。

实施例1：制备系列浓度的标准溶液

(a)标准储备液的配制：

精确称取甲氨蝶呤标准品4.45mg置于2mL容量瓶，用0.1M的氢氧化钠水溶液进行溶解，并定容于2mL，得到标准储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为24个月。

(b)标准工作液的配制

取适量步骤(a)中标准储备液，用含有50％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释混合，得到含有100-50000ng/mL甲氨蝶呤的标准工作液，并在-80℃条件下保存，有效期为6个月；

其中，其中不同浓度的标准工作液为含有甲氨蝶呤：100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、20000ng/mL、50000ng/mL的系列溶液。

(c)内标储备液的配制

取100μg/mL的内标物甲氨蝶呤-d3标准品作为内标储备液，并在-80℃条件下保存，有效期为24个月。

(d)内标工作液的配制

取400μL步骤(c)中内标储备液，用9600μL含有50％甲醇的水溶液作为稀释液进行稀释，得到4000ng/mL含甲氨蝶呤-d3的内标工作液，并在-80℃保存，有效期为12个月。

(e)标准溶液的标定

分别移取步骤(b)中八种不同浓度的标准工作液10μL置于1.5mL离心管中，向每个离心管中加入10μL的步骤(d)内标工作液，再分别向各个离心管中加入390μL含有6％磺基水杨酸的水溶液，混合制成八种不同浓度的混合溶液，将上述混合溶液在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀0.5-1.5min后，并离心，移取离心后的第二上清液作为标准溶液。

实施例2：拟合标准曲线方程

利用液质联用仪对实施例1中八种标准溶液分别进行检测，得到八种不同浓度的甲氨蝶呤的标准溶液的色谱图。

从上述甲氨蝶呤的标准溶液色谱图中分别得到八种标准溶液中甲氨蝶呤和内标物分别对应的峰面积，以上述每种浓度的标准溶液的色谱图中得到的甲氨蝶呤的峰面积与内标物的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述甲氨蝶呤标准工作液中的浓度与内标物的浓度作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y1＝a*x1+b，并且得出权重系数a、b，权重系数a为标准曲线方程的斜率，权重系数b为标准曲线方程的截距。

上述检测条件包括：

色谱柱：Agilent SB-Aq-C18，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为50mm；

采用等度洗脱，洗脱流动相中的水相包括：含有0.1％甲酸的水溶液；

洗脱流动相中的有机相包括：甲醇溶液，洗脱流动相中的有机相与所述水相的体积比为30％:70％，洗脱时间为2min；

柱温为35℃；流速为0.4mL/min；进样量：4μL。

质谱条件：液质联用仪中的质谱检测器为ESI(+)检测模式；

液质联用仪中的离子源参数为：加热气流速(L/min):10，雾化气流速(L/min):20，加热气温度(℃):350，毛细管电压(V):3500。

其中，液质联用仪中的质谱检测器离子对参数如下述表1所示：

表1

物质名称	母离子	子离子	Dwell	Fragmentor	CE	CAV
							甲氨蝶呤(定性)	455.2	175.1	100	120	40	7
甲氨蝶呤(定量)	455.2	308.2	100	120	20	7
							甲氨蝶呤-d3(定性)	458	137.2	100	120	40	1
甲氨蝶呤-d3(定量)	458	311.1	100	120	20	1

其中，Dewll为扫描时间，Fragmentor为碎裂电压，CE为碰撞电压，CAV：为线性加速电压。

需要说明的是，可按照处理待处理样品时的前处理操作制备不同浓度的标准溶液，即，标准溶液中的涡旋转速时间、沉淀蛋白试剂、加入沉淀蛋白试剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和时间均与实施例3中待测样品的前处理保持一致，以消除系统误差，提高检测结果的准确度。

实施例3：待测样品的前处理

3.1取待处理血液至少2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液血清或血浆为第一上清液，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用。

3.2用移液枪移取10μL实施例1中的内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入100μL步骤3.1中的血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋混合0.5min后，加入沉淀蛋白试剂300μL含有6％磺基水杨酸的水溶液，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min后，获得的第二上清液即为待测样品。

实施例4：待测样品的检测

利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到待测样品的色谱图。

从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中甲氨蝶呤的色谱峰面积和待测样品中内标物的色谱峰面积，将待测样品中的甲氨蝶呤的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y1＝a*x1+b中，由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中甲氨蝶呤的浓度。

综上，采用待测样品的同位素作为内标物，可以避免在对待测样品检测时内标物与待测样品发生反应，而影响待测样品的检测。

实施例5：甲氨蝶呤的检测方法的线性关系和定量限

分别移取步骤(a)中八种不同浓度的甲氨蝶呤标准工作液10μL，分别向移取的每种浓度的甲氨蝶呤标准工作液中加入10μL步骤(b)中的内标工作液和390μL甲醇，混匀后利用液质联用仪按照实施例3中的前处理及实施例2中的检测条件进行测定，其中，本实施例中按照浓度由低至高的顺序进行检测，避免检测时浓度高的混合液对浓度低的混合液产生影响。然后以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明甲氨蝶呤的线性范围和定量限如下：

(1)检测限(LOD)：0.083ng/mL

(2)定量限(LOQ)：0.25ng/mL

(3)线性范围：甲氨蝶呤在2.445ng/mL到1219.51ng/mL范围内，线性良好，相关系数R²﹥0.995。

由本实施例可知，甲氨蝶呤的检测限及定量限分别为0.083ng/mL和0.25ng/mL，灵敏度很高，对甲氨蝶呤含量很低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高度准确性及广泛适用性。

实施例6：甲氨蝶呤的检测方法的回收率和精密度

取实施例1中甲氨蝶呤标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例2中的检测条件进行测定，重复分析测定3批次，甲氨蝶呤的回收率如表2。甲氨蝶呤在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.55％～101.80％，精密度为0.41％～1.87％。

表2甲氨蝶呤加标回收率和精密度

综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法检测血液中甲氨蝶呤的浓度，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

图2为实施例2中的标准溶液中的甲氨蝶呤的色谱图，图3为实施例3中的待测样品中的甲氨蝶呤的色谱图，其中，图2和图3中的甲氨蝶呤和内标物的保留时间一致。图2和图3中，位于上方为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的为甲氨蝶呤的色谱图。

其中，图2的横坐标的单位长度为0.1，图2中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10³；

图3的横坐标的单位长度为0.1，图3中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×10³。

由图2和图3可见，待测样品中的甲氨蝶呤的保留时间与其标准工作溶液一致，该方法以甲氨蝶呤-d3为内标物，甲氨蝶呤的保留时间约为1.05min，内标物的保留时间约为1.05min，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。

实施例7：针对进样量的说明

图4至图6分别对应的试验是与实施例3和4中的试验相对应的平行试验，区别为进样量不同。其中，图4至图6的色谱图中，位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图4是待测样品的进样量为0.1μL的色谱图，图4的横坐标的单位长度为0.1，纵坐标的单位长度为0.025×10²；

图5是待测样品的进样量为10μL的色谱图，图5的横坐标的单位长度为0.1，图5中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图6是待测样品的进样量为20μL的色谱图，图6的横坐标的单位长度为0.1，图6中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²。

具体地，待测样品的进样量为0.1μL-20μL，进样量0.1μL时的信噪比为32.2，可满足定量要求，而进样量超出20μL后会出现溶剂效应，影响待测样品色谱峰的峰型，因此，待测样品的进样量为0.1μL-20μL。

实施例8：针对流速和柱温的说明

图7至图19分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流速和柱温不同，图7至图19中，位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图7为柱温18℃，流速0.2mL/min时的色谱图，图7的横坐标的单位长度为0.1，图7中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图8为柱温18℃，流速0.25mL/min时的色谱图，图8的横坐标的单位长度为0.1，图8中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图9为柱温20℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图9的横坐标的单位长度为0.1，图9中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图10为柱温25℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图10的横坐标的单位长度为0.1，图10中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图11为柱温30℃，流速0.3mL/min时的色谱图，图11的横坐标的单位长度为0.1，图11中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图12为柱温30℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图12的横坐标的单位长度为0.1，图12中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图13为柱温35℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图13的横坐标的单位长度为0.1，图13中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图14为柱温35℃，流速0.5mL/min时的色谱图，图14的横坐标的单位长度为0.1，图14中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图15为柱温35℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图15的横坐标的单位长度为0.1，图15中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图16为柱温40℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图16的横坐标的单位长度为0.1，图16中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图17为柱温50℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图17的横坐标的单位长度为0.1，图17中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图18为柱温60℃，流速0.6mL/min时的色谱图，图18的横坐标的单位长度为0.05，图18中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图19为柱温60℃，流速0.4mL/min时的色谱图，图19的横坐标的单位长度为0.1，图19中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²。

通过图7至图19可见，当流速低于0.25mL/min，柱温低于18℃时，甲氨蝶呤和内标物的保留时间均为2.8min，这样会使得待测样品整体的检测时间过长，影响待测样品检测的时效性。并且由于流动相的流速过低，待测样品在液质联用仪中的离子化效率较差，使得检测信号较差，不利于待测样品的检测。

而当流速大于0.6mL/min，柱温大于60℃时，色谱柱的柱压会超过色谱柱所能承受的压力，当待测样品数量较多时，会对色谱柱造成不可逆的损伤，也会使得待测样品检测的准确性降低。并且，此时的柱温已超过色谱柱所能承受的温度，这样会对色谱柱中的填料造成不可逆的损伤，影响待测样品的检测效果。最重要的是，使得甲氨蝶呤的保留时间小于0.5min，使得甲氨蝶呤出峰过快，由于溶剂峰的保留时间通常在0.5min左右，这样溶剂峰会对甲氨蝶呤的色谱峰造成干扰，不利于识别待测样品。

综上，本发明对待测样品检测的流速在0.25-0.6mL/min区间，柱温在18-60℃区间，可以使得甲氨蝶呤的分析时间均在3.0min之内，缩短待测样品的整体检测时间，提高样品检测的时效性。

实施例9：针对沉淀蛋白试剂的说明

图20至图23分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为沉淀蛋白试剂的不同。图20至图23中，位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图20是沉淀蛋白试剂为甲醇溶液时的色谱图，图20的横坐标的单位长度为0.1，图20中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图21是沉淀蛋白试剂为乙腈溶液时的色谱图，图21的横坐标的单位长度为0.1，图21中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10²；

图22是沉淀蛋白试剂为含有5％三氯乙酸的水溶液时的色谱图，图22的横坐标的单位长度为0.1，图22中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10²；

图23是沉淀蛋白试剂为含有6％高氯酸的水溶液时的色谱图，图23的横坐标的单位长度为0.1，图23中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10²。

通过图3、图20至图23可见，由甲醇溶液、乙腈溶液、三氯乙酸、磺基水杨酸和高氯酸中的至少一种作为对第一上清液进行蛋白沉淀的沉淀蛋白试剂，得到的待测样品的色谱峰均不是前沿峰、拖尾峰，并且色谱峰的峰宽没有出现过宽的情况。并且由于甲醇溶液、乙腈溶液、三氯乙酸、磺基水杨酸和高氯酸为常用试剂，容易获得，因此，可以降低对第一上清液进行蛋白沉淀的难度。

实施例10：针对洗脱流动相的洗脱比例的说明

图24至图31分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为流动相中的有机相与水相的体积比不同。图24至图31中位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图24至图27示出了等度洗脱时，待测样品在洗脱流动相中有机相与水相体积比为20％:80％、25％:75％、22％:78％以及40％:60％条件下的色谱图；

其中，图24的横坐标的单位长度为0.2，图24中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图25的横坐标的单位长度为0.2，图25中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图26的横坐标的单位长度为0.2，图26中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10²；

图27的横坐标的单位长度为0.2，图27中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²。

图28至图31示出了梯度洗脱时，待测样品在不同梯度的洗脱流动相条件下的色谱图；

其中，图28中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：10％:90％；0.01min：80％:20％；1.00min：80％:20％；1.01min：10％:90％；3.00min：10％:90％；图28的横坐标的单位长度为0.3，图28中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³；

图29中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：10％:90％；0.01min：40％:60％；1.00min：40％:60％；1.01min：10％:90％；3.00min：10％:90％；图29的横坐标的单位长度为0.2，图29中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³；

图30中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：10％:90％；0.01min：30％:70％；1.00min：30％:70％；1.01min：10％:90％；3.00min：10％:90％；图30的横坐标的单位长度为0.3，图30中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³；

图31中的有机相与水相比的体积比为：0.00min：40％:60％；0.01min：100％:0％；1.00min：100％:0％；1.01min：40％:60％；3.00min：40％:60％；图31的横坐标的单位长度为0.2，图31中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²。

通过图24至图31可见，当采用等度洗脱方式时，若有机相在洗脱流动相中的占比小于22％时，会使甲氨蝶呤的保留时间增大，待测样品检测时间大于3min，导致待测样品检测时间过长；而有机相在洗脱流动相中体积占比大于40％时，甲氨蝶呤的保留时间小，0.5min之前就出峰，容易产生基质效应。

当采用梯度洗脱时，若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比小于10％时，柱压短时间内无法恢复，导致对待测样品的分析时间过长；若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比大于40％时，甲氨蝶呤的保留时间小，0.5min之前就出峰，容易产生基质效应；若0.00min时有机相在洗脱流动相中体积占比为10％，梯度洗脱过程中有机相在洗脱流动相中体积占比不能小于30％，否则内标物的保留时间过长，在3min内无法出峰，导致对待测样品的分析时间过长。

实施例11：针对洗脱流动相的说明

图32至图37的试验是与实施例3和实施例4中的试验相对应的平行试验，区别为洗脱流动相中添加甲酸的不同。其中，图32图37的中位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图32是洗脱流动相中的水相为蒸馏水、有机相为甲醇溶液的色谱图，其中，图32的横坐标的单位长度为0.1，图32中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图33是洗脱流动相中的水相为含有0.1％甲酸的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液的色谱图，其中，图33的横坐标的单位长度为0.2，图33中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²；

图34是洗脱流动相中的水相为含有10mM乙酸铵的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液的色谱图，其中，图34的横坐标的单位长度为0.2，图34中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×10¹；

图35是洗脱流动相中的水相为含有0.1％甲酸和1mM乙酸铵的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液的色谱图，其中，图35的横坐标的单位长度为0.2，图35中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³；

图36是洗脱流动相中的水相为含有0.1％甲酸和1mM甲酸铵的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的甲醇溶液的色谱图，其中，图36的横坐标的单位长度为0.2，图36中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³；

图37是洗脱流动相中的水相为含有0.1％甲酸的水溶液、有机相为含有0.1％甲酸的乙腈溶液的色谱图，其中，图37的横坐标的单位长度为0.2，图37中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10²。

通过图3、图32至图37可见，洗脱流动相中不添加甲酸、添加甲酸、添加缓冲盐、不添加缓冲盐时，待测样品和内标物的色谱峰的峰型、峰宽均符合测试需求。

实施例12：针对色谱柱的说明

图38至图44分别对应的试验是与实施例3和实施例4相对应平行试验，区别为反相色谱柱的不同。图38至图44中位于上方的均为内标物甲氨蝶呤-d3的色谱图，位于下方的均为甲氨蝶呤的色谱图。

图38是色谱柱为Agilent ZORBAX-XDB-C8时的色谱图，其中，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图38的横坐标的单位长度为0.2，图38中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10²；

图39是色谱柱为Agilent ZORBAX-Extend-C18时的色谱图，其中，填料粒径3.5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图39的横坐标的单位长度为0.2，图39中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10²；

图40是色谱柱为Waters Atlantis-T3时的色谱图，其中，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图40的横坐标的单位长度为0.2，图40中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1.5×10²；

图41是色谱柱为Waters Atlantis-dC18时的色谱图，其中，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图41的横坐标的单位长度为0.2，图41中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10²；

图42是色谱柱为Agilent poroshell 120SB-C18时的色谱图，其中，填料粒径2.7μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图42的横坐标的单位长度为0.2，图42中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.4×10³；

图43是色谱柱为SHIMADZU-SP-C18时的色谱图，其中，填料粒径2.6μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图43的横坐标的单位长度为0.2，图43中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×10⁴，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为2×10²；

图44是色谱柱为IncertSustain-C8时的色谱图，其中，填料粒径5μm，内径为2.1mm，长度为50mm，图44的横坐标的单位长度为0.2，图44中位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10³，位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为1×10²。

通过图3、38至图44可见，利用Agilent SB-Aq-C18、Agilent ZORBAX XDB-C8、Agilent ZORBAX-Extend-C18、Waters Atlantis-T3、Waters Atlantis-dC18、Agilentporoshell 120SB-C18、SHIMADZU-SP-C18以及IncertSustain-C8色谱柱对待测样品进行检测得到的目标物的色谱峰未出现前沿和拖尾的情况，且峰宽也符合检测需求。

需要说明的是，图2至图44的横坐标均为采集时间(min)，纵坐标均为离子信号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃····〃”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。