在禽细胞系上生产病毒疫苗

文档序号：90512 发布日期：2021-10-08 浏览：29次 >En<

阅读说明：本技术 在禽细胞系上生产病毒疫苗 (Production of viral vaccines on avian cell lines ) 是由 M·罗莎-卡拉特拉瓦 G·博文 J·迪布瓦 M·A·皮佐诺 O·特利尔 A·特拉韦尔西于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及永生化细胞系ECACC 09070703用于生产由源自人间质肺病毒(metapneumovirus)的减毒株组成的病毒疫苗的用途,其中永生化细胞系于2009年7月7日以编号09070703保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC,英国索尔兹伯里)。(The present invention relates to the use of the immortalized cell line ECACC 09070703, deposited at the european collection of cell cultures (ECACC, soltzbury, uk) with number 09070703 on 7.7.2009, for the production of a viral vaccine consisting of an attenuated strain derived from human metapneumovirus (metapneumovirus).)

在禽细胞系上生产病毒疫苗

技术领域

本发明涉及永生化的禽细胞系用于生产肺病毒型病毒的用途，以及由减毒活病毒株组成的病毒疫苗。

背景技术

肺病毒

肺病毒是导致急性呼吸道感染(如细支气管炎、支气管炎或肺炎)的病毒，主要针对风险人群，即5岁以下的幼儿、老年人和免疫缺陷者。

肺炎病毒(Pneumoviridae)科，之前其成员包括在副粘病毒(Paramyxoviridae)科中，包括具有单个负极性的ARN链的包膜病毒，其包括：

-人呼吸道合胞病毒(hVRS)，代表正肺病毒(orthopneumovirus)亚科，以及

-人间质肺病毒(hMPV)，代表间质肺病毒(metapneumovirus)亚科(根据国际病毒分类委员会(ICTV))。

目前，市场上没有针对这些hMPV和/或hVRS病毒的疫苗，也没有任何特异和有效的治疗方法。

hVRS是幼儿呼吸道感染的最常见原因。这种病毒具有高度感染性，主要感染两岁以下的婴儿。

hMPV也是儿科细支气管炎的主要原因之一，占幼儿下呼吸道急性感染住院的5至15％。hMPV感染后住院的儿童平均年龄为6至12个月，即晚于hVRS引起主要出现在0至3个月之间的住院年龄。

这两种病毒也是导致12％至15％的非住院儿童对于上呼吸道感染和下呼吸道感染问诊的病原体(les agentétiologiques)。

在治疗方面，利巴韦林(不能免除副作用)、或者替代的静脉内免疫球蛋白(非常昂贵)，有时可能用于治疗hMPV感染、以及hVRS感染的严重病例。

其它类型的治疗正在开发中和/或在表征过程中，例如融合抑制肽、硫酸化糖胺聚糖、ARN抑制剂和某些免疫调节剂。

目前广泛使用的常用临床方法主要是治疗感染症状，将患者置于呼吸辅助下(施用氧气或机械通气)，并向其施用支气管扩张剂、皮质类固醇和/或抗生素以预防和/或治疗继发性细菌感染。

为预防肺病毒感染而制定的疫苗接种策略

在疫苗接种方面，由于hMPV的主要靶向人群是婴儿、幼儿和老年人，因此处理有效和安全的疫苗至关重要，以减少对这些年龄段具有显著影响的严重呼吸疾病。

因此，开发针对肺病毒(例如hMPV和/或hVRS)的疫苗不仅表示重大的健康挑战，而且表示真正的社会经济问题，其目标是(i)降低与这些感染相关的治疗和住院的昂贵花费，和(ii)在继发性细菌感染的情况下减少抗生素的使用，从而限制耐药性的出现。

迄今为止，已经开发出不同的疫苗策略(Mazur等人，2018)。

例如，Novavax公司开发出“无生命的纳米颗粒”候选疫苗。该疫苗由呈递来自hVRS的F蛋白的纳米颗粒组成，经过遗传修饰以增加其免疫原性。该候选疫苗适用于孕妇，因此可用于对子宫内未出生的胎儿产生瞬时免疫。

基于源自hVRS的F蛋白的重组抗原，GSK公司还在开发用于孕妇的疫苗以免疫子宫内的胎儿。

另一种方法在于使用非致病性病毒载体，例如腺病毒，使它们表达肺病毒抗原。GSK公司目前正在开发一种用于新生儿的候选疫苗，由编码3种主要肺病毒抗原(F、N和M2.1蛋白)的腺病毒组成。

这些疫苗方法基于注射或表达不同形式的重组蛋白。然而，这些方法的缺点是这些蛋白质固有的低免疫原性，本质上只会诱导轻的免疫应答。因此在大多数情况下必须考虑添加潜在有害的佐剂，例如铝盐。

因此，基于使用由减毒的病毒株构成的所谓“减毒活”疫苗的方法将受到青睐。事实上，减毒活疫苗有许多优点：

-它们可以通过鼻内途径施用并模拟野生型病毒自然进入途径，从而诱导与hMPV和/或hVRS感染后生理学上观察到的非常相似的免疫反应；

-这是一种从未被描述为与(在施用失活疫苗后可能会观察到)过度的炎症反应相关的策略；

-这种疫苗策略不需要添加佐剂，减毒活疫苗本质上具有足够的免疫原性以产生令人满意的免疫反应。

这些方法尤其针对6月龄以上的儿童的疫苗接种。

在工业规模上制备减毒活病毒疫苗的困难

通过在体外培养的病毒的宿主细胞上进行病毒复制步骤而生产这些病毒疫苗。选择这些细胞是原代的(primordial)：它们必须同时具备以下(elle doivent lafois)：

(i)所述病毒的宿主细胞，即允许病毒的面对面(vis-à-vis)感染和所述病毒的复制，以及

(ii)“可工业化”细胞，即符合再工业规模上生产疫苗的现行法规。

迄今为止，还没有注册的工业细胞系具有允许和生产针对肺病毒感染的减毒活的候选疫苗的能力。

以其“贴壁”形式培养的实验室细胞系，例如：

-MDCK细胞系，一种犬细胞系，

-Vero细胞系，一种非洲绿猴肾细胞系，常用于细胞培养以检验各种病毒，

-PERC6细胞系，一种人来源的细胞系，以及

-LLC-MK2细胞系，一种源自恒河猴肾细胞的细胞系，在ATCC以编号CCL-7是可获得的，通常用于检验各种病毒感染，

已用于某些候选疫苗的实验开发(见表1至表3)；然而，这些贴壁细胞系不具备在工业规模上使用所必需的特征。

对于具有病毒型复制的疫苗生产，必须建立“可工业化”细胞系，即稳定(“稳健”)、非贴壁、能够在没有(例如)血清的情况下培养、并符合生产用于施用至人或动物的病毒疫苗的监管要求。

尤其通常使用两种类型的细胞系：

-VALNEVA开发的细胞系是源自鸭胚细胞的细胞系；它已经使得有可能开发几种病毒疫苗。

-ProBioGen所销售的细胞系是源自鸡(gallinacées)或人的几种细胞类型。具体地，系源自番鸭细胞(Jordan等人,2009)。这种非常稳定的系能够以工业规模生产源自甲病毒和副粘病毒基因组的载体，以及用于痘病毒的生长。

然而，迄今为止，hVRS和hMPV的生产还不能在本领域技术人员公知的这些已建立的细胞系上进行。

本发明涉及鉴定可工业化永生化的鸭细胞系，其能够复制源自hMPV和/或hVRS的病毒载体，特别是能够复制源自特定hMPV病毒株的减毒活病毒疫苗。

发明内容

目前，不存在任何可能预防肺病毒感染、应对呼吸道的急性感染的疫苗。这部分是由于这些病毒在体外繁殖困难的事实。具体地，还未描述这些病毒能够在已知和良好建立的工业化细胞系(例如和系)中繁殖。

本发明涉及“工业化”细胞系的鉴定，其使得旨在预防hMPV和/或hVRS感染的减毒活病毒疫苗能够复制。

更特别地，本发明涉及永生化细胞系ECACC 09070703用于生产由源自人间质肺病毒(metapneumovirus)的减毒株组成的病毒疫苗的用途，所述永生化细胞系于2009年7月7日以编号09070703保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，英国索尔兹伯里)。

所述病毒疫苗可特别是减毒株，所述减毒株源自包含由序列SEQ ID NO.1所示基因组序列的人间质肺病毒。

根据具体实施方案，所述病毒疫苗是减毒的病毒株，其通过引入至少一个外源基因，特别是编码源自hVRS的抗原(例如，如F融合蛋白)的基因已经进行遗传修饰。

本发明还涉及生产病毒疫苗的方法，所述病毒疫苗由源自人间质肺病毒的减毒株组成，包括以下步骤：

a)使得系的培养物中的细胞感染，所述系是源自人间质肺病毒的减毒病毒株以登录号09070703保藏在ECACC；

b)在步骤(a)中感染的所述细胞在合适的介质中培养持续2至14天的时间；

c)收获在步骤(b)期间生产的由所述减毒的病毒株的感染性病毒颗粒组成的病毒疫苗。

本发明还涉及例如通过上述方法获得的病毒疫苗、以及包含所述病毒疫苗的药物组合物、以及至少一种药学上可接受的载体。

根据另一方面，本发明涉及所述病毒疫苗或所述药物组合物作为药物的用途。

更具体地，本发明涉及所述病毒疫苗或所述药物组合物，其用于预防或治疗病毒感染，特别是肺病毒感染，以及更具体地是人间质肺病毒和/人呼吸道合胞病毒。

本发明还涉及用于实施生产病毒疫苗的方法的试剂盒，其至少包括：

-永生化细胞系ECACC 09070703；和

-源自包含序列SEQ ID NO.1所示基因组序列的人间质肺病毒的减毒病毒株，以及具体是包含SEQ ID NO.2或3所示基因组序列之一的减毒病毒株。

附图说明

图1与野生株CAN98-75、CAN97-82和CAN99-81的复制能力相比，野生病毒株C-85473在细胞中的复制能力。当超过50％的细胞死亡时，停止动力学(^*)。

[图1a]监测细胞的数量作为病毒感染后天数的函数。

[图1b]监测病毒滴度(TCID50/ml)作为病毒感染后天数的函数。

图2野生重组C-85473WT(GFP)和减毒的ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)病毒在细胞中的复制能力。

[图2a]感染后的细胞生长。模拟细胞没有受到感染。

[图2b]重组病毒C-85473WT(GFP)、ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)的感染性。在病毒动力学的14天期间，通过流式细胞术评估感染细胞的百分比(检测通过这些重组病毒表达的GFP)。

[图2c]重组病毒C-85473WT(GFP)、ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)的病毒复制。通过在病毒动力学的14天期间，每2至3天取样本测定在每ml培养介质中感染的颗粒的数量(以TCID₅₀/ml表示)，以测量病毒生产。

图3.在细胞中生产的重组病毒ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)在LLC-MK2细胞和3D重构的人呼吸上皮模型并培养在气液界面(MucilAir^TM)中的复制能力。

[图3a]使用重组的hMPVΔSH-C-85473分别以0.01和0.1的MOI(感染复数)感染LLC-MK2细胞(在左侧)和MucilAir^TM健康的重构的人呼吸上皮(在右侧)的细胞坪(un tapiscellulaire)。在感染呼吸上皮后3、5、7、12和17天后的拍摄照片。

[图3b]使用重组的hMPVΔG-C-85473分别以0.1和0.65的MOI(感染复数)感染LLC-MK2细胞(在左侧)和MucilAir^TM健康的重构的人呼吸上皮(在右侧)的细胞坪。在感染呼吸上皮后3、5、7、12和17天后的拍摄照片。

[图3c]在感染后5、7、12和17天进行顶端表面洗涤液中，通过RT-qPCR评估受感染的上皮的顶端孔中的病毒分泌(N病毒基因的拷贝数)。将减毒重组病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473的病毒复制与细胞中生产的野生重组病毒C-85473的病毒复制进行比较。RT-qPCR的检测阈值是10拷贝的N病毒基因。

[图3d]感染后第17天，从上皮裂解物中通过RT-qPCR评估感染的上皮内的病毒复制(N病毒基因的拷贝数)。将减毒重组病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473的病毒复制与细胞中生产的野生重组病毒WT C-85473的病毒复制进行比较。RT-qPCR的检测阈值是10¹拷贝的N病毒毒因。

图4.在细胞上生产的重组病毒ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)保留了其体内减毒特征。

[图4]使用5x10⁵ TCID₅₀的在细胞上生产的候选疫苗ΔSH-C-85473或ΔG-C-85473，通过鼻内途径感染4至6周龄的BALB/c小鼠，或者培养介质(模拟)作为对照。在感染后9天中，每天监测感染小鼠的体重和死亡率，并且与未受感染的小鼠(模拟)相比较。

具体实施方式

本发明涉及使用永生化细胞系ECACC 09070703用于生产由源自人间质肺病毒(metapneumovirus)的减毒的病毒株组成的病毒疫苗的用途，所述永生化细胞系于2009年7月7日以编号09070703保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC，英国索尔兹伯里)。

ECACC细胞系N°09070703

因此，本发明涉及细胞系的新用途，以登录号09070703保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，并之前在文献中，特别是国际申请WO2007/077256、WO2009/004016和WO 2012/001075中描述。

这些申请涉及制备永生化禽细胞系，并涉及用于其病毒复制的用途。

术语“永生化细胞系”是指能够在体外培养至少35次传代培养(在新培养介质中稀释细胞)，而不会失去其功能特性的细胞。

简而言之，在WO 2012/001075中描述该细胞系，并将其以编号09070701、09070702和09070703保藏在ECACC中，所述细胞系源自鸭(番鸭(Cairina moschata))胚胎细胞，并且通过引入以下核苷酸序列得以永生化：

-源自腺病毒基因组的E1A区域的核苷酸序列，编码ARN 12S和13S；以及

-编码鸭端粒酶逆转录酶(dTERT)的基因。

这些细胞系的主要目的是它们用于复制病毒，例如痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和流感病毒。

最近，Petiot和其合作者(Petiot等，2018)已经证明，以编号09070703保藏在ECACC的禽细胞系可以有利地用于生产不同来源(人、禽、猪)的流感病毒的感染颗粒。

人间质肺病毒的减毒的病毒株

目前正在进行大量研究，目的是生产病毒疫苗，使得能够预防/或治疗间质肺病毒和/或人呼吸合胞病毒感染。

具体地，已经制备源自人间质肺病毒的减毒的病毒株并提出为疫苗。

hMPV临床株的遗传分析主要基于附着表面(G)和融合(F)糖蛋白的序列变化，使得可能定义两个主要组(基因型A和B)和四个“次要”亚组(A1、A2、B1和B2)。接下来认为这些组可以进一步再分为亚系，例如A2a、A2b和A2c(Huck等人，2006；Nidaira等人，2012)。

在广泛研究的病毒株中，可以引用株NL00-1，属于基因型A1；株CAN 97-83属于基因型A2；和株CAN 98-75，属于基因型B2。

在本申请中，术语“病毒”和“病毒株”不加区别地用于指特定病毒株，例如之前鉴定的。

在本发明的意义上，“衍生的株”是指通过在所谓的“原始”病毒株的基因组中引入遗传修饰而获得的重组病毒毒株。原始株有利地是野生株，例如临床分离株。

病毒株的毒力与病毒在给定生物体中繁殖的速度相对应，也就是其入侵速度。因此，“减弱毒力”是指减少病毒在生物体中的入侵速度。

这种减毒可能采取减少病毒株复制能力的形式、减少靶细胞感染能力的形式，或者减少由生物体的病毒感染诱导的病理。

与野生病毒(WT)相比，当病毒株表现出减少的复制能力时，和/或当这些病毒株导致感染性爆发形成更加受限时，尤其是合胞体(病毒感染后相邻细胞融合)时，病毒株视为在体外是减毒的。在体内，与野生病毒株相比，减毒的病毒株以较低的最大负载进行复制和/或诱导较不严重的病理(在体重减轻或炎症特征或组织病理学障碍方面)。

因此，在本发明的意义上，“减毒的病毒株”视为重组病毒，与原始病毒株的毒力相比其毒力减少，即低于原始病毒株的毒力。

为测量病毒株的毒力，可以进行体外、离体或体内检验，例如体外复制能力检验(通过TCID₅₀/ml病毒测定或通过定量PCR定量病毒基因组进行定量)，通过显微镜观察体外和离体细胞病变效应的演变(例如，在3D重构的人呼吸模型中并在气液界面培养)来监测，或监测病理学的临床症状和测量在体内感染模型中的肺病毒滴度。

下面的表1、2和3列出正在开发的不同方法，以获得来自野生hMPV病毒株的减毒活疫苗。

表1.已经开发的或正在开发的，在hMPV株的基础上具有一个或多个突变的减毒候选疫苗的列表

该符号√表示所使用的细胞易于/允许被所述病毒株病毒感染。

以下缩写用于体内研究模型：M代表小鼠；H代表仓鼠；CR代表棉鼠；CM代表食蟹猴(Cynomolgus Macaque)；AGM代表非洲绿猴；Ch代表黑猩猩；Rh代表恒河猴(Sing Rhésus)；以及SCID代表重症联合免疫缺陷。

缩写“aa”表示氨基酸，“aa172”表示在蛋白质序列中位置172的氨基酸。

点突变可以根据本领域技术人员已知的命名法来表示。

表2.已经开发的或正在开发的减毒活的候选疫苗列表，包括具有至少一个基因的完全缺失的hMPV株

该表2中开发和描述的所有减毒的病毒株源自A2亚组的野生株CAN97-83。

使用以下缩写：

Δ：完全缺失基因。＝未减毒或更具复制性。

表3.基于嵌合的hMPV株，已开发或正在开发的减毒活候选疫苗的列表

使用以下缩写：

TM＝跨膜结构域；PIV＝副流感病毒；SeV＝仙台病毒。

已在以下概述的申请或专利中描述源自hMPV的其它减毒株。

国际申请WO2005/014626涉及几种hMPV株，命名如下：CAN 97-83、CAN 98-75和hMPV 00-1。该申请描述一种重组hMPV株，命名为CAN 97-83，经遗传修饰以减弱其毒力。所提出的修饰特别涉及编码G和/或SH蛋白的基因完全缺失。

专利US 8,841,433进一步描述其它分离的hMPV株及其用于制备疫苗的用途。

在专利申请FR1856801中，已经描述源自人间质肺病毒临床株的减毒株C-85473(其包含由序列SEQ ID NO.1所示基因组序列)，并提议将其作为候选疫苗。这些减毒株包括所述序列SEQ ID NO.1的一个或多个遗传修饰，特别是编码所述间质肺病毒株的SH蛋白的基因的失活和/或编码所述间质肺病毒株的G蛋白的基因的失活。

所有这些源自人间质肺病毒的减毒的病毒株都是候选疫苗，它们能够在工业上开发以大规模生产旨在用于许多患者施用的疫苗，以达到预防和/或治疗的目的。

然而，为了实现这一目的，有必要鉴定细胞支持物，使已鉴定的减毒的病毒株能够在工业规模上得以复制。

对工业细胞系(例如，和系)进行检验，不能获得充分复制的源自人间质肺病毒的不同病毒株。

本发明旨在响应这种需要，已经鉴定一种具有适用于工业规模病毒生产的功能特性的永生化细胞系，用于复制源自人间质肺病毒的这种减毒株。

根据发明的一个实施方案，已经通过失活编码间质肺病毒的SH蛋白的基因和/或编码间质肺病毒的G蛋白的基因对所述减毒株进行遗传修饰。

在发明的意义上，遗传修饰特指原始核苷酸序列的所有修饰，例如缺失一个或多个核苷酸、添加一个或多个核苷酸以及替换一个或多个核苷酸。这些修饰特别包括能够移动遗传阅读框、或在编码序列中间引入终止密码子的所有修饰。

在旨在减弱病毒株毒力的遗传修饰中，众所周知，遗传修饰可能失活或者甚至缺失一个或多个编码对病毒在培养中生长非必需的蛋白的基因。

在本发明的意义上，基因的失活指该基因以这样的方式被修饰的事实：基因的产物不再表达、以非活性形式表达、或以如此少量表达使得该蛋白质的活性是不存在的。可以通过本领域技术人员熟知的任何技术进行基因的这种失活。特别地，基因的失活可以通过以下获得:在基因中引入点突变、通过基因的编码序列的部分或全部缺失、或者通过改变基因的启动子。将根据本领域技术人员熟知的任何一种分子生物学技术进行这些不同的遗传修饰。

例如，通过缺失编码SH、G和/或M2-2辅助蛋白的基因已经获得人间质肺病毒的减毒的病毒株(参见表2)。

SH蛋白也是II型膜蛋白，其功能仍未完全表征。在hVRS的情况下，缺失编码SH蛋白的基因产生能够在体外繁殖的重组病毒，并且其毒力在小鼠的上呼吸道中减弱，但在所述呼吸道的下部并没有减弱(Bukreyev等人，1997)。在hMPV的情况下，SH蛋白的功能仍在评估中。

G蛋白也是II型膜蛋白，其C末端在细胞外部。该蛋白对于病毒成分的组装以及在体外复制不是必需的。对于hVRS，已经表明缺失编码该蛋白的基因减弱了小鼠呼吸道感染过程中株的毒力(Teng等人，2001)。对于hMPV，G蛋白的功能仍在评估中。

根据本发明的一个实施方案，减毒的病毒株的特征在于遗传修饰，其包括编码G蛋白和SH蛋白的两个基因的失活。

根据另一具体实施方案，两种基因的失活对应于编码G和SH蛋白的一个或另一个或两个基因的完全缺失。

根据本发明的一个实施方案，所述减毒株已经通过引入至少一个外源基因进行遗传修饰。

该外源基因具体可以是编码病毒抗原的基因。

在本发明的意义上，“病毒抗原”被理解为是指由病毒表达的蛋白元件或另一性质的元件，个体的免疫系统将其识别为外来的，并且特别通过产生特异性抗体引起所述个体的免疫应答。

病毒抗原可以具体选自：至少一种流感病毒表达的抗原、或至少一种肺病毒科的病毒(例如hVRS)表达的抗原、或至少一种副粘病毒科的病毒(例如副流感病毒)表达的抗原。

更具体地，所述病毒抗原可以选自：hVRS的全部或部分F蛋白，以及流感病毒或副流感病毒的全部或部分血凝素。根据另一个实施方案，如在文献中所述，所述病毒抗原是处于融合前稳定构象的hVRS的F蛋白(Krarup A等人，2015)。

这种还包含外源病毒抗原的减毒的病毒株在将其施用给患者期间，将可能产生针对表达的外源病毒抗原和针对hMPV的多重免疫应答。除了单次施用之外，这种株能够获得针对若干病毒的联合免疫应答，是非常有利的。

hMPV C-85473的病毒株

根据本发明的一个优选实施方案，所述减毒株源自包含由序列SEQ ID NO.1所示基因组序列的人间质肺病毒。

优选地，所述减毒株源自从加拿大的患者样本中分离的人间质肺病毒的病毒株，命名为C-85473。该株属于间质肺病毒的A1亚组。

该病毒株C-85473的完整基因组序列包含13394个核苷酸，在专利申请FR1856801中首次公开。它在本文序列表中参考SEQ ID NO.1表示。

株C-85473的特征在于高融合能力，使其能够以高频率和/或高感染度渗透到靶细胞中(Dubois等人，2017)。该株的高融合能力使其有可能产生合胞体，即巨大的多核细胞，具体是由许多细胞核组成。

根据本发明的一个优选实施方案，所述减毒的病毒株源自包含由序列SEQ IDNO.1所示基因组序列的该株C-85473。

将该株C-85473引入遗传修饰以获得所谓的“衍生”株的目的是减弱所述原始株的毒力，而不是改变其基因组的特性(l’identité)。

具体地，这些遗传修饰仅关注编码对病毒生长不必需的蛋白的(或者称为“辅助蛋白”，例如SH和G蛋白)基因。

有利地，该株经遗传修饰以使得成为“减毒的”，原始株rC-85473的F蛋白的肽序列未被修饰，因此具有与原始株相同的肽序列。

以一个完全优选的方式，减毒的病毒株选自：

(i)源自株C-85473的、通过失活编码SH蛋白的基因进行遗传修饰的病毒株；

(ii)源自株C-85473的、通过失活编码G蛋白的基因进行遗传修饰的病毒株；以及

(iii)源自株C-85473的、通过失活编码SH蛋白的基因和编码G蛋白的基因进行遗传修饰的病毒株。

实施方案(i)中所示的病毒株具体是在本申请的示例中使用的株，其包含例如SEQID NO.2所示核苷酸序列。

实施方案(ii)中所示的病毒株具体是在本申请的示例中使用的株，其包含例如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。

根据本发明的一个实施方案，减毒的病毒株C-85473的核苷酸序列还可以通过引入至少一个外源基因来进行遗传修饰。

因此，减毒的病毒株C-85473具有包含至少一个外源基因的基因组序列。该外源基因具体可以是编码病毒抗原的基因。

所述病毒抗原可以具体选自：至少一种流感病毒表达的抗原、或至少一种肺病毒科的病毒(例如hVRS)表达的抗原、或至少一种副粘病毒科的病毒(例如副流感病毒)表达的抗原。

更具体地，所述病毒抗原可以选自：hVRS的全部或部分F蛋白，以及流感病毒或副流感病毒的全部或部分血凝素。

根据另一个实施方案，如在文献中所述，所述病毒抗原是优选处于融合前稳定构象的hVRS的F蛋白(Krarup A等人，2015)。

源自株C-85473的这些减毒株的其它特征，其包含由在专利申请FR1856801和国际申请PCT/FR2019/051759中所描述的序列SEQ ID NO.1所示基因组序列。

减毒的病毒株的起源

用于实施本发明的减毒的病毒株可以源自各种起源。

已经可以从患有肺病毒(特别是hMPV或hVRS)病毒感染的患者中分离减毒的病毒株。实际上，某些感染性病毒株可自发地具有减毒特征。

也可以由非减毒的病毒株经遗传修饰得到减毒的病毒株。

根据第一个实施方案，通过所述病毒在细胞培养中的繁殖可以获得减毒的病毒株。由此生产的感染性病毒颗粒的冷冻样本可以特别是由学术实验室或医院提供。

根据第二个实施方案，可以使用反向遗传技术从ADN序列中获得减毒的病毒株，特别描述在文献中(Biacchesi等人，2004)和(Aerts等人，2015)

该技术的原理是，例如基于使用仓鼠肾细胞系(BHK-21)进行修饰以使其组成型表达T7噬菌体的ARN聚合酶(BHK-T7或BSR-T7/5细胞)，能够生产重组hMPV。

基因组元件分布在五个质粒元件中：一个编码hMPV反基因组的质粒和四个“卫星”质粒，它们编码转录机制的病毒蛋白(L、P、N和M2-1)。

将hMPV的反基因组质粒和四个“卫星”质粒共转染在这些细胞中后，对应于病毒基因组链的ARN链(负ARN链)被T7聚合酶从其启动子开始转录。

实际上，转染的宿主细胞表达参与hMPV病毒转录的四种蛋白质，从而构成了一种活性ARN依赖性ARN聚合酶(RdRP)复合体。因此，这种功能性病毒聚合酶将基因组ARN转录为病毒ARNm，然后通过模板链的转录将其复制到病毒基因组ARN的新分子中。

因此，病毒蛋白与基因组ARN的翻译和组装，可以使感染性hMPV颗粒从转染的BHK-T7细胞的质膜中出芽。接下来，由于在共培养物中添加了LLC-MK2细胞(ATCC CCL-7)，因此能够进行重组病毒的扩增以允许感染。

因此，从本申请中描述的序列和合适的宿主细胞，本领域技术人员能够生产包含这些序列之一的功能性重组包膜病毒。

生产病毒疫苗的方法

根据另一方面，本发明涉及生产如上定义的病毒疫苗的方法，包括以下步骤：

a)通过源自人间质肺病毒的减毒的病毒株感染培养的ECACC 09070703系中的细胞；

b)在步骤(a)中感染的所述细胞在合适的介质中培养2至14天持续时间；

c)收获步骤(b)期间生产的由所述减毒的病毒株的感染性病毒颗粒构成的病毒疫苗。

将特别是通过上述技术之一获得在步骤(a)中使用的减毒的病毒株。

应当理解，该方法可以包括附加步骤、任选的、并且在此处不指示。

此外，根据具体的实施方案，该方法可以准确由在上述三个连续步骤(a)、(b)和(c)组成。

将在适当的条件下进行感染的步骤(a)，例如在以下条件下：

-感染介质可以是适用于细胞系的OptiPRO^TMSFM(Gibco^TM)培养介质，并补充有4mM的L-谷氨酰胺，0.1％至0.5％的以及终体积的0.1μg/ml至3μg/ml的胰蛋白酶。不仅在感染期间，而且在整个病毒生产期间每2至3天，将胰蛋白酶补充到介质中；

-细胞的细胞密度将包含在0.5x10⁶和5x10⁶细胞/ml之间；以及

-将以在1至0.0001之间的感染复数(MOI)下进行减毒的病毒株的感染。

将在本领域技术人员熟知的细胞正常生长的适当条件下进行步骤(b)的感染细胞的培养。具体是：

-用于生物生产悬浮细胞的设备可以是型的设备或者Kühner型摇床培养箱中的50m至200ml烧瓶，或微BioReactor Applikon BioTechnology型的500ml至2升生物反应器，或UniVessel SU Sartorius Stedim Biotech型的设备；以及

-培养介质的温度将在33至37℃之间；pH在7到7.4之间；以及搅拌速度在100至200rpm之间和氧含量在40至60％之间。

细胞培养步骤可持续2至14天，作为病毒的细胞生长和复制能力的函数。培养步骤具体可以进行3至12天、或4至10天、或者5至9天、或6至8天。

收获感染性病毒颗粒的步骤(c)将通过本领域技术人员熟知的任何技术进行，例如澄清生产培养介质，然后纯化、浓缩和定量病毒颗粒的步骤。

根据另一方面，本发明涉及能够通过上述方法获得的病毒疫苗。所述病毒疫苗由在所述方法的步骤(c)中收获的感染性病毒颗粒构成。

根据另一个实施方案，本发明涉及通过上述方法获得的病毒疫苗。

药物组合物

根据另一方面，本发明涉及包含所述病毒疫苗的药物组合物和至少一种药学上可接受的载体。

在本发明的意义上，“药学上可接受的载体”是指载体或赋形剂，即不具有治疗特性的“无活性”组分。这些载体或赋形剂可以施用于个体或动物，没有显著有害效果或抑制性的不利作用。

通常用于药物组合物中的其它活性组分可以存在于所述组合物中：例如，佐剂和/或赋形剂。

应当理解，根据本发明的药物组合物包含至少一种有效量的病毒疫苗。

在本发明的意义上“有效量”是指在其所施用的生物体中足以触发免疫反应的减毒的病毒株的量。

本药物组合物也可以指疫苗组合物。

根据本发明的药物组合物特别适合于口服、舌下或通过吸入来施用。

根据特定实施方案，根据本发明的药物组合物适合于吸入(即鼻和/或口服)施用。

吸入指通过呼吸道吸收。具体地，这是一种用于吸收治疗目的化合物、吸收气体形式、悬浮剂中的微滴或粉末形式的某些物质的方法。

吸入施用分为两种类型：

-当组合物为粉末形式时，通过吹入法施用，和

-当组合物为气雾剂(悬浮剂)形式或溶液形式(例如加压水溶液)时，通过雾化施用。然后将推荐使用雾化器或喷雾剂来施用药物组合物。

因此，此处考虑的药物组合物的盖仑剂型有利地选自：粉末、滴的水性悬浮剂或加压溶液。

根据优选的实施方案，根据本发明的药物组合物适合通过鼻途径施用，特别是通过吸入施用。

这种组合物可用作预防性疫苗，即旨在病原体病毒感染生物体之前刺激特异性免疫反应。

这种组合物也可用作治疗性疫苗，即旨在刺激病原体病毒感染生物体相伴随的特异性免疫反应。

治疗用途

本发明还涉及如上所述的病毒疫苗、或如上所述的药物组合物作为药物的用途，换言之其治疗用途。

有利地，该病毒疫苗或该药物组合物将用于治疗和/或预防病毒感染的疗法。

表述“治疗病毒感染”是指在生物体中对抗病毒感染的事实。目的是获得减少生物体中的传染性病毒负载(感染滴度)，并且优选地获得从生物体中完全根除病毒。术语“治疗”也指减轻与病毒感染相关的症状(呼吸综合征、肾功能衰竭、发烧等)的作用。

表述“预防病毒感染”指在生物体中预防、或至少减少感染发病的风险的事实。由于这种预防作用，所述生物体的细胞更少允许(permissives)被病毒感染，以及因此对所述病毒的感染具有更强抗性。此外，生物体将有利地发展出特异性免疫细胞，从而能够以特定方式对抗前述病毒，从而限制其进入生物体的细胞。

更具体地，本发明涉及如上所述的病毒疫苗或药物组合物，用于预防病毒感染，特别是肺病毒感染，以及特别是人间质肺病毒感染和/或人呼吸道合胞病毒感染。

根据第一个实施方案，所述病毒疫苗或所述药物组合物用于预防肺病毒感染。

根据第二个实施方案，所述病毒疫苗或所述药物组合物用于预防人间质肺病毒的感染。

根据第三个实施方案，所述病毒疫苗或所述药物组合物用于预防正交病毒感染，具体是人呼吸道合胞病毒感染。

根据另一方面，本发明涉及如上所述的病毒疫苗或药物组合物，用于治疗病毒感染，特别是肺病毒感染，更具体地人间质肺病毒的感染和/或人呼吸道合胞病毒的感染。

实际上，在某些情况下和在某些条件下，所述病毒疫苗或包含其的药物组合物可以用于已经被这些病毒之一感染的个体(特别是在成年个体中)的治疗方法。

本发明还涉及预防人的病毒感染的方法，特别是肺病毒感染，更具体是人间质肺病毒和/或人呼吸道合胞病毒感染，包括向易于感染这种病毒的个体施用有效量的如上所述的病毒疫苗，或包含其的药物组合物。

所述疫苗或所述组合物用于预防和/或治疗病毒感染的用途旨在用于所有类型的个人，旨在用于任何类型个体，而不仅是新生儿或者老年成人个体。

根据本发明的优选实施方案，用于预防和/或治疗病毒感染用途的所述疫苗或所述组合物旨在用于儿科用途，即旨在施用于儿科群体。

在本发明的意义上，儿科群体是指由小于18岁的人，以及更具体地小于5岁的幼儿和婴儿组成的个体的群体。

事实上，肺炎病毒科的病毒主要感染这些个体，其倾向于表现出所谓的“幼稚”免疫力，因此较年长个体更弱。

最后，本申请还涉及用于实施制备病毒疫苗方法的试剂盒，包括：

-永生化细胞系ECACC 09070703；和

-源自人间质肺病毒的减毒的病毒株，其包含由序列SEQ ID NO.1所示基因组序列。

特别是通过失活编码所述间质肺病毒株SH蛋白的基因和/或编码所述间质肺病毒株的G蛋白的基因，已经对所述减毒的病毒株特别地进行遗传修饰。

因此，所述减毒的病毒株可具有包含至少一个外源基因的基因组序列。该外源基因具体可以是编码源自另一病毒的病毒抗原的基因，例如，如hVRS的F蛋白的全部或部分，和/或流感或副流感病毒的血凝素的全部或部分。

根据优选的方面，所述病毒株将具体是本申请的实施例中描述的株之一：

i)病毒株，其包含如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，任选地还包含至少一个外源基因；或者

ii)病毒株，其包含如SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，任选地还包含至少一个外源基因。

该试剂盒还可以包括其它元件，例如，如适用于细胞系生长的培养介质，和/或使用说明指定用于制备减毒活病毒疫苗的理想条件。

实施例

实施例1.用细胞系用于亚组A1(C-85473和CAN99-81)、亚组B1(CAN97-82)和亚组B2(CAN98-75)的野生病毒株的复制。

将细胞在37℃下，在5％CO2和85％的湿度(d'hygrométrie)下、以175rpm的速度，培养在Kühner摇床中50ml TubeSpin中的OptiPro+4mM L-谷氨酰胺的最终介质中，并且将细胞在10ml介质中稀释成1x10⁶细胞/ml。在0.5μg/mL的胰蛋白酶(T6763Sigma)存在下，使用亚组A1(C-85473和CAN99-81)、亚组B1(CAN97-82)和亚组B2(CAN98-75)的野生病毒株(非GFP)通过0.01的感染复数(MOI)感染所述细胞。

每2至3天在台盼蓝中计数细胞以评估病毒感染期间的细胞生长以及细胞死亡。结果如图1a所示。

通过在感染后至感染后14天，每2至3天取样本测定在每ml培养介质中感染的颗粒的数量(以TCID₅₀/ml表示)，以测量病毒生产。结果如图1b所示。

当细胞死亡超过50％以上，即对于病毒株C-85473而言为感染后8天，对于病毒株CAN99-81、CAN97-82和CAN98-75为感染后14天，停止病毒复制动力学。

结果表明，只有病毒C-85473在感染细胞期间扩增，在7天内病毒滴度的增加超过2log10。在感染后4至9天病毒CAN98-75显示出低的病毒生产，而直至感染后14天，可检测病毒CAN99-81和CAN97-82水平少于初始接种物或低于检测阈值。

总之，在细胞上，病毒株C-85473具有非常明显高于其它hMPV病毒株的复制能力。具体地，感染后8天观察到的细胞死亡水平说明该株对该细胞系的感染能力是显著的。

实施例2.使用细胞系用于以下的复制：野生株C-85473WT、因重组而表达绿色荧光蛋白(GFP)、以及重组的病毒株ΔSH-C-85473(GFP)和ΔG-C-85473(GFP)。

在该实施例中使用的病毒株具有以下基因组序列：

-序列C-85473WT-GFP以SEQ ID NO:4表示；

-序列ΔSH-C-85473-GFP以SEQ ID NO:5表示；

-序列ΔG-C-85473-GFP以SEQ ID NO:6表示。

将细胞在37℃下，在5％CO2和85％的湿度下、以175rpm的速度，维持培养在Kühner摇床中的50ml TubeSpin中的OptiPro+4mM L-谷氨酰胺的最终介质中。

在感染之前，将细胞在10ml的培养介质中稀释至1x10⁶细胞/ml，然后在0.5μg/ml的胰蛋白酶(T6763 Sigma)存在下，通过0.01的感染复数(MOI)使用以下感染所述细胞：野生重组的hMPV(C-85473WT)、或缺失编码SH蛋白的基因组序列(ΔSH-C-85473)、或缺失编码G蛋白的基因组序列(ΔG-C-85473)。“模拟”细胞是未被感染的细胞，并构成实验的阴性对照。

感染后每2至3天在台盼蓝中计数细胞，以评估感染过程中的细胞生长。所获得的结果在图2a中显示。

当细胞死亡超过50％以上，即平均14天后，停止病毒复制动力学。

在病毒动力学的14天期间通过流式细胞术评估感染细胞的百分比(通过重组病毒所表达的GFP的表达来检测)。所得结果如图2b所示。

通过在动力学的14天期间，每2至3天取样本测定在每ml培养介质中感染的颗粒的数量(以TCID₅₀/ml表示)，以测量病毒生产。所得结果如图2C所示。

获得的结果由四个独立的实验表示。

这些结果表示，在这些培养和病毒感染条件下，细胞(i)在感染后7天达到其最大浓度；(ii)在感染后9至11天之间，被野生病毒株和修饰的病毒株ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473感染超过80％。

三种病毒株的病毒生产峰位于感染后11天。

总之，结果说明系是“可行的”，因为其可以被重组病毒C-85473感染以及特别是活的减毒的病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473所感染，并能够生产病毒颗粒。

实施例3.根据实施例2的培养方法获得的病毒颗粒的表征

与重组病毒C-85473WT相比，该实施例涉及测量在细胞上生产的重组病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473的复制能力：

(i)在猴肾上皮细胞LLC-MK2(ATCC-CCL7)中，和

(ii)3D重构的人肺上皮模型(MucilAir^TM,Epithelix)以及培养在气液界面。

使用以下感染LLC-MK2细胞和MucilAir^TM健康的重构的人呼吸上皮细胞的细胞坪：

-分别为0.01和0.1的MOI(感染复数)的重组hMPVΔSH-C-85473；

-分别为0.01和0.65的MOI(感染复数)的重组hMPVΔG-C-85473。

在感染后3、5、7、12和17天拍摄的受感染细胞的照片显示在图3a(ΔSH-C-85473)和图3b(ΔG-C-85473)中。

从感染的第5天开始，分别从上皮裂解物和顶端(apical)表面灌洗液中通过RT-qPCR评估在感染的上皮细胞内的病毒复制以及在感染的细胞的顶端孔中的病毒分泌(N病毒基因的拷贝数)。

结果在图3c(表面洗涤)和图3d(上皮裂解物)中显示。

获得的结果表明，在细胞中生产的活的减毒病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473是具有功能的并且保留它们感染LLC-MK2细胞，具体是重构的3D人肺上皮模型(MucilAir^TM,Epithelix)的能力。

应注意，如图3d所示，与野生病毒C-85473相比，虽然减毒株ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473在人上皮模型中复制较少并且随着时间推移较少持续，但是其在(和附属地LLC-MK2)细胞上的复制率非常令人满意。

对于在生理上接近生物体条件的人感染模型中获得的结果而言，这两种特性使其成为卓越的候选疫苗，这些减毒的病毒株能够容易地在体外生产，并且在引入活生物体时仅具有非常温和的风险。

实施例4.在细胞上生产的重组病毒ΔSH-C-85473和ΔG-C-85473在体内保留其减毒的特性。

使用以下通过鼻内途径感染4至6周龄的BALB/c小鼠：

-在细胞上生产并通过超速离心浓缩的5x10⁵TCID₅₀的候选疫苗ΔSH-C-85473或ΔG-C-85473，或

-最佳培养介质(模拟)作为对照(每组10只小鼠)。

在感染后9天中，每天监测小鼠的体重和死亡率。结果如图4所示。获得的结果说明，在细胞中生产的活的减毒病毒ΔSH-C-85473或ΔG-C-85473感染的小鼠没有显示病理或死亡的迹象，从而证明在细胞中生产的这些病毒的减毒特性。

表4.序列表中存在的序列的总结

专利参考

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序列表

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国家科学研究中心(CNRS)

国家健康科学研究所

(INSERM)

拉瓦尔大学

特兰斯吉恩公司

里昂高等师范学院(ENS LYON)

<120> 在禽细胞系上生产病毒疫苗

<130> B377200PCT D38890

<150> FR1872957

<151> 2018-12-14

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13394

<212> DNA

<213> 间质肺病毒

<400> 1

gcgaaaaaaa cgcgtataaa ttagattaca aaaaaatatg ggacaagtga aaatgtctct 60

tcaagggatt cacctgagtg atctatcata caagcatgct atattaaaag agtctcagta 120

cacaataaaa agagatgtgg gtacaacaac tgcagtgaca ccctcatcat tgcaacaaga 180

aataacgctg ttgtgtggag aaattctgta tgctaaacat gctgattaca aatatgctgc 240

agaaatagga atacaatata ttagcacagc tttaggatca gagagagtgc agcagattct 300

gaggaactca ggcagtgaag tccaagtggt cttaaccaga acgtactctc tggggaaagt 360

taaaaacaat aaaggagaag atttacagat gttagacata cacggggtag agaagagctg 420

ggtagaagag atagacaaag aagcaaggaa aacaatggca accttgctta aggaatcatc 480

aggtaatatc ccacaaaatc agaggccctc agcaccagac acacccataa tcttattatg 540

tgtaggtgca ttaatattta ctaagctagc atcaaccata gaagtgggac tagagaccac 600

agtcagaagg gctaaccgtg tactaagtga tgcactcaag agatacccta gaatggacat 660

cccaaaaatt gccagatcct tctatgactt atttgaacaa aaagtgtatc acagaagttt 720

gttcattgag tatggcaaag cattaggctc atcatctaca ggcagcaaag cagaaagtct 780

atttgttaat atattcatgc aagcttatgg agccggtcaa acaatgctaa ggtggggggt 840

cattgccagg tcatccaaca atataatgtt aggacatgta tctgtccaag ctgagttaaa 900

acaggtcaca gaagtctatg acttggtgcg agaaatgggc cctgaatctg gacttctaca 960

tttaaggcaa agcccaaaag ctggactgtt atcactagcc aactgtccca actttgcaag 1020

tgttgttctc ggaaatgcct caggcttagg cataatcggt atgtatcgtg ggagagtacc 1080

aaacacagaa ttattttcag cagcagaaag ttatgccaaa agtttgaaag agagcaataa 1140

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gaagctttcc agaaatcatt aaggaaacca agtcataaaa gatctcaatc tattatagga 1380

gaaaaagtga acactgtatc agaaacattg gaattaccta ctatcagtag acctgcaaaa 1440

ccaaccatac tgtcagaacc aaagttagca tggactgata aaggtggggc aatcaaaact 1500

gaaataaagc aagcaatcaa agtcatggat cctattgagg aagaagagtc tactgagaag 1560

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taacaataac cactctgtat gctgcatcac aaaatggtcc aatactcaaa gtgaatgcat 2400

cagcccaagg tgcagcaatg tctgtacttc ccaaaaaatt tgaagtcaat gcgactgtag 2460

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tttacttaac aaccatgaaa ccatacggga tggtatcaaa atttgtgagc tcagccaaat 2580

cagttggcaa aaaaacacat gatctaatcg cactgtgtga ttttatggat ctagaaaaga 2640

acacacctgt tacaatacca gcattcatca aatcagtttc aatcaaagag agtgagtcag 2700

ctactgttga agctgctata agcagtgaag cagaccaagc tctaacacag gccaaaattg 2760

caccttatgc gggattgatt atgatcatga ctatgaacaa tcccaaaggc atattcaaaa 2820

agcttggagc tgggactcaa gttatagtag aactaggagc atatgtccag gctgaaagca 2880

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taaaaactaa taactgtcat taagtttatt aaaaataaga aattataatt ggatgtatac 13380

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<210> 2

<211> 12645

<212> DNA

<213> 间质肺病毒

<400> 2