具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面申请人结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

以下实施例中：

1.实验材料

鞣花酸(EA，纯度≥98％，宝鸡市辰光科技)；马兜铃酸I(AAI，纯度≥99％，江苏永健科技医药有限公司)；Hoechst33258染色液(生工生物)、Tunel染色液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL发光试剂盒(碧云天生物技术研究所)；肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)试剂盒(武汉贝莱茵生物科技有限公司)；Trizol裂解液(南京诺唯赞生物科技有限公司)；逆转录/扩增试剂盒(天根生化科技有限公司)；LDH、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)检测试剂盒(南京建成生物研究所)；MEM培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)。

2.实验细胞和动物

人肾小管上皮(HK-2)细胞株购自武汉大学典藏中心，由实验室自传代储存。SPF级KM小鼠40只，体重18-22g，由湖北省疾病预防控制中心提供，实验动物生产许可号：SCXK(鄂)2016-0003。小鼠每天给予充足的水和饲料，1个星期后开始实验。

3.药物及试剂的配制

(1)鞣花酸溶液的配制

精密称取适量的鞣花酸粉末，加入少量的DMSO超声溶解，使其浓度为10mM，将溶液在超净台上用无菌的微孔滤膜进行过滤，过滤得到的溶液于4℃冰箱保存，实验前用MEM培养基稀释至所需浓度。

(2)马兜铃酸I的配制

精密称取适量的马兜铃酸I粉末，加入适量的1wt％NaHCO₃溶液，放入温水中使其加热溶解，配制成1mg/mL的浓度，在超净台上用无菌的微孔滤膜进行过滤，过滤得到的溶液于4℃冰箱保存，实验前用MEM培养基稀释至所需浓度。

(3)完全培养基的配制

按照MEM培养基：胎牛血清：双抗(青霉素、链霉素)＝9：1：0.1的比例(体积比)进行配制，4℃冰箱保存。

(4)冻存液的配制

按照MEM培养基：胎牛血清：DMSO＝5.5：4：0.5的比例(体积比)配制，细胞冻存时现配现用。

(5)5mg/mLMTT的配制

称取0.5gMTT溶解于100mLPBS溶液中，用0.22μm滤膜过滤，分装放-20℃冰箱中避光保存。

(6)TBST溶液的配制

取24.2g的Tris，80gNaCl定容至1L，用HCl调pH至7.6。用时取100mL加入900mL双蒸水和1mL吐温20。

(7)5％封闭液(5％的脱脂奶粉)

称取1g脱脂奶粉溶解于20mLTBST溶液中，搅拌使其充分溶解。

(8)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)

称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液生物pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L。

(9)1×电泳缓冲液的配制

称取1.5g的Tris，7.2g的甘氨酸，0.5g的SDS于烧杯中，加入300mL的蒸馏水超声使其充分溶解，再定容至500mL，所得溶液室温下保存。

(10)1×转膜缓冲液的配制

称取5.8g的Tris，2.9g的甘氨酸于烧杯中，加入200mL甲醇和500mL的蒸馏水超声使其充分溶解，再定容至1000mL，所得溶液室温下保存。

未描述的实验材料也均为常见的市售商品。

实施例1鞣花酸对马兜铃酸I诱导HK-2细胞损伤的保护作用

1.细胞培养

将HK-2细胞培养在含有10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的MEM完全培养基中，并放置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

2.MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的细胞，重悬接种于96孔板，每孔细胞密度为1×10⁴个，5％CO₂，37℃孵育24h。然后分别加入0、5、10、20、40μg/mL不同浓度的AAI孵育24h或48h；同理，分别加入0、2.5、5、10、20、40μM不同浓度的EA，作用24h。根据细胞活力筛选出最佳浓度的AAI和EA；按上述步骤处理细胞并分为空白对照组(Control)、AAI组(加入20μg/mLAAI作用24h)、AAI+EA低、中、高三个剂量组(先分别加入10、20和40μM的EA作用2h，再加入AAI继续培养24h)。培养结束后每孔加入10μLMTT溶液，继续培养4h。弃去培养液，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10min。在酶标仪上检测490nm处各孔的吸光度值(OD)，每组设5个平行孔，重复3次，计算细胞存活率＝(测定孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100％。

3.细胞形态学分析

取对数生长期的细胞，胰酶消化离心后，重悬接种于96孔板，每孔细胞密度为1×10⁵个，5％CO₂，37℃孵育24h，加入不同浓度的EA(20μM，40μM)孵育2h，然后再加入终浓度为20μg/mL的AAI刺激24h后，在倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。

4.LDH检测

将对数生长期的HK-2细胞接种于12孔板中孵育24h，然后分为空白对照组(Control)、AAI组(AAI20μg/mL作用24h)、AAI+EA低、高两个剂量组(EA20μM和40μM分别作用2h，再加入终浓度为20μg/mL的AAI继续培养24h)，每组设置三个平行组，待培养结束后收集细胞培养液上清，按照试剂盒说明书检测LDH活力。

5.Hoechst33258染色法检测细胞凋亡

将细胞接种于12孔板(2.5×10⁵个/mL)中24h，加入不同浓度的EA(20μM，40μM)处理2h后，每组再加入终浓度为20μg/mL的AAI刺激24h；每孔加入0.5mL的Hoechst33258染色剂孵育30min，吸除Hoechst33258染色液，然后用PBS洗涤3次，每次5min，在荧光显微镜下观察并拍照。

6.WesternBolt检测细胞内蛋白的表达

准备两个细胞6孔板，其中一个板按项“4”中的方法将细胞进行分组处理；另一个6孔板中的细胞在孵育24h后分为空白对照组(Control)、NF-κB抑制剂组(Bay10μM)AAI组(AAI20μg/mL作用24h)以及AAI+Bay组(10μM Bay作用于4h后再加入终浓度为20μg/mL的AAI继续培养24h)，每组设置三个平行组，培养结束后收集细胞上清，低温下12000g离心5min弃去上清；PBS洗三遍后加入蛋白裂解液(RIPA/PMSF＝100:1)，用细胞刮轻轻刮六孔板底部，冰上进行裂解15min后将裂解液移至1.5mLEP中，4℃，12000g离心5min，小心吸取上清至干净的EP管中，加1/4体积的蛋白上样缓冲液，混匀后蛋白煮沸5min使其变性。在12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离蛋白质。将蛋白质转移到PVDF膜上。室温下，将转好的PVDF膜与5％的脱脂奶粉一起孵育来阻断非特异性结合。用TBST洗涤三次并与p-IκBα(1:2000)、IκBα(1:1500)、p-NF-κBp65(1:1000)、NF-κBp65(1:1000)、NLRP3(1:500)、ASC(1:1000)、Caspase-1(1:1000)、GSDMD(1:1000)、L-1β(1:1000)和GAPDH(1:1000)一起室温孵育2h。用TBST洗涤四次后，将PVDF膜与山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1:1000)室温下孵育1h。TBST洗膜后，用BeyoECL PlusA液和B液按1：1混匀进行显色，ImageJ分析软件定量和分析蛋白质条带的密度。

7.RNA提取

将对数生长期的HK-2细胞接种于6孔板中，每孔5×10⁵个细胞，按项“4”中的方法将细胞进行分组处理。收集细胞上清，低温下12000g离心5min弃去上清，收集沉淀下来的细胞和六孔板中的细胞一起用PBS洗三遍，每孔加入1mL的Trizol裂解液将细胞吹打下来，将裂解液转移至1.5mL离心管中，移液枪反复吹打至无明显颗粒样存在，冰山静置5min。加入200μL的氯仿，剧烈震荡成乳浊液后，4℃静置5min，12000g4℃离心15min。取出后小心吸取上层水相至一新的EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min，12000g4℃离心10min。小心弃去上清，并加入1ml预冷的75％乙醇，充分洗涤管盖和管壁，轻弹管底，让沉淀悬浮起来，静置5min。之后12000g4℃离心5min，弃去上清，敞口干燥3min，加入40μLDEPC水溶解沉淀，取1μLRNA至检测器上检测260nm、280nm的OD值，并计算OD₂₆₀/OD₂₈₀，其余在-80℃储存，以上操作均在无酶条件下进行。将上述中提取的RNA参照试剂盒说明书立即进行逆转录和扩增，得到的cDNA存储于-80℃冰箱用于后续的检测。

8.数据统计与分析

实验结果均以表示，所有的数据均使用GraphPadPrism5.0(GraphPadSoftware，LaJolla，CA，USA)软件作图分析。组间差异通过单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析，P<0.05被认为差异具有统计学意义。采用Image J软件对荧光结果图进行量化处理和Western-bolt条带的灰度分析。

9.实验结果

1)不同浓度的AAI对HK-2细胞存活率的影响

采用MTT法分别检测了不同浓度的AAI在24h和48h的细胞存活率。如图1所示，细胞存活率随着AAI浓度和时间的增加而呈现下降趋势，24h时，AAI浓度为20μg/mL时，细胞存活率为70％，当浓度高于20μg/mL时，细胞存活率为65％左右；48h时，AAI浓度为5μg/mL时，细胞存活率为70％左右，当浓度高于5μg/mL时，细胞活力下降低至50％以下，综合时间和剂量，确定AAI的最佳浓度和时间为20μg/mL作用24h。

2)不同浓度的EA对HK-2细胞活力的影响

为了确定EA在体外对HK-2细胞是否有影响，采用MTT法检测了EA对细胞活力的影响，结果发现(如图2)：在0-40μM浓度的EA处理24h后，HK-2细胞的活力基本不受影响。因此选择10、20和40μM的EA浓度进行后续的实验。

3)EA对AAI诱导的HK-2细胞存活率的影响

根据图1和图2中的结果，申请人选择AAI的浓度为20μg/mL作用时间为24h，EA的浓度为10、20和40μM来检测EA对AAI诱导的HK-2细胞存活率的影响。如图3所示：申请人发现与AAI组相比，EA对AAI诱导的细胞损伤有一定的缓解作用，其中EA浓度为20和40μM时，对损伤的细胞的缓解作用较为显著，因此，选择20和40μM的EA用于后期细胞实验。

4)EA改善AAI诱导的细胞毒性

LDH是由细胞膜受损引起细胞死亡的一个重要指标。如图4所示，从细胞形态学和LDH检测结果申请人发现：与空白组相比较，AAI组LDH水平明显升高，细胞大量死亡，而EA预处理后LDH水平和细胞形态有明显的降低和改善，说明EA对AAI诱导的HK-2细胞毒性有保护作用。

5)EA对AAI诱导HK-2细胞凋亡的影响

Hoechst33258荧光染色是一种经典的细胞凋亡检测方法。如图5所示，申请人发现对照组的细胞核呈正常的蓝色，无蓝色荧光细胞核，说明对照组无细胞凋亡。与对照组比较，AAI组中的细胞呈碎块状致密浓染，大量的蓝色荧光，表明细胞凋亡。而EA预处理组中蓝色荧光逐渐减少，凋亡明显得到改善。

6)AAI对NF-κB/NLRP3信号通路的影响

有研究报道在AAI诱导的HK-2细胞中，NLRP3炎性小体被激活。大量研究表明，NF-κB可以活化NLRP3炎性小体及其下游炎症因子。然而，AAI是否可以激活NF-κB信号通路还有待研究。因此，本实验研究了在AAI诱导的HK-2细胞中，NF-κB/NLRP3信号通路的状态。如图6-1所示：与空白对照组相比，不同浓度和不同作用时间的AAI处理HK-2细胞后，NF-κBp65和IκBα蛋白的磷酸化水平呈时间和剂量依赖性增高，NLRP3炎性小体呈时间和剂量依赖性激活，其表现为NLRP3、ASC、Caspase-1及其下游炎症相关因子IL-1β的mRNA表达水平显著升高。这些数据说明，在AAI诱导的HK-2细胞中NF-κB信号通路和NLRP3炎性小体被异常激活。

为了进一步确定NLRP3炎性小体的异常激活是否与NF-κB信号通路有关，本实验通过使用NF-κB抑制剂阻断NF-κB信号通路来检测NF-κB和NLRP3炎性小体在AAI诱导的HK-2细胞中的蛋白表达。如图6-2所示：与空白对照组相比，20μg/mL的AAI作用于HK-2细胞24h后，p-NF-κB、NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平与之前检测的结果相一致；相比于AAI组，加入NF-κB抑制剂(10μMBay)后NF-κB的磷酸化表达明显被阻断，与此同时，NLRP3、Caspase-1和IL-1β的蛋白表达水平也受到抑制显著降低。这些结果说明，在AAI诱导的HK-2细胞中NF-κB信号通路的异常激活进一步的活化了下游的NLRP3炎性小体。

7)EA对AAI诱导HK-2细胞中NF-κB/NLRP3信号通路的影响

本实验研究发现EA对AAI诱导的HK-2细胞的损伤有一定的保护作用，且在AAI诱导的HK-2细胞损伤中NF-κB/NLRP3信号通路被激活。基于以上研究结果，本实验进一步分析了EA对AAI诱导的HK-2细胞损伤的分子机制。采用Western-blot和PCR分析了NF-κB/IκBα相关蛋白的表达和NLRP3炎症小体以及下游GSDMD、IL-1β的蛋白表达和mRNA表达水平。如图7所示：AAI给药后，NF-κBp65和IκBα蛋白的磷酸化水平显著升高，NLRP3炎性小体组分(NLRP3、ASC和caspase-1)和其下游GSDMD、IL-1β的蛋白水平也显著升高，同时NLRP3炎性小体和IL-1β的mRNA表达水平也有所升高。与AAI组相比，EA预处理对NF-κBp65和IκBα蛋白的磷酸化水平和NLRP3炎性小体相关蛋白的高表达有不同程度的抑制作用。这些结果表明，EA对AAI诱导的肾脏炎症的保护作用与抑制NF-κB/NLRP3信号通路的激活有关。

实施例2鞣花酸对马兜铃酸I诱导小鼠急性肾损伤的保护作用

1.动物模型的建立

40只雄性昆明小鼠随机分为对照组(Control)、模型组(AAI10mg/kg)、鞣花酸低剂量组(AAI10mg/kg+EA10mg/kg)和鞣花酸高剂量组(AAI10mg/kg+EA30mg/kg)，每组10只，小鼠按照0.1mL/10g的给药体积进行给药。对照组小鼠每天灌胃生理盐水，持续12d。鞣花酸给药组的小鼠每天连续灌胃不同剂量的鞣花酸12d，第7天给药2h后，模型组和鞣花酸给药组每天腹腔注射AAI，连续5d，建立急性肾损伤模型。最后一次给药小鼠禁食不禁水12h，收集小鼠尿液，摘取眼球取血3000rpm离心得到血清-80℃保存用于生化检测；取出小鼠两侧肾脏，用预冷的生理盐水洗净、拭干，称重并记录(冰上进行所有操作)，左肾放入组织固定液中，用于组织病理学等检查，右肾储存在-80℃下，用于后续各项指标的研究。肾指数、尿蛋白的测定

最后一次给药12h后，称重并记录小鼠体重，收集小鼠尿液，解剖并迅速将小鼠肾脏于冰生理盐水中洗净并记录其重量，计算小鼠的脏器指数：脏器指数＝脏器重量/最终体重×100。用Bradford法检测尿蛋白浓度。

2.肾功能指标的测定

小鼠摘取眼球取血，将刚取出的血液放置于室温1h后于3000rpm离心10min，分离血清于干净的EP管中。按照试剂盒说明书检测血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)的含量，剩余血清放入-80℃冰箱中保存用于后续研究。

3.血清中炎症因子TNF-α和IL-1β含量的测定

将上述步骤中离心得到的血清用于肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)水平的检测。按照ELISA试剂盒说明书将试剂盒放于室温下平衡20min后并提前将所需的溶液进行配置备用，标准品按照实验操作进行稀释。将待测样品和标准品逐步进行加样、洗涤、封闭、加酶标抗体、显色等，终止反应后30min内在酶标仪上进行测定OD值,根据试剂盒说明绘制标曲并计算含量。

4.肾组织中GSH、T-SOD和MDA含量的测定

将小鼠右肾在冰生理盐水中反复冲洗，按肾组织重量(g)：生理盐水体积(mL)＝1∶9的比例制成10％匀浆液，3000转/分钟，离心10分钟，取上清液按照各测试盒操作方法测定肾组织中T-SOD、MDA和GSH含量。

5.肾组织病理形态学检查

将肾脏固定在10％中性福尔马林溶液中，用低浓度到高浓度的酒精逐渐脱水，包埋于石蜡中。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，厚度4-5μm。按照标准的用苏木精-伊红(HE)和Masson试剂盒说明方法进行染色然后滴加中性树胶封片，200×显微镜下观察、拍照。

6.Hoechst33258染色

按照上述步骤5的方法处理蜡块，将石蜡包埋的切片进行常规脱蜡，水化，将切片表面的水分拭干，滴加少量Hoechst33258染色液覆盖样品，荧光显微镜下观察染色的细胞核并拍照。

7.TUNEL法检测细胞凋亡

取肾组织石蜡切片，切片在65℃干燥1min后进行常规脱蜡水化，轻轻将切片表面的蒸馏水拭干，37℃下蛋白酶K进行消化30min，PBS洗涤3次，每次5min，细胞通透后加Tunel反应液并按试剂盒说明进行操作。待PBS洗涤后，再参照DAPI试剂盒进行染色，荧光显微镜下观察。

8.免疫组化分析

将肾组织石蜡块切成4-5μm厚的切片，进行常规的的脱蜡水化后进行抗原修复，洗涤后封闭然后滴加NLRP3(1：200)，ASC(1：200)，Caspase-1(1：100)，IL-1β(1：200)，Bax(1：200)和Bcl-2(1：200)抗体，4℃下孵育过夜，复温10min，PBS洗涤三次，然后用二抗孵育30min。将切片用DAB染色并用苏木精染核，流水返蓝10min，常规脱水后进行中性树胶封片，显微镜下观察，拍照。

9.肾组织蛋白的提取及WesternBolt检测

称取适量的肾组织放入提前准备好的组织裂解液(RIPA/PMSF＝100:1)中，匀浆机进行匀浆提取肾组织总蛋白(整个实验操作在冰山进行)，冰浴裂解30min，4℃，12000g离心5min，小心吸取上清至干净的EP管中，再加入5×上样缓冲液(裂解液：缓冲液＝4:1)，混匀后蛋白煮沸5min使其变性。在12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离蛋白质。将蛋白质转移到PVDF膜上。室温下，将转好的PVDF膜与5％的脱脂奶粉一起孵育来来阻断非特异性结合。用TBST洗涤三次并与p-IκBα(1:2000)、IκBα(1:1500)、p-NF-κBp65(1:1000)、NF-κBp65(1:1000)、NLRP3(1:500)、ASC(1:1000)、Caspase-1(1:1000)、GSDMD(1:1000)、L-1β(1:1000)、cl-caspase-3(1:1000)、Bax(1：1000)和Bcl-2(1：500)和GAPDH(1:1000)等一抗一起室温孵育2h。用TBST洗涤四次后，将膜与山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1:1000)室温下孵育1h。TBST洗膜后，用BeyoECLPlusA液和B液按1：1混匀进行显色，ImageJ分析软件定量和分析蛋白质条带的密度。

10.肾组织中RNA的提取

称取50mg上述步骤1中处理的新鲜小鼠肾组织于1.5mLEP管中，加入1mL预冷Trizol裂解液，用提前置于冰上的匀浆机进行匀浆，得到的匀浆液置冰浴上裂解15min。加入200μL的氯仿，剧烈震荡成乳浊液后，4℃静置5min，12000g4℃离心15min。取出后小心吸取上层水相至一新的EP管中，加入等体积预冷的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置10min，12000g4℃离心10min。小心弃去上清，并加入1ml预冷的75％乙醇，充分洗涤管盖和管壁，轻弹管底，让沉淀悬浮起来，静置5min。之后12000g4℃离心5min，弃去上清，敞口干燥3min，加入40μLDEPC水溶解沉淀，取1μLRNA至检测器上检测260nm、280nmOD值，并计算OD₂₆₀/OD₂₈₀，其余在-80℃储存(整个RNA提取的过程均在无酶条件下进行)。将上述中提取的RNA参照试剂盒说明书进行逆转录和扩增，得到的cDNA存储于-80℃冰箱用于后续的检测。

11.实验结果

1)鞣花酸对AAI诱导的肾损伤小鼠肾功能的影响

肾指数是反应肾脏受损的一个基本指标，BUN、Cr和尿蛋白是临床上常用的肾功能相关指标。如图8所示，与对照组相比，小鼠在腹腔注射AAI后，肾脏指数、尿蛋白以及血清中BUN和Cr水平显著升高，说明AAI能够诱导小鼠肾脏肿大和引起小鼠肾功能异常。与AAI组相比，预处理EA后，小鼠肾脏指数明显降低，尿蛋白以及血清中BUN和Cr水平呈剂量依赖性下降。以上结果说明EA能够有效地缓解AAI诱导的肾损伤小鼠的肾脏肿大和肾肝功能异常。

2)鞣花酸对AAI诱导的肾损伤小鼠肾组织病理学的影响

为了更直观地观察AAI诱导的小鼠肾脏损伤的情况，将小鼠的肾组织进行H&E和Masson染色。染色结果显示(图9)：对照组小鼠肾脏无炎性细胞浸润、肾小管上皮水肿，间质血管无充血、扩张，未见组织纤维化等病理变化；而AAI组小鼠肾脏有明显的肾小管扩张、间质充血水肿、部分肾小管上皮细胞变性坏死，炎性细胞渗出以及轻度纤维化。经不同浓度10和30mg/kg的EA预处理后，肾小管损伤程度显著减轻，间质充血、炎细胞浸润和肾小管上皮细胞变性坏死以及纤维化等病理变化显著改善。说明鞣花酸能够剂量依赖性地缓解AAI诱导的肾脏病理学变化。

3)鞣花酸对AAI诱导的肾损伤小鼠炎症因子的影响

大量的研究表明，炎症因子与AAI诱导的肾损伤密切相关。为了研究EA是否能保护肾细胞免受AAI诱导的肾炎症反应的影响，申请人检测了炎症相关因子的表达。如图10所示，与对照组相比，AAI组小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平显著上升，而EA预处理组的小鼠血清中TNF-α和IL-1β水平较AAI组有着明显的降低。此外，申请人检测了肾组织中TNF-α和IL-1β的转录水平。AAI组的TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平较对照组显著升高，相反，EA可以剂量依赖性地降低肾组织中TNF-α和IL-1β的转录水平。上述实验结果表明鞣花酸对AAI引起小鼠急性肾损伤的保护作用与抑制肾组织中炎症反应有关。

4)鞣花酸对AAI诱导的肾损伤小鼠细胞凋亡的影响

如前所述，凋亡机制与AAI诱导的肾损伤有关。为了确定EA预处理是否能减少AAI诱导的肾小管细胞凋亡，申请人对肾组织进行了Hoechst33258和TUNEL荧光染色，同时也检测了凋亡相关标记物cl-caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。Hoechst33258荧光染色是一种经典的细胞凋亡检测方法。根据染色结果申请人发现对照组的肾细胞核呈正常的蓝色，无蓝色荧光细胞核，说明对照组无细胞凋亡。与对照组比较，AAI组中的肾细胞呈碎块状致密浓染，大量的蓝色荧光，表明细胞凋亡。而EA预处理组中蓝色荧光逐渐减少，细胞形态逐渐正常(如图11)。另外TUNEL荧光染色结果进一步证实了Hoechst33258染色结果。对照组几乎无有阳性表达，AAI组阳性表达较对照组显著增多，在EA预处理后可以显著降低阳性表达。

促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2是细胞凋亡中重要的因子。从western的结果申请人发现：与对照组相比，AAI处理后cl-caspase-3和Bax蛋白表达显著增加，而Bcl-2蛋白表达显著降低(如图12)。EA预处理对这些变化有很大的抑制作用。细胞凋亡的阳性表达-免疫组化检测相关蛋白Bax和Bcl-2与Westernblot分析结果一致。以上这些结果表明：EA可以阻止AAI诱导的肾组织细胞凋亡。

5)鞣花酸对AAI诱导的NF-κB/NLRP3信号通路的影响

为了进一步确定EA对AAI诱导的肾脏炎症反应的抗炎分子机制，申请人采用Western-blot和免疫组化分析了NF-κB/IκBα信号通路和NLRP3炎症小体的表达。如图13所示：AAI给药后，NF-κBp65和IκBα蛋白的磷酸化水平显著升高，NLRP3炎性小体组分(NLRP3、ASC和caspase-1)和其下游GSDMD、IL-1β的蛋白水平也显著升高，同时NLRP3炎性小体和IL-1β的mRNA表达水平也有所升高。与AAI组相比，EA预处理对NF-κB/NLRP3信号通路相关蛋白的高表达有不同程度的抑制作用。另外，NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的免疫组化结果与Western-blot的结果一致。这些结果表明，EA对AAI诱导的肾脏炎症的保护作用与抑制NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路的激活有关。