Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用
阅读说明：本技术 Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用 (Application of Tempol in preparation of medicine for treating polycystic ovarian syndrome ) 是由 李天鹤 阴赪宏 刘瑞霞 张婷婷 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用,通过动物实验首次发现Tempol可以降低哺乳动物雄激素水平、恢复哺乳动物排卵功能、改善卵巢多囊性改变、缓解肠道菌群的变化和缓解血清代谢物的差异性改变,进而能够明显改善PCOS,且具有疗效显著的优点,本发明的提出为PCOS的治疗提供了一种新的技术手段,对临床上PCOS的治疗和/或辅助治疗具有十分重要的意义,应用前景广阔。(The invention discloses an application of Tempol in preparation of a medicine for treating polycystic ovarian syndrome, and animal experiments show that Tempol can reduce the androgen level of mammals, recover the ovulation function of the mammals, improve the change of polycystic ovary, relieve the change of intestinal flora and relieve the difference change of serum metabolites for the first time, so that PCOS can be obviously improved, and the invention has the advantage of obvious curative effect.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。
背景技术
多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome，PCOS)是一种病因复杂、临床表现多样的内分泌紊乱及代谢异常性疾病，以慢性无排卵(排卵功能紊乱或丧失)和高雄激素血症(妇女体内男性激素产生过剩)为特征，主要临床表现为月经周期不规律、不孕、多毛和/或痤疮，被广泛认为是排卵功能障碍、雄激素水平过剩和卵巢多囊改变的综合，排除了可能导致类似表型的特定疾病，还常出现抑郁、缺乏自信等情绪障碍。其病因及具体发病机制尚未阐明，研究认为，其可能与某些遗传变异、环境因素、代谢异常等有关。目前，全球约有4％至8％的女性罹患多囊卵巢综合征，它通常会造成无排卵型的生育能力低下。
目前，由于多囊卵巢综合征的主要原因尚不清楚，因此以对症治疗为主，主要包括：(1)针对多囊卵巢综合征患者持续不排卵或稀发排卵导致的闭经或月经失调，临床处理以长期口服避孕药为主，常用药物为达英-35；(2)针对部分高雄激素体征突出，如多毛、痤疮等，以降低血雄激素水平为主，常用的药物包括短效口服避孕药、螺内酯等；(3)针对胰岛素抵抗，以胰岛素增敏剂为主，主要药物包括二甲双胍和噻唑烷二酮类等(匹格列酮和罗格列酮)；(4)针对部分有生育要求的患者，临床多采用促排卵治疗，常用药物包括克罗米芬(CC)、促性腺激素、二甲双胍和噻唑等。
针对防治多囊卵巢综合征的药物品种繁多，但是也存在各种问题，其中，最为突出的问题是这些药物会给患者身体带来各种毒副作用，且很多药物的毒副作用大，往往具有剂量依赖性，即服用剂量越大毒副作用越严重，对身体的危害也就越大，停药后多囊卵巢综合征的症状又会出现。因此，本领域目前迫切需要开发毒副作用小、可有效治疗多囊卵巢综合征的新产品，以改善多囊卵巢综合征患者的病情和提高患者的生活质量。Tempol(4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1氧自由基)是一种氮杂环己烷硝基氧，具有稳定性强，细胞膜通透性高和无毒性的特点，目前，关于Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用，尚未报道。
发明内容
针对目前治疗多囊卵巢综合征存在的技术问题，本发明的目的在于提供Tempol在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用，本发明首次将Tempol用于多囊卵巢综合征的治疗中，结果显示Tempol能够明显改善PCOS，且具有疗效显著的优点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了Tempol和/或其调控的肠道菌群在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用；
优选地，所述肠道菌群包括Ideonella、Ruminococcus_2。
进一步，所述Tempol的使用剂量为30mg/kg；
优选地，所述Tempol的连续使用周期为12天。
在本发明中，所述Tempol包括Tempol和/或其药学上可接受的盐。
在本发明的实施例中，所述肠道菌群Ideonella、Ruminococcus_2的丰度在PCOS模型大鼠中显著增加。
进一步，所述药物包括Tempol和/或降低Ideonella、Ruminococcus_2丰度的试剂。
进一步，所述药物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
进一步，所述药物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
本发明的第二方面提供了一种药物组合物。
进一步，所述药物组合物包括Tempol；
优选地，所述药物组合物中Tempol的使用剂量为30mg/kg；
优选地，所述Tempol的连续使用周期为12天。
进一步，所述药物组合物还包括降低Ideonella、Ruminococcus_2丰度的试剂。
进一步，所述药物组合物还可包括药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
进一步，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
本发明的第三方面提供了一种体外非治疗性地降低哺乳动物雄激素水平、恢复哺乳动物排卵功能、改善卵巢多囊性改变、缓解肠道菌群的变化或缓解血清代谢物的差异性改变的方法。
进一步，所述方法包括给哺乳动物施用Tempol；
优选地，所述Tempol的使用剂量为30mg/kg；
优选地，所述Tempol的连续使用周期为12天。
进一步，所述雄激素包括睾酮、雄烯二酮、双氢睾酮、或其组合。
优选地，所述雄激素为睾酮。
进一步，所述降低哺乳动物雄激素水平是指降低哺乳动物血清或血液中的雄激素水平；
优选地，所述降低哺乳动物雄激素水平是指降低哺乳动物血清中的雄激素水平。
进一步，所述卵巢多囊性改变的指标包括卵巢组织中的黄体数目、囊性卵泡数目。
进一步，所述排卵功能的指标包括动情周期。
进一步，所述雄激素的检测方法包括(但不限于)：放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫荧光法(FIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、时间分辨荧光分析法(TRFIA)。
放射免疫法(RIA)是指利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法，无须采用生物测定方法的情况下，用于检测抗原(例如血清中的激素的水平)的实验室测定方法，又称竞争性饱和分析法。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)是指将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术，该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。
免疫荧光法(FIA)是标记免疫技术中发展最早的一种，用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。所述方法的非特异性染色的问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。
化学发光免疫分析法(CLIA)是指用化学发光剂直接标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行定量或定性检测。
时间分辨荧光分析法(TRFIA)是以具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪剂，建立的一种新型的非放射性微量分析技术，采用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析的灵敏度。
在本发明的实施例中，所述雄激素的检测方法优选为放射免疫法。
进一步，排卵功能的检测方法包括(但不限于)：动情周期观察、排卵观察、雌激素水平的测定。
在本发明的实施例中，所述排卵功能的检测方法优选为动情周期观察。
进一步，所述哺乳动物包括雌性哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物包括患有多囊卵巢综合征的哺乳动物；
优选地，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物；
更优选地，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。
本发明的第四方面提供了一种筛选预防或治疗多囊卵巢综合征的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提供待测化合物以及阳性对照化合物，所述的阳性对照化合物为Tempol；
(2)在测试组中，检测步骤(1)中所述待测化合物对非人动物模型的雄激素水平、卵巢多囊性改变和/或排卵功能的影响，并与阳性对照组以及阴性对照组中相应的实验结果进行比较；
其中，如果所述待测化合物对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度显著高于阴性对照组，则提示所述待测化合物是治疗多囊卵巢综合征的候选药物。
进一步，在步骤(2)中，将测试组与阳性对照组的实验结果进行比较，比较测试组中待测化合物对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度(A1)和阳性对照组中Tempol对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度(A2)，若A1/A2≥80％，则提示所述待测化合物是治疗多囊卵巢综合征的候选药物。
进一步，所述的方法还包括：对步骤(2)筛选出的待测化合物，进一步测定其对多囊卵巢综合征的治疗效果。
进一步，所述进一步治疗效果的测定包括对三组实验动物粪便的肠道菌群的组成进行检测。
进一步，所述进一步治疗效果的测定还包括采用非靶向代谢组学方法对三组实验动物的血清代谢物进行检测。
进一步，所述对三组实验动物粪便的肠道菌群的组成进行检测的分析方法采用的是线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)方法。
进一步，所述采用非靶向代谢组学方法对三组实验动物的血清代谢物进行检测的分析方法采用的是主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。
进一步，对步骤(2)筛选出的待测化合物的治疗效果进行评价，有显著的治疗效果：A1/A0≥2，有较佳的治疗效果：A1/A0≥3，有更佳的治疗效果A1/A0≥4，其中，A1为所述待测化合物(测试组)对非人动物模型的雄激素水平的降低程度、卵巢多囊性改变的改善程度和/或排卵功能的恢复程度，A0为阴性对照组(模型组)中的相应的实验结果。
本发明的第五方面提供了Tempol在筛选治疗多囊卵巢综合征药物中的应用，其特征在于，所述应用包括本发明第四方面所述的筛选方法。
本发明的优点和有益效果如下：
(1)本发明通过动物实验首次发现Tempol可以恢复PCOS模型大鼠的排卵功能，调节其卵巢组织中的功能细胞及其血清激素恢复至正常水平，并缓解肠道菌群丰度和血清代谢物的改变，证明了Tempol对DHEA诱导的PCOS模型大鼠具有保护作用。
(2)本发明的提出为PCOS的治疗提供了一种新的技术手段，Tempol能够明显改善PCOS，且具有疗效显著的优点，对临床上PCOS的治疗和/或辅助治疗具有十分重要的意义，应用前景广阔。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是连续10天观察大鼠动情周期的结果图，其中，A图：Oil+PBS组，B图：DHEA+PBS组，C图：DHEA+Tempol组；
图2是大鼠卵巢组织HE染色的结果图，其中，A图：Oil+PBS组，B图：DHEA+PBS组，C图：DHEA+Tempol组，#卵巢黄体，*囊性卵泡；
图3是大鼠卵巢组织中黄体数目、囊性卵泡数目和血清中睾酮水平的统计图，其中，A图：黄体数目，B图：囊性卵泡数目，C图：血清中睾酮水平，*与Oil+PBS组比较，P<0.05，#与DHEA+PBS组比较，P<0.05；
图4是对Oil+PBS、DHEA+PBS和DHEA+Tempol组的生物标志物水平进行了统计分析的结果图，其中，A图：直方图，B图：分支图；
图5是门水平上的相对丰度的结果图，其中，A图：门水平丰度图；B图：柱状图，*与Oil+PBS组比较，P<0.05，#与DHEA+PBS组比较，P<0.05；
图6是属水平上的相对丰度的结果图，其中，A图：属水平丰度图；B图：柱状图，*与Oil+PBS组比较，P<0.05，#与DHEA+PBS组比较，P<0.05；
图7是采用非靶向代谢组学方法测定三组的血清代谢物的结果图，其中，A图：主成分分析(PCA)模型的散点图，B图：正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)评分散点图；
图8是差异代谢物的层次聚类分析热图，其中，横坐标代表不同的实验组，纵坐标代表差异代谢物，不同的颜色代表对应位置代谢物的相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1动物模型的构建
3周龄SD大鼠，分成三组：对照组(Oil+PBS组)，PCOS模型组(DHEA+PBS组)，Tempol治疗组(DHEA+Tempol组)。每组6-11只大鼠，对照组大鼠模型的构建方法如下：皮下注射芝麻油200μL，连续注射21天后，连续12天腹腔注射PBS；PCOS模型组大鼠模型的构建方法如下：皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)(Solarbio，D8950)6mg/100g，200μL，连续注射21天后，连续12天腹腔注射PBS；Tempol治疗组大鼠模型的构建方法如下：皮下注射脱氢表雄酮(DHEA)6mg/100g，200μL，连续注射21天后，连续12天腹腔注射Tempol(30mg/kg)(SelleckChemicals LLC#S2910,Houston,TX,USA)。造模期间每周称重一次。
造模第33天，将三组实验动物分成2部分，每组留3只大鼠于每日下午同一时间取阴道细胞涂片，连续10天，用瑞氏染色液(LEAGENE，1029A20)染色后观察细胞形态。其余大鼠麻醉后取血液、卵巢组织样本。
实施例2大鼠动情周期的观察、卵巢组织形态学观察及血清激素的测定分析1、大鼠动情周期的观察
大鼠为全年多发情动物，有较稳定的性周期，分为：动情前期(P)、动情期(E)、动情后期(M)和间情期(D)，每期的阴道粘膜均发生典型的变化，可根据阴道细胞涂片的细胞学特征判断处于哪个时期。本实施例将对照组(Oil+PBS组)、PCOS模型组(DHEA+PBS组)、Tempol治疗组(DHEA+Tempol组)三组实验动物中的3只大鼠于每日下午同一时间取阴道细胞涂片，连续10天，用瑞氏染色液(LEAGENE，1029A20)染色后观察细胞形态并分别记录和统计实验结果。
2、卵巢组织HE染色
将新鲜卵巢组织固定于4％多聚甲醛，24h后用于HE染色。将取到的材料在灭菌预冷的PBS中洗净，尽量彻底洗掉血液，以免切片观察时红细胞影响结果，分别用50％和70％酒精脱水1h，样品在70％酒精中置于4℃保存直至石蜡包埋，组织块从70％酒精中取出，在80％、95％、100％酒精中各脱水1h，组织块在100％酒精/二甲苯(1:1)中透明30min；再到二甲苯中透明，具体时间根据组织块大小而定，以组织块完全透明为宜，包埋机可直接接取加温并过滤好的石蜡液体，组织块在二甲苯/石蜡(1:1)、石蜡、石蜡中各透蜡2h。在包埋盒底先铺上一定厚度的石蜡，置于热台，将组织用镊子放入，调整好方向，将包埋盒置于凉台，使底部略微凝固，继续浇上石蜡，放上切片托，凉台冷冻，浇蜡，冷冻，直至整个蜡块成型。置于凉台，待石蜡彻底凝固后，利用切片托将蜡块取出。把切片刀架上，固定紧，然后利用切片托将蜡块在切片机固定器上夹紧。切片时，将厚度调为5μm，蜡片切成后，右手用小镊子摄蜡片，左手用毛笔沿刀锋轻轻把蜡片分开，切面朝下把切片放入42℃水中，展平后用镊子轻轻将连续蜡片分开，再用载玻片捞起，晾干，放入切片盒。37℃烤片过夜，脱蜡后进行HE染色，并记录实验结果。
3、血清激素的测定分析
将对照组(Oil+PBS组)、PCOS模型组(DHEA+PBS组)、Tempol治疗组(DHEA+Tempol组)三组实验动物麻醉后取血液样本，采用放射免疫法(XH6080)测定各组大鼠血液中的血清睾酮的水平，并记录和统计实验结果。
4、实验结果
大鼠动情周期的结果图显示Oil+PBS组大鼠具有规律性动情周期(见图1A)；DHEA+PBS组PCOS模型大鼠动情周期失去规律的周期性改变，动情后期/间情期(M/D)大约6-7天(见图1B)；相对于DHEA+PBS组PCOS模型大鼠，DHEA+Tempol组PCOS模型大鼠在一定程度上恢复了相对规律的动情周期(见图1C)。表明经Tempol处理的PCOS模型大鼠可以一定程度上恢复大鼠排卵功能，恢复DHEA诱导的大鼠排卵功能障碍。
卵巢组织HE染色结果显示，DHEA+PBS组PCOS模型大鼠卵巢组织中黄体数目减少，囊性卵泡数目增多，Tempol处理后PCOS模型大鼠卵巢组织中黄体数目增多，囊性卵泡数目降低(见图2A-C和图3A、B)。与Oil+PBS组大鼠相比，DHEA+PBS组PCOS模型大鼠血清中睾酮水平显著上调，Tempol处理后PCOS模型大鼠睾酮水平显著下调，并恢复到正常水平(见图3C)。表明Tempol对DHEA诱导的PCOS大鼠具有保护作用。
实施例3生物标志物水平上统计分析
1、16S rRNA基因测序
使用DNA分离试剂盒(MO BIO Laboratories，Carlsbad，CA，USA)从粪便中提取细菌总DNA。以260nm/280nm和260nm/230nm的比值评价DNA的质量和数量。然后将DNA保存在-80℃，直到进一步处理。细菌16S rRNA基因的V3-V4区用普通引物(SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2)结合适配器序列和条形码序列进行扩增。热循环条件为：在95℃下初始变性5min，然后在95℃下15次变性1min，50℃1min和72℃1min，最后在72℃下延伸7min。第一步PCR产物通过VAHTSTM DNA清洁珠纯化。第二轮PCR在40μL的反应中进行，反应物包括20μL 2×Phμsion HF-MM、8μL ddH2O、10μM每个引物和10μL第一步的PCR产物。热循环条件为：在98℃下初始变性30s，然后在98℃下10s，65℃下30s，72℃下30s，最后在72℃下延伸5min，最后用Quant-iTTM-dsDNA-HS试剂对所有PCR产物进行定量并汇集在一起。使用Illumina Hiseq2500平台对纯化的混合样本进行细菌rRNA基因的高通量测序分析。
所述引物的序列为：
正向引物：5'-ACTCCTAGGAGCAGCA-3'；
反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'；
其中，H＝A/C/T，V＝A/C/G，W＝A/T。
采用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)方法，对Oil+PBS、DHEA+PBS和DHEA+Tempol组的生物标志物水平进行统计分析。绿色组(dha+dha)和pba+LDA组(pba+LDA)均以pba+dha组富集。只有满足四个LDA显著阈值的分类群才会显示出来，直方图的长度代表了不同物种的影响。Cladogram可视化LEfSe算法的输出。显著不同的分类学节点被着色，分支区域根据分类单元的影响大小被阴影化。前十位细菌中，回肠细菌丰度最高的是门和属。在门和属水平上丰度的显著变化。(蓝色)Oil+PBS组富集的分类群；(橙色)DHEA+PBS组富集的分类群；(绿色)DHEA+PBS组富集的分类群；(黄色)组间分类群的相应节点。N＝每组5-6只大鼠，数值以平均值±SEM表示。
2、实验结果
为了明确DHEA和Tempol对大鼠表型的影响，采用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)方法进行分析。结果显示Desulfovibrionaceae属在Oil+PBS组富集，而Muribaculaceae和Alloprevotella属分别在DHEA+PBS组和DHEA+Tempol组中的丰度增加(见图4A和B)，表明Tempol可以重塑PCOS大鼠肠道微生物群的微生物结构。
通过在门和属水平上分析细菌分类的相似程度，进一步比较了三组肠道菌群的总体组成。在门水平上，Firmicutes和Bacteroidetes门是三个类群中的优势群菌(见图5A)。DHEA处理增加了Actinobacteria，Bacteroidetes，Patescibacteria，Tenericutes和Verrucomicrobia的丰度，并减少了Epsilonbacteraeota和Proteobacteria的丰度。此外，tempol干预可以改变DHEA引起的Actinobacteria,Patescibacteria，Proteobacteria和Tenericutes的变化(见图5B)。在属水平上，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Mutibaculaceae为优势属(见图6A)。DHEA显著增加了Thauera，Staphylococcus，Ideonella，Corynebacterium和Ruminococcus_2的丰度，降低了Ruminococcus_1的丰度。Temopol处理可以缓解这些改变(见图6B)。
实施例4血清代谢物水平上统计分析
1、血清代谢组学分析
大鼠麻醉处死后，取血并分离血清用于代谢组的检测。采用非靶向代谢组学方法测定三组大鼠的血清代谢物。
LC-MS/MS分析：使用ExionLC Infinity系列UHPLC系统(AB Sciex,Boston,MA,USA)进行UHPLC分离，该系统配备UPLC BEH酰胺柱(2.1*100mm，1.7μm，水)，流动相为25mmol/L醋酸铵和25mmol/L氢氧化氨水(pH＝9.75)(A)和乙腈(B)。洗脱梯度为：0～0.5min，95％B；0.5～7.0min，95％～65％B；7.0～8.0min，65％～40％B；8.0～9.0min，40％B；9.0～9.1min，40％～95％B；9.1～12.0min，95％B，柱温25℃。自动进样温度为4℃，进样体积分别为2μL(pos)和2μL(neg)。在LC/MS实验中，使用三重式5600质谱仪(AB-Sciex，美国)在信息依赖的基础上获得MS/MS光谱。在这种模式下，采集软件(Analyst TF 1.7，ABSciex)在收集和触发MS/MS光谱采集时，根据预先选择的标准持续评估全扫描测量MS数据。在每一个循环中，在30ev的碰撞能量(CE)下，选择强度＞100的12个前体离子进行MS/MS分析。循环时间为0.56s，设定ESI源条件为：气体1为60psi，气体2为60psi，幕气为35psi，源温度为600℃，去团电位为60v，离子喷涂电压浮动(ISVF)为5000v或-4000v。
数据预处理和注释：利用proteomwizard将MS原始数据(.wiff)文件转换为mzXML格式，并用R包XCMS(3.2版)进行处理。该过程包括峰值反褶积、对准和积分。Minfrac和cut-off分别设置为0.5和0.3。内部MS2数据库用于代谢物鉴定。
正离子模式的原始数据包含3个质控(quality control，QC)样本和13个实验样本，从中提取1848个Peak，对单个Peak进行过滤以去除噪音，只保留单组空值不多于50％或所有组中空值不多于50％的峰面积数据。对数据进行标准化处理。利用每个样本的总离子流进行归一化。
采用主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析法(PLS-DA)从整体上对样本进行直观、可靠和有统计学意义的分析。在得分图中每个点代表一个对应的样本，载荷图中离散点代表得分图分离的变量，离散度越高，对得分图贡献越大。通过t检验对每个变量进行计算求出P值，0.01＜P＜0.05则认为有显著差异，P＜0.01则认为有极显著差异。由此可得到组间有差异性的物质质荷比，由获得的精确质量数得到匹配的分子式，通过数据库搜索得到匹配的信息。
2、实验结果
对三组的血清代谢物进行测定，主成分分析(PCA)显示，三组之间的主要代谢成分存在显著差异(见图7A)，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)评分图也显示出三组代谢物之间明显不同(见图7B)。此外，还鉴定出52种血清代谢物(包括26种脂类和类脂分子)，这些代谢物的丰度在对照组和PCOS大鼠之间存在差异。这些差异大多被Tempol缓解(见图8)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。