发明详述

在更详细地描述本公开之前，应理解，本公开不限于所描述的特定实施方式，因此当然可能会有变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，而非旨在限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物或专利均被明确和单独指示为通过引用并入一般，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，不应解释为承认本公开无权凭借在先公开而早于此类出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，所述实际出版日期可能需要独立确认。

如本领域技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和说明的个别实施方式中的每一个具有离散的组件和特征，其可以在不脱离本公开的范围或精神的情况下，容易地与其他若干实施方式中的任何一个的特征分离或组合。任何叙述的方法可以按照叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序进行。

定义

提供以下定义以帮助读者。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学或医学术语旨在具有化学和医学领域技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为了清楚和/或便于参考，本文定义了具有普遍理解含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为代表与本领域通常理解的术语定义存在实质性差异。

如本文所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代。

术语“量”或“水平”是指存在于样本中的感兴趣的多核苷酸或感兴趣的多肽的数量。这种数量可以用绝对项表示，即样本中多核苷酸或多肽的总量，或者用相对项表示，即样本中多核苷酸或多肽的浓度。

如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，包括但不限于通过医务人员施用和自我施用。

如本文所用，“抗体”涵盖天然存在的免疫球蛋白以及非天然存在的免疫球蛋白，包括例如单链抗体、嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)和异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。抗体的片段包括那些结合抗原的片段(例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv和rIgG)。还参见例如Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce Chemical Co.,Rockford,Ill.)；Kuby,J.,Immunology,第3版,W.H.Freeman&Co.,New York(1998)。术语抗体还包括二价或双特异性分子、双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体。术语“抗体”进一步包括多克隆抗体和单克隆抗体。

如本文所用，术语“癌症”是指涉及细胞异常生长的任何疾病，并且包括影响体内任何组织、器官或细胞的所有阶段和所有形式的疾病。该术语包括所有已知的癌症和赘生性病况，无论其特征是恶性、良性、软组织还是实体，以及所有阶段和等级的癌症，包括转移前和转移后的癌症。一般来说，癌症可以根据癌症所在或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态来进行分类。如本文所用，癌症类型包括急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、儿童小脑或大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑癌、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结肠癌、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤文家族肿瘤(Ewing family of tumors)、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、胃(gastric/stomach)癌、神经胶质瘤、头颈癌、心脏癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、阴道癌、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤。

术语“癌症样本”包括含有一个或多个癌细胞的生物样本或生物来源的样本。生物样本包括来自体液的样本，例如血液、血浆、血清或尿液，或例如通过活检从细胞、组织或器官，优选怀疑包括癌细胞或基本上由癌细胞组成的肿瘤组织中获得的样本。

如本文所用，“细胞”可以是原核细胞或真核细胞。原核细胞包括例如细菌。真核细胞包括例如真菌、植物细胞和动物细胞。动物细胞(例如哺乳动物细胞或人类细胞)的类型包括例如来自循环/免疫系统或器官的细胞，例如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、粒细胞(例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和多分叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞或巨噬细胞、红细胞(例如网织红细胞)、肥大细胞、血小板或巨核细胞和树突状细胞；来自内分泌系统或器官的细胞，例如甲状腺细胞(例如甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺细胞(例如甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺细胞(例如嗜铬细胞)和松果体细胞(例如松果腺细胞)；来自神经系统或器官的细胞，例如成胶质细胞(例如星形胶质细胞和少突胶质细胞)、小胶质细胞、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、卜歇细胞(boettcher cell)和垂体细胞(例如促性腺激素细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促生长激素细胞和催乳素细胞)；来自呼吸系统或器官的细胞，例如肺细胞(I型肺细胞和II型肺细胞)、克拉拉细胞(clara cell)、杯状细胞、肺泡巨噬细胞；来自循环系统或器官的细胞，例如心肌细胞和周细胞；来自消化系统或器官的细胞，例如胃主细胞、壁细胞、杯状细胞、潘氏细胞(paneth cell)、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞、肠内分泌细胞、肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝细胞(例如肝细胞和库普弗细胞)；来自皮肤系统或器官的细胞，例如骨细胞(例如成骨细胞、骨细胞和破骨细胞)、牙齿细胞(例如成牙骨质细胞和成釉质细胞)、软骨细胞(例如成软骨细胞和软骨细胞)、皮肤/毛发细胞(例如毛细胞、角质形成细胞和黑色素细胞(痣细胞)、肌肉细胞(例如肌细胞)、脂肪细胞、成纤维细胞和肌腱细胞)；来自泌尿系统或器官的细胞(例如足细胞、近肾小球细胞、肾小球内系膜细胞、肾小球外系膜细胞、肾近端肾小管刷缘细胞和黄斑部黏膜细胞)；以及来自生殖系统或器官的细胞(例如精子、支持细胞、间质细胞、卵子、卵母细胞)。细胞可以是正常的健康细胞；或患病或不健康的细胞(例如癌细胞)。

术语“互补性”是指一个核酸与另一个核酸序列通过传统的沃森-克里克(Watson-Crick)或其他非传统类型形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中能与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的残基百分比(如10个中的5、6、7、8、9、10个是50％、60％>、70％>、80％>、90％和100％互补)。

注意，在本公开中，如“包含(comprises/comprised/comprising)”、“含有(contains/containing)”等的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包容性的或开放式的，并且不排除额外的、未引用的要素或方法步骤。如“基本上由……组成(consistingessentially of/consists essentially of)”的术语具有美国专利法赋予的含义；它们允许包括不会实质上影响本申请要求保护发明的基本和新颖特征的其他成分或步骤。术语“由……组成(consists of/consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。

术语“确定”、“评估”、“测定”、“测量”和“检测”可以互换使用，并指定量和半定量测定。在打算进行定量和半定量测定时，可以使用短语“确定”感兴趣的多核苷酸或多肽的水平或“检测”感兴趣的多核苷酸或多肽。

术语“杂交”是指在严格条件下，核酸分子优先与特定的核苷酸序列结合、双联或杂交。术语“严格条件”是指杂交和洗涤条件，在这种条件下，探针将优先与其目标子序列杂交，而与混合群体(例如组织活检的细胞裂解物或DNA制备物)中的其他序列杂交的程度较低或根本不杂交。核酸杂交背景下的严格条件是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。关于核酸杂交的广泛指导见于例如Tijssen Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bio logy-Hybridization with Nucleic Acid Probespart I,Ch.2,“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays,”(1993)Elsevier,N.Y.。一般来说，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为比特定序列在规定的离子强度和pH值下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的目标序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH值下)。非常严格的条件被选择为与特定探针的Tm相等。在DNA或RNA印迹中，具有超过100个互补残基的互补核酸在阵列上或在过滤器上杂交的严格杂交条件的一个实例是42℃，使用标准杂交溶液(参见例如Sambrook and Russell Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3版)第1-3卷(2001)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY)。高度严格的洗涤条件的一个实例是0.15M NaCl，在72℃下持续约15分钟。严格洗涤条件的一个实例是0.2×SSC，在65℃下洗涤15分钟。通常，在进行高严格度洗涤之前，先进行低严格度洗涤以去除背景探针信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格度洗涤的一个实例是l×SSC，在45℃下持续15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格度洗涤的一个实例是4×SSC至6×SSC，在40℃下持续15分钟。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、控制区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线性或环状的。

术语“患者衍生的异种移植物(PDX)”是指将来自患者肿瘤的组织或细胞植入免疫缺陷或人源化小鼠体内的癌症模型。PDX模型被用于创建一个环境，允许癌症的自然生长、其监测以及对原始患者的相应治疗评估。

如本文所用，“引物”是指长度为7-40个核苷酸，优选10-38个核苷酸，优选15-30个核苷酸，或15-25个核苷酸，或17-20个核苷酸的寡核苷酸分子。例如，引物可以是长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的寡核苷酸。引物通常用于通过本领域众所周知的聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列。对于待扩增的DNA模板序列，可以在其5'上游和3'下游序列设计一对引物，即5'引物和3'引物，每个引物可以特异性地与DNA双链模板的一条独立链杂交。5'引物与DNA双链模板的反义链互补；而3'引物则与DNA模板的有义链互补。如本领域已知，双链DNA模板的“有义链”是含有与从DNA模板转录的mRNA序列相同的序列(除了RNA中的“U”对应于DNA中的“T”)并编码蛋白质产物的那条链。有义链的互补序列是“反义链”。在本公开中，所有的SEQ ID NO都是有义链DNA，而与SEQ ID NO互补的序列是反义链DNA。

如在患者对癌症疗法有反应的上下文中使用的术语“反应性”、“临床反应”、“积极临床反应”等可互换使用，并且是指患者对治疗的有利反应，而非不利反应，即不良事件。在患者中，有益反应可以依据许多临床参数来表示，包括可检测肿瘤的消失(完全反应，CR)，肿瘤大小和/或癌细胞数量减少(部分反应，PR)，肿瘤生长停滞(稳定疾病，SD)，抗肿瘤免疫反应增强，可能导致肿瘤的消退或排斥；在一定程度上缓解与肿瘤相关的一个或多个症状；治疗后生存期延长；和/或治疗后给定时间点的死亡率降低。肿瘤大小和/或癌细胞数量和/或肿瘤转移的持续增加表明对治疗缺乏有益反应。在群体中，药物的临床益处，即其功效可以基于一个或多个终点来评估。例如，总体反应率(ORR)分析将那些用药物治疗后出现CR或PR的患者归类为反应者。疾病控制(DC)分析将那些在用药物治疗后出现CR、PR或SD的患者归类为反应者。积极临床反应可以使用任何表明对患者有益的终点来评估，包括但不限于：(1)在一定程度上抑制肿瘤生长，包括减缓和完全生长停滞；(2)肿瘤细胞数量减少；(3)肿瘤大小减小；(4)抑制(即减少、减缓或完全停止)肿瘤细胞向邻近周边器官和/或组织的浸润；(5)抑制转移；(6)增强抗肿瘤免疫反应，可能导致肿瘤的消退或排斥；(7)在一定程度上缓解与肿瘤相关的一个或多个症状；(8)延长治疗后的生存期；和/或(9)降低治疗后给定时间点的死亡率。积极临床反应也可以依据临床结果的各种量度来表示。积极临床结果也可以在个体结果相对于具有可比临床诊断的患者群体的结果的情况下考虑，并且可以使用各种终点来评估，如无复发间隔(RFI)持续时间的增加，与群体中的总生存期(OS)相比，生存时间的增加，无病生存(DFS)时间的增加，无远处复发间隔(DRFI)持续时间的增加，等等。其他终点包括无任何事件(AE)生存的可能性、无转移性复发(MR)生存(MRFS)的可能性、无病生存(DFS)的可能性、无复发生存(RFS)的可能性、首次进展(FP)的可能性和无远处转移生存(DMFS)的可能性。积极临床反应的可能性的增加对应于癌症复发(recurrence/relapse)的可能性的降低。

如本文所用，术语“标准对照”或“参考水平”是指存在于已建立参考物(例如正常组织样本、健康的非癌症组织样本或二倍体、未转化、非癌性、基因组稳定的健康人类细胞系)中的多核苷酸序列或多肽序列的预先确定的量或浓度。标准对照或参考值适用于本发明的方法，以作为比较测试样本中存在的特定mRNA或蛋白质的量的基础。作为标准对照的已建立样本提供了正常组织样本中典型的特定mRNA或蛋白质的平均量。标准对照值可能会根据样本的性质以及其他因素，如建立这种对照值所依据的受试者的性别、年龄、种族而有所不同。

如本文所用，术语“样本”是指从感兴趣的受试者获得的生物样本。样本的实例包括但不限于体液，如血液、血浆、血清、尿液、阴道液、子宫或阴道冲洗液、胸水、腹水、脑脊液、唾液、汗液、泪液、痰液、支气管肺泡灌洗液等；和组织，如活检组织(例如活检的骨组织、骨髓、乳腺组织、胃肠道组织、肺组织、肝组织、前列腺组织、脑组织、神经组织、脑膜组织、肾组织、子宫内膜组织、宫颈组织、淋巴结组织、肌肉组织或皮肤组织)、石蜡包埋组织。在某些实施方式中，样本可以是包含癌细胞的生物样本。在一些实施方式中，样本是例如通过肿瘤活检或细针抽吸从肿瘤获得的新鲜或存档样本。样本也可以是含有癌细胞的任何生物液体。从受试者收集样本是按照医院或诊所普遍遵循的标准方案进行的，例如在活检过程中。

如本文所用，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人类包括产前和产后形式。在许多实施方式中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指向医疗提供者提出进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能患有或易患疾病或病症，但可能会或可能不会表现出疾病或病症的症状。

术语“治疗(treatment/treat/treating)”是指减少癌症(例如乳腺癌、肺癌、卵巢癌等)或癌症症状的影响的方法。因此，在所公开的方法中，治疗可以指10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％)、80％)、90％)或100％减少癌症或癌症症状的严重程度。例如，如果与对照相比，受试者的一种或多种疾病症状减少了10％，那么治疗疾病的方法被认为是一种治疗。因此，与原生或对照水平相比，减少可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％与100％之间的任何百分比减少。应理解，治疗不一定是指疾病、病况、或疾病或病况的症状的治愈或完全消退。

术语“肿瘤样本”包括含有一个或多个肿瘤细胞的生物样本或生物来源的样本。生物样本包括来自体液的样本，例如血液、血浆、血清或尿液，或例如通过活检从细胞、组织或器官，优选怀疑包括癌细胞或基本上由癌细胞组成的肿瘤组织中获得的样本。

蛋白激酶表达水平

本文所述的方法和组合物部分基于发现蛋白激酶在癌症样本中的表达水平表明癌症患者对酪氨酸激酶抑制剂的反应性。

蛋白激酶是一组通过向目标蛋白化学添加磷酸基团(即磷酸化)来修饰其他蛋白的酶。磷酸化通常会通过改变酶活性、细胞位置或与其他蛋白的缔合而导致目标蛋白的功能改变。激酶对蛋白质的磷酸化是在细胞内传递信号(信号转导)和调节细胞活动(如细胞分裂)的重要机制。因此，蛋白激酶在许多细胞功能中充当“开”或“关”开关。蛋白激酶可能会发生突变，卡在“开”的位置，并导致细胞不受调控的生长，这是癌症发展的必要步骤。因此，激酶抑制剂，如伊马替尼(imatinib)，往往是有效的癌症治疗剂。人类基因组含有约500个蛋白激酶基因。大多数蛋白激酶可分为亚类：丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。

丝氨酸/苏氨酸激酶使目标蛋白中的丝氨酸或苏氨酸残基的OH基团磷酸化。丝氨酸/苏氨酸激酶的实例包括MAP激酶、ERK家族、应激激活蛋白激酶JNK和p38。

酪氨酸激酶是蛋白激酶的一个亚类，是一组可以在细胞中将磷酸基团从ATP转移到蛋白质的酶，其中磷酸基团连接到蛋白质上的氨基酸残基酪氨酸。大多数酪氨酸激酶具有相关的蛋白酪氨酸磷酸酶，它可以去除磷酸基团。

在某些实施方式中，激酶选自下组：DDR1、CSF1R、CDKL2、cKit、c-RAF、Flt1、Flt4、KDR、MAP4K5、PDGFRα、PTK5、Ret、SAPK2b和ZAK。在某些实施方式中，激酶含有突变。在一个实施方式中，突变是cKit(V560G)或PDGFRα(V561D)。在一个实施方式中，蛋白激酶是DDR1或CSF1R。

如本文所用，DDR1是指人类基因盘状域受体家族成员1，也称为CD167a(分化簇167a)。DDR1编码一种酪氨酸激酶，其在正常和转化的上皮细胞中广泛表达，并被各种类型的胶原蛋白激活。DDR1蛋白属于酪氨酸激酶受体的一个亚家族，在其胞外域中具有与盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)蛋白discoidin I同源的区域。它的自磷酸化是由迄今为止测试的所有胶原蛋白(I型至VI型)实现的。一个密切相关的家族成员是DDR2蛋白(FuHL等人(2013年3月)The Journal of Biological Chemistry 288(11):7430-7)。原位研究和RNA印迹分析显示，DDR的表达仅限于上皮细胞，特别是在肾脏、肺、胃肠道和脑中。此外，DDR1在乳腺癌、卵巢癌、食道癌和小儿脑瘤等几种人类肿瘤中显著过度表达。DDR1基因位于染色体6p21.3上，与几个HLAI类基因相邻。该基因的选择性剪接产生多个转录变体(“Entrez Gene：DDR1盘状域受体家族成员1”)。在某些实施方式中，DDR1 mRNA具有SEQ IDNO:1的序列并且DDR1蛋白具有SEQ ID NO:2的序列。

如本文所用，CSF1R是指集落刺激因子1受体，也称为巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)和CD115(分化簇115)，它是一种细胞表面蛋白，在人类中由CSF1R基因(也称为c-FMS)编码(EntrezGene 1436；Galland F,Stefanova M,Lafage M,Birnbaum D(1992)CellGenet 60(2):114-6)。CSF1R蛋白具有972个氨基酸，预测的分子量为108kD。CSF1R蛋白是一种I型单次穿膜蛋白，充当集落刺激因子1(一种控制巨噬细胞的产生、分化和功能的细胞因子)的受体。CSF1R介导了CSF1的大部分(如果不是全部)生物效应。CSF1R是一种酪氨酸激酶跨膜受体，并且是酪氨酸蛋白激酶的CSF1/PDGF受体家族的成员(Xu Q等人(2015)ScienceSignaling.8(405):rs13；Meyers MJ等人(2010)Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters.20(5):1543-7)。配体结合通过寡聚化和反式磷酸化的过程激活CSF1R。由于CSF1R在许多癌症和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上过度表达，因此CSF1R抑制剂(和CSF1抑制剂)已作为癌症或炎症性疾病的可能治疗剂被研究多年(Patel S,Player MR(2009)Curr Top MedChem.9(7):599-610；Cannarile MA等人(2017)Journal for Immunotherapy of Cancer.5(1):53)。在某些实施方式中，CSF1R mRNA具有SEQ ID NO:3的序列并且CSF1R蛋白具有SEQID NO:4的序列。

如本文所用，CDKL2是指细胞周期蛋白依赖性激酶样2，它是一种在人类中由CDKL2基因编码的酶(Taglienti CA,Wysk M,Davis RJ(1997年2月)Oncogene.13(12):2563-74；“Entrez Gene：CDKL2细胞周期蛋白依赖性激酶样2(CDC2相关激酶)”)。CDKL2是CDC2相关丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶大家族的成员。它主要积聚在细胞质中，在细胞核中含量较低(“Entrez Gene：CDKL2细胞周期蛋白依赖性激酶样2(CDC2相关激酶)”)。

如本文所用，cKit是指原癌基因c-KIT，也称为酪氨酸蛋白激酶KIT、CD117(分化簇117)或肥大/干细胞生长因子受体(SCFR)，它是一种受体酪氨酸激酶蛋白，在人类中由KIT基因编码(Andre C等人(1997年1月)Genomics.39(2):216-26)。已发现该基因的编码不同同种型的多个转录变体(“Entrez Gene：KIT v-kit Hardy-Zuckerman 4猫肉瘤病毒致癌基因同源物”；National Cancer Institute Dictionary of Cancer Terms.c-kit.2014年10月13日访问)。KIT最早由德国生物化学家Axel Ullrich在1987年描述为猫肉瘤病毒致癌基因v-kit的细胞同源物(Yarden Y等人(1987年11月)EMBO J.6(11):3341-51)。

cKit是一种细胞因子受体，在造血干细胞以及其他细胞类型的表面上表达。该受体的改变形式可能与某些类型的癌症相关(Edling CE,Hallberg B(2007)Int.J.Biochem.Cell Biol.39(11):1995-8)。cKit是一种受体酪氨酸激酶III型，它与干细胞因子(一种导致某些类型的细胞生长的物质)，也称为“steel因子”或“c-kit配体”结合。当cKit受体与干细胞因子(SCF)结合时，它形成一个二聚体，激活其固有的酪氨酸激酶活性，进而磷酸化并激活在细胞中传播信号的信号转导分子(Blume-Jensen P等人(1991-12-10)EMBO Journal.10(13):4121-4128)。激活后，受体被泛素化，标志着它将被转运至溶酶体并最终被破坏。通过cKit的信号传导在细胞生存、增殖和分化中发挥作用。例如，cKit信号传导是黑色素细胞存活所必需的，它还参与造血和配子发生(Brooks,Samantha(2006),Studies of genetic variability at the KIT locus and white spotting patternsin the horse(Thesis),University of Kentucky Doctoral Dissertations.第13-16页)。cKit基因的激活突变与胃肠道间质瘤、睾丸精原细胞瘤、肥大细胞病、黑色素瘤、急性骨髓性白血病相关，而失活突变则与遗传缺陷斑驳病相关(“Entrez Gene：KIT v-kitHardy-Zuckerman 4猫肉瘤病毒致癌基因同源物”)。

如本文所用，c-RAF是指RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也称为原癌基因c-RAF或简称Raf-1，它是一种酶(Li P等人(1991)Cell.64(3):479-82.)，在人类中由RAF1基因编码(Rapp UR等人(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80(14):4218-22；Bonner T等人(1984)Science 223(4631):71-4)。c-Raf蛋白是ERK1/2通路的一部分，作为MAP激酶(MAP3K)，在膜相关GTP酶的Ras亚家族下游发挥作用(“Entrez Gene：RAF1v-raf-1鼠白血病病毒致癌基因同源物1”)。

如本文所用，Flt1是指血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)，它是一种在人类中由FLT1基因编码的蛋白质(Shibuya M等人(1990年4月)Oncogene 5(4):519-24)。Flt1属于src基因家族并且与致癌基因ROS(MIM 165020)有关。与该家族的其他成员一样，Flt1显示酪氨酸蛋白激酶活性，这对于控制细胞增殖和分化很重要。最近发现，通过化学和遗传手段消减Flt1可以增强小鼠白色脂肪组织向棕色脂肪组织的转化，以及增加棕色脂肪血管生成(Seki T等人(2018)The Journal of Experimental Medicine.215(2):611-626)。已发现FLT1的功能性遗传变异(rs9582036)影响非小细胞肺癌的生存率(Glubb DM等人(2015)Journal of Thoracic Oncology.10(7):1067-75.)。

如本文所用，Flt4是指Fms相关酪氨酸激酶4，它是一种在人类中由FLT4基因编码的蛋白质(“Entrez Gene：FLT4fms相关酪氨酸激酶4”；Galland F等人(1992)Genomics 13(2):475-8.)。Flt4基因编码血管内皮生长因子C和D的酪氨酸激酶受体。Flt4蛋白被认为参与淋巴管生成和淋巴管内皮的维持。Flt4基因的突变导致遗传性淋巴水肿IA型(“EntrezGene：FLT4fms相关酪氨酸激酶4”)。

如本文所用，KDR是指激酶插入域受体(KDR，一种IV型受体酪氨酸激酶)，也称为血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)、CD309(分化簇309)和Flk1(胎肝激酶1)。Q472H种系KDR遗传变体影响VEGFR-2磷酸化，并已发现与NSCLC中的微血管密度相关(Glubb DM等人(2011年8月)Clinical Cancer Research.17(16):5257-67)。已显示KDR与SHC2、Annexin A5和SHC1相互作用(Warner AJ等人(2000年4月)The Biochemical Journal 347(Pt2):501-9；Wen Y等人(1999年5月)Biochemical and Biophysical Research Communications.258(3):713-21；Zanetti A等人(2002年4月)Arteriosclerosis,Thrombosis,and VascularBiology 22(4):617-22；D'Angelo G等人(1999年5月)Molecular Endocrinology 13(5):692-704)。

如本文所用，MAP4K是指丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶5，这是一种在人类中由MAP4K5基因编码的酶(Tung RM,Blenis J(1997)Oncogene 14(6):653-9；Schultz SJ,Nigg EA(1994)Cell Growth Differ 4(10):821-30；“Entrez Gene：MAP4K5丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶5”)。MAP4K是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，与酵母SPS1/STE20激酶高度相似。酵母SPS1/STE20在MAP激酶信号级联的接近开始时起作用，这对酵母信息素反应至关重要。已显示MAP4K在哺乳动物细胞中激活Jun激酶，这表明其在应激反应中的作用。已描述该基因的编码相同蛋白质的两个选择性剪接的转录变体(“Entrez Gene：MAP4K5丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶5”)。已显示MAP4K5与CRKL和TRAF2相互作用(Shi,C S；Tuscano J；Kehrl J H(2000)Blood 95(3):776-82；Shi,C S等人(1999)J.Immunol.163(6):3279-85)。

如本文所用，PDGFRα是指血小板衍生生长因子受体α，它是位于多种细胞类型表面的受体。PDGFRα与血小板衍生生长因子(PDGF)的某些同种型结合，从而在刺激引发诸如细胞生长和分化等反应的细胞信号传导通路方面变得活跃。PDGFRα对胚胎发生过程中某些组织和器官的发育以及这些组织和器官，特别是血液组织在整个生命中的维持至关重要。编码PDGFRα的基因(即PDGFRα基因)中的突变与一系列具有临床意义的肿瘤相关。成熟的糖基化PDGFRα蛋白的分子质量为约170kD。

如本文所用，PTK5是指酪氨酸蛋白激酶5，也称为fyn相关激酶(FRK)，其由FRK基因编码(Lee J等人(1994年4月)Gene.138(1-2):247-51；“Entrez Gene：FRK fyn相关激酶”)。该基因所编码的蛋白质属于蛋白激酶的酪氨酸激酶家族。这种酪氨酸激酶是一种核蛋白，可能在细胞周期的G1和S期发挥作用并抑制生长(“Entrez Gene：FRK fyn相关激酶”)。已显示FRK与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用(RJ Craven,WG Cance,ET Liu(1995)Cancer Res55(18):3969-72)。

如本文所用，Ret是指RET原癌基因，其编码神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)胞外信号传导分子家族成员的受体酪氨酸激酶(Knowles PP,Murray-Rust J,KjaerS等人,(2006)J.Biol.Chem.281(44):33577-87)。RET功能突变的丧失与赫希施普龙氏病(Hirschsprung's disease)的发展相关，而功能突变的获得则与多种类型的人类癌症的发展相关，包括甲状腺髓样癌、多发性内分泌肿瘤2A和2B型、嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生。

SAPK2b也称为“MAPK11”，是指丝裂原激活蛋白激酶11，它是一种在人类中由MAPK11基因编码的酶(Goedert M等人(1997年8月)EMBO J.16(12):3563-71；“EntrezGene：MAPK11丝裂原激活蛋白激酶11”)。SAPK2b蛋白是MAP激酶家族的成员。MAP激酶充当多种生化信号的整合点，参与了多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控和发育。SAPK2b与p38MAP激酶最密切相关，两者均可被促炎性细胞因子和环境压力激活。这种激酶通过被MAP激酶激酶(MKK)，优选MKK6磷酸化而激活。已显示转录因子ATF2/CREB2是该激酶的底物。(“Entrez Gene：MAPK11丝裂原激活蛋白激酶11”)已显示MAPK11与HDAC3和早幼粒细胞白血病蛋白相互作用(Mahlknecht U等人(2004)J.Immunol.173(6):3979-90；Shin J等人(2004)J.Biol.Chem.279(39):40994-1003)。

如本文所用，ZAK是指含有不育α基序和亮氨酸拉链的激酶AZK，它是信号转导分子MAPKKK家族的成员。ZAK蛋白具有N端激酶催化域，然后是亮氨酸拉链基序和不育α基序(SAM)。这种镁结合蛋白形成同源二聚体并且位于细胞质中。ZAK蛋白介导γ辐射信号传导，导致细胞周期停滞，并且该蛋白的活性在细胞中的细胞周期检查点调控中发挥作用。ZAK蛋白还具有促凋亡活性。编码不同同种型的替代转录剪接变体已得到表征(“Entrez Gene：ZAK含有不育α基序和亮氨酸拉链的激酶AZK”；Liu等人(2000)Biochemical andBiophysical Research Communications 274(3):811-816.)。已显示ZAK与ZNF33A相互作用(Yang,Jaw-Ji(2003年1月)Biochem.Biophys.Res.Commun.301(1):71-7)。

激酶表达检测试剂

在一个方面，本公开提供了用于检测本文公开的激酶表达的检测试剂。

在某些实施方式中，检测试剂包含可与蛋白激酶基因或蛋白激酶mRNA的多核苷酸杂交的引物或探针。

如本文所用，术语“引物”是指由于引物的至少一部分在目标多核苷酸序列内的序列互补性而可以与目标多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸。引物的长度可以是至少8个核苷酸，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与目标序列正确杂交，引物可以与目标多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互补性。可用作引物的寡核苷酸可以根据Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetts.(1981)22:1859-1862首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪化学合成，如Needham-Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.(1984)12:6159-6168中所述。

引物可用于核酸扩增反应，其中引物被延伸以产生多核苷酸的新链。引物可以由本领域技术人员使用本领域已知的常识容易地设计，使其可以与本文提供的蛋白激酶基因的目标核苷酸序列的核苷酸序列特异性退火。通常，引物的3'核苷酸被设计成与相应核苷酸位置的目标序列互补，以通过聚合酶提供最佳的引物延伸。

如本文所用，术语“探针”是指由于探针的至少一部分在目标多核苷酸序列内的序列互补性而可以与目标多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸或其类似物。示例性探针可以是例如DNA探针、RNA探针或蛋白核酸(PNA)探针。探针的长度可以是至少8个核苷酸，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与目标序列正确杂交，探针可以与目标多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列互补性。探针也可以根据上述固相亚磷酰胺三酯方法化学合成。DNA和RNA探针的制备方法及其与目标核苷酸序列杂交的条件在Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook等人编,第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第10章和第11章中有所描述。

在某些实施方式中，本文提供的引物和探针为可检测标记的。适合标记引物和探针的可检测标记的实例包括例如发色团、放射性同位素、荧光团、化学发光部分、粒子(可见或荧光)、核酸、配体或催化剂如酶。

在某些实施方式中，检测试剂包含与蛋白激酶蛋白特异性结合的抗体。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白或其抗原结合片段，它可以与目标蛋白抗原特异性结合。可以通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体库中选择抗体，以及通过使动物(如兔子或小鼠)免疫制备多克隆和单克隆抗体来鉴定和制备抗体(参见例如Huse等人,Science(1989)246:1275-1281；Ward等人,Nature(1989)341:544-546)。

可以理解的是，在某些实施方式中，抗体被修饰或标记以适当地用于各种检测测定。在某些实施方式中，抗体为可检测标记的。

样本制备

可以从受试者获得适合进行本文提供的方法的任何生物样本。在某些实施方式中，可以通过理想的方法进一步处理样本，以进行蛋白激酶表达的检测。

在某些实施方式中，所述方法还包括从受试者获得的生物液体样本(如外周血样本)或组织样本中分离或提取癌细胞(如循环肿瘤细胞)。癌细胞可以通过免疫磁性分离技术(如可从Immunicon(Huntingdon Valley,Pa.)获得的技术)分离。

在某些实施方式中，可以对组织样本进行处理以进行原位杂交。例如，在固定在玻璃显微镜载玻片上之前，可以对组织样本进行石蜡包埋，然后用溶剂(通常是二甲苯)去石蜡。

在某些实施方式中，所述方法还包括从样本中分离核酸，例如DNA或RNA。各种提取方法适合于从细胞或组织中分离DNA或RNA，如苯酚和氯仿提取，以及例如Ausubel等人,Current Protocols of Molecular Biology(1997)John Wiley&Sons以及Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版.(2001)中所述的各种其他方法。

市售试剂盒也可用于分离DNA和/或RNA，包括例如NucliSens提取试剂盒(Biomerieux,Marcy l'Etoile,France)、QIAamp^TM微型血液试剂盒、Agencourt Genfind^TM、微型柱(Qiagen)、RNA微型试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和Eppendorf Phase Lock Gels^TM。技术人员可以按照制造商的方案容易地提取或分离RNA或DNA。

检测蛋白激酶表达水平的方法

本公开的方法包括在从患有癌症或疑似患有癌症的受试者获得的样本中检测本文所述的蛋白激酶表达水平。蛋白激酶表达水平可以使用本领域已知的适当方法在RNA(如mRNA)水平、蛋白质水平或蛋白质激活水平中检测，所述方法包括但不限于扩增测定、杂交测定、测序测定和免疫测定。

扩增测定

核酸扩增测定涉及复制目标核酸(例如DNA或RNA)，从而增加扩增的核酸序列的拷贝数。扩增可以是指数型或线性的。示例性核酸扩增方法包括但不限于使用以下方式进行的扩增：聚合酶链反应(“PCR”，参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR Protocols:AGuide To Methods And Applications(Innis等人编,1990))、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、定量实时PCR(qRT-PCR)；定量PCR，如巢式PCR、连接酶链反应(参见Abravaya,K.等人,Nucleic Acids Research,23:675-682,(1995)、分支DNA信号扩增(参见Urdea,M.S.等人,AIDS,7(增刊2):S11-S14,(1993)、可扩增RNA报告基因、Q-β复制(参见Lizardi等人,Biotechnology(1988)6:1197)、基于转录的扩增(参见Kwoh等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:1173-1177)、回旋镖式DNA扩增、链置换激活、循环探针技术、自主序列复制(Guatelli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:1874-1878)、滚环式复制(美国专利号5,854,033)、基于核酸序列的等温扩增(NASBA)和基因表达的系列分析(SAGE)。

在某些实施方式中，核酸扩增测定是基于PCR的方法。PCR由一对与待扩增的目标核酸序列杂交的引物启动，然后由聚合酶延伸引物，聚合酶使用目标核酸序列作为模板和dNTP作为构建模块合成新链。然后，使新链和目标链变性以允许引物结合，进行下一个延伸和合成循环。在多次扩增循环后，目标核酸序列的总拷贝数可以呈指数增加。

在某些实施方式中，可以使用当嵌入双链DNA时产生信号的嵌入剂。示例性试剂包括SYBR GREEN^TM和SYBR GOLD^TM。由于这些试剂不是模板特异性的，因此假定信号是基于模板特异性扩增产生的。这可以通过监测随温度而变的信号来确认，因为模板序列的熔点通常远高于例如引物二聚体等。

杂交测定

核酸杂交测定使用探针与目标核酸杂交，从而允许检测目标核酸。杂交测定的非限制性实例包括RNA印迹、DNA印迹、原位杂交、微阵列分析和基于多重杂交的测定。

在某些实施方式中，用于杂交测定的探针为可检测标记的。在某些实施方式中，用于杂交测定的基于核酸的探针为未标记的。这种未标记的探针可以固定在固体支持物如微阵列上，并且可以与可检测标记的目标核酸分子杂交。

在某些实施方式中，杂交测定可以通过剔出核酸(例如RNA或DNA)，分离核酸(例如通过凝胶电泳)，然后将分离的核酸转移到合适的膜过滤器(例如硝酸纤维素过滤器)上来进行，其中探针与目标核酸杂交并允许检测。参见例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual,J.Sambrook等人编,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第7章。探针和目标核酸的杂交可以通过本领域已知的方法检测或测量。例如，杂交的放射自显影检测可以通过将杂交的过滤器暴露于照相胶片来进行。

在一些实施方式中，杂交测定可以在微阵列上进行。微阵列提供了一种同时测量大量目标核酸分子水平的方法。目标核酸可以是RNA、DNA、从mRNA逆转录的cDNA或染色体DNA。可以使目标核酸与微阵列杂交，微阵列包括具有多个固定化核酸探针的基材，探针以每平方厘米基材表面多达几百万个探针的密度排列。样本中的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。确定阵列上每个探针的杂交强度并将其转换为代表RNA或DNA相对水平的定量值。参见美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316。

使用机械合成方法合成这些阵列的技术在例如美国专利号5,384,261中描述。虽然经常采用平面阵列表面，但阵列可以在几乎任何形状的表面或甚至多个表面上制造。阵列可以是珠粒、凝胶、聚合物表面、纤维如光纤、玻璃或任何其他适当的基材上的肽或核酸，参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。可以允许对全包式设备进行诊断或其他操作的方式封装阵列。有用的微阵列也可商购获得，例如来自Affymetrix的微阵列、来自Nano String Technologies的微阵列、来自Panomics的QuantiGene 2.0 Multiplex Assay。

测序方法

可用于测量酪氨酸表达水平的测序方法涉及目标核酸的测序。本领域已知的任何测序都可用于检测感兴趣的蛋白激酶的表达水平。一般来说，测序方法可分为传统或经典方法和高通量测序(下一代测序)。传统的测序方法包括Maxam-Gilbert测序(也称为化学测序)和Sanger测序(也称为链终止法)。

高通量测序或下一代测序，通过使用区别于传统方法(如Sanger测序)的方法，具有高度的可扩展性，能够一次性测序整个基因组或转录组。高通量测序涉及边合成边测序、边连接边测序和超深度测序(如Marguiles等人,Nature 437(7057):376-80(2005)中所述)。边合成边测序涉及通过在聚合酶扩增中掺入标记的核苷酸或核苷酸类似物来合成目标核酸的互补链。在成功掺入标记核苷酸之后或之时，立即测量标记的信号并记录核苷酸的身份。在重复掺入、检测和鉴定步骤之前去除掺入核苷酸上的可检测标记。边合成边测序方法的实例是本领域已知的，并且例如在美国专利号7,056,676、美国专利号8,802,368和美国专利号7,169,560中都有描述，其内容以引用的方式并入本文中。边合成边测序可以使用折返式PCR和锚定引物在固体表面(或微阵列或芯片)上进行。目标核酸片段可以通过与锚定引物杂交附着在固体表面上，并进行桥式扩增。这项技术被用于例如ILLUMINA测序平台。

焦磷酸测序涉及将目标核酸区与引物杂交，并在聚合酶的存在下，通过依次掺入对应于碱基A、C、G和T(U)的脱氧核苷酸三磷酸来延伸新链。每个碱基掺入都伴随着焦磷酸的释放，焦磷酸被硫酸化酶转化为ATP，从而驱动氧化荧光素的合成和可见光的释放。由于焦磷酸的释放与掺入的碱基数量等摩尔，因此发出的光与任何一个步骤中加入的核苷酸数量成正比。重复该过程直到确定整个序列。

在某些实施方式中，本文所述的蛋白激酶表达水平通过全转录组鸟枪法测序(RNA测序)检测。已经描述了RNA测序的方法(参见Wang Z,Gerstein M和Snyder M,NatureReview Genetics(2009)10:57-63；Maher CA等人,Nature(2009)458:97-101；Kukurba K和Montgomery SB,Cold Spring Harbor Protocols(2015)2015(11):951-969)。

免疫测定

本文使用的免疫测定通常涉及使用与蛋白激酶蛋白特异性结合的抗体。此类抗体可以使用本领域已知的方法获得(参见例如Huse等人,Science(1989)246:1275-1281；Ward等人,Nature(1989)341:544-546)，或者可以从商业来源获得。免疫测定的实例包括但不限于蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫沉淀、夹心测定、竞争性测定、免疫荧光染色和成像、免疫组织化学(IHC)和荧光激活细胞分选(FACS)。关于免疫学和免疫测定程序的综述，参见Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr编,第7版.1991)。此外，可以若干配置中的任何一种进行免疫测定，所述配置在Enzyme Immunoassay(Maggio编,1980)；以及Harlow和Lane,同上中充分综述。关于一般免疫测定的综述，另参见Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology,第37卷(Asai编,1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites和Terr编,第7版.1991)。

可以调整或优化本文提供的用于测量激酶表达水平的任何测定和方法以用于自动和半自动系统，或护理点测定系统中。

本文所述的激酶表达水平可以使用本领域已知的适当方法标准化。例如，激酶表达水平可以相对于标准标志物的标准水平标准化，该标准标志物可以预先确定、同时确定或在从受试者获得样本之后确定。标准标志物可以在同一测定中运行，或者可以是先前测定中的已知标准标志物。再例如，蛋白激酶表达水平可以相对于内部对照标准化，该内部对照可以是内部标志物，或多个内部标志物的平均水平或总水平。又例如，在使用高通量测序通过mRNA水平测量蛋白激酶表达时，蛋白激酶表达水平可以相对于测序测定中的总命中标准化。

与参考水平进行比较

在某些实施方式中，本文公开的方法包括将检测到的蛋白激酶表达水平与参考蛋白激酶水平进行比较的步骤。

术语“参考蛋白激酶水平”是指代表参考样本的感兴趣的蛋白激酶的表达水平。在某些实施方式中，参考样本是从健康的受试者或组织获得的。在某些实施方式中，参考样本是癌症或肿瘤组织。在某些实施方式中，参考蛋白激酶水平是使用与检测测试样本中的蛋白激酶表达水平所用相同或相当的测量方法或测定获得的。

在某些实施方式中，参考蛋白激酶水平可以是预先确定的。例如，可以基于来自相同类型肿瘤或血癌的一般癌症或肿瘤样本或组织的集合中的蛋白激酶水平的测量结果来计算或概括参考蛋白激酶水平。再例如，参考蛋白激酶水平可以基于在来自一般癌症或肿瘤群体的平均癌症或肿瘤样本中一般观察到的蛋白激酶水平的统计结果。

在某些实施方式中，本文提供的方法中的比较步骤涉及确定检测到的蛋白激酶表达水平和参考蛋白激酶水平之间的差异。与参考蛋白激酶水平的差异可以是升高或降低。

在某些实施方式中，将与参考蛋白激酶水平的差异进一步与阈值进行比较。在某些实施方式中，阈值可以通过统计方法设置，使得如果与参考蛋白激酶水平的差异达到阈值，这种差异可以被认为是统计上显著的。有用的统计分析方法描述于L.D.Fisher和G.vanBelle,Biostatistics:A Methodology for the Health Sciences(Wiley-Interscience,NY,1993)中。统计显著性可以基于置信度(“p”)值来确定，该值可以使用未配对2尾t检验来计算。小于或等于例如0.1、0.05、0.025或0.01的p值通常可用于表示统计显著性。置信区间和p值可以通过本领域众所周知的方法来确定。参见例如Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York,1983。

用蛋白质激酶抑制剂治疗

在一个方面，本公开提供了一种用酪氨酸激酶抑制剂在患者中治疗癌症的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：a)测量从患者获得的样本中第一蛋白激酶的表达水平；b)将第一蛋白激酶的表达水平与相应的参考表达水平进行比较；c)确定患者对酪氨酸激酶抑制剂有反应的可能性；以及d)用酪氨酸激酶抑制剂治疗患者，所述患者的第一蛋白激酶表达水平表明患者将有反应性。

在某些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂是多靶点酪氨酸激酶抑制剂。多靶点酪氨酸激酶抑制剂的实例包括普纳替尼(Ponatinib)、西地尼布(Cediranib)、舒尼替尼(Sunitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、伊马替尼(Imatinib)、索拉非尼(Sorafenib)、瑞格非尼(Regorafenib)、安罗替尼(Anlotinib)、立尼法尼(Linifanib)、多韦替尼(Dovitinib)、伯舒替尼(Bosutinib)等。

在一些实施方式中，多靶点酪氨酸激酶抑制剂优先抑制与第一酪氨酸激酶不同的第二酪氨酸激酶。在又一个实施方式中，第二蛋白激酶是KDR。

在某些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂是抗体、反义寡核苷酸或化合物。在一些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂是式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐

其中：

R₁是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、卤素或氰基；

M是CH或N；

L是O、NH或N(CH₃)；

A是CR₅或N；

W是CR₆或N；

R₂、R₅和R₆独立地是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、卤素、C_3-7环烷基或氰基；

X、Y和Z独立地是CH或N；并且

R₃和R₄独立地是氢、卤素、氰基、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、C_2-6烯基、羟基-C_1-6烷基、二-(C_1-6烷基氨基)-C_1-6烷基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_3-7环烷基氨基、二-(C_1-6烷基)氨基、氨基-C_1-6烷基氨基、C_1-6烷氧基-C_1-6烷基氨基、C_1-6烷氧基羰基-C_1-6烷基氨基、二-(C_1-6烷氧基-C_1-6烷基)氨基、氨基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、二-(C_1-6烷基)氨基羰基、C_3-7环烷基氨基羰基、C_1-6烷氧基、C_3-7环烷氧基、羟基-C_1-6烷氧基、C_1-6卤代烷氧基、氨基-C_1-6烷基、氨基-C_1-6烷氧基、C_1-6烷基磺酰基、C_2-6烯基磺酰基、C_3-7环烷基磺酰基、任选地被B取代的杂环基、任选地被B取代的芳基、任选地被B取代的杂芳基、C_1-6烷基磺酰氨基、C_2-6烯基磺酰氨基、C_3-7环烷基磺酰氨基、酰胺基、C_1-6烷基羰基氨基、C_2-6烯基羰基氨基、C_3-7环烷基羰基氨基、C_1-6烷氧基羰基氨基、C_3-7环烷氧基羰基氨基、脲基、C_3-7环烷基、C_3-7卤代环烷基、杂环氧基、哌啶基氨基、N-甲基-哌啶基-4-羰基、哌嗪基-C_1-6烷基、吡咯基羰基氨基、N-甲基-哌啶基羰基氨基或杂环基-C_1-6烷氧基；或

R₃和R₄与其所连接的芳环中的原子一起形成3至8元环；并且

B是氢、C_1-6烷基、C_1-6卤代烷基、卤素、羟基、芳基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_3-7环烷基氨基、二-(C_1-6烷基)氨基、氰基或C_3-7环烷基。

在某些实施方式中，

R₁是氢；

M是N；

L是O；

A是CR₅；

W是CR₆；

R₂、R₅和R₆独立地是氢、C_1-6烷基或卤素；

X、Y和Z是CH；并且

R₃和R₄独立地是氢、卤素、C_1-6卤代烷基或C_1-6卤代烷氧基。

在一个实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂具有选自下组的结构：

在一个实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂是CBT-102，其具有以下结构：

在某些实施方式中，酪氨酸激酶抑制剂可以与药学上可接受的载体一起配制。载体(当存在时)可以任何合适的量与酪氨酸激酶抑制剂混合，例如以酪氨酸激酶抑制剂和载体的总体积或重量计，载体的量为5重量％至95重量％。在一些实施方式中，载体的量可以在一个范围内，其下限为5％、10％、12％、15％、20％、25％、28％、30％、40％、50％、60％、70％或75％中的任何一个，而上限高于下限，为20％、22％、25％、28％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％和95％中的任何一个。可基于对具体剂型、酪氨酸激酶抑制剂的相对量、包括载体在内的组合物的总重量、载体的物理和化学性质以及本制剂领域普通技术人员已知的其他因素的考虑来确定

具体实施方式

中的载体量。

酪氨酸激酶抑制剂可以任何所需的有效方式施用：用于口服，或作为软膏或滴剂局部施用至眼睛，或以任何适当方式用于肠胃外或其他施用，如腹腔内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌肉内、静脉内、动脉内、鞘内或淋巴管内。此外，酪氨酸激酶抑制剂可与其他治疗剂联合施用。如果需要，酪氨酸激酶抑制剂可以被囊封或以其他方式防止胃部或其他分泌物。

本文公开的酪氨酸激酶抑制剂的剂量的合适的非限制性实例是每天约1mg/kg至约2400mg/kg，如每天约1mg/kg至约1200mg/kg、每天75mg/kg至每天约300mg/kg，包括每天约1mg/kg至约100mg/kg。此类药剂的其他代表性剂量包括每天约1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、800mg/kg、900mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg、2000mg/kg、2100mg/kg、2200mg/kg和2300mg/kg。在一些实施方式中，在人中的酪氨酸激酶抑制剂的剂量为约400mg/天，每12小时给药一次。在一些实施方式中，在人中的酪氨酸激酶抑制剂的剂量范围为300-500mg/天、100-600mg/天或25-1000mg/天。本文公开的酪氨酸激酶抑制剂的有效剂量可作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量，在一天中以适当的时间间隔分开施用。

提供以下实施例是为了更好地说明所要求的发明，而不是解释为限制本发明的范围。下面描述的所有具体组合物、材料和方法，全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而仅为了说明落入本发明范围内的具体实施方式。本领域的技术人员可以开发出等效的组合物、材料和方法，而无需行使发明能力且不脱离本发明的范围。应理解，可以在本文所述的程序中进行许多变化，同时仍保持在本发明的范围内。本发明人的意图是这些变化都包括在本发明的范围内。

实施例1

材料和方法

1.激酶分析

对于大多数测定，激酶标记的T7噬菌体病毒株在24孔块中在来源于BL21菌株的大肠杆菌宿主中平行生长。大肠杆菌生长至对数期，用来自冷冻储备液的T7噬菌体感染(感染复数＝0.4)，并在32℃下振荡培育，直至裂解(90-150分钟)。将裂解物离心(6,000×g)并过滤(0.2μm)以去除细胞碎片。或者，一些激酶是在HEK-293细胞中产生的。用激酶的生物素化小分子配体在室温下处理链霉亲和素包被的磁珠30分钟，以产生用于激酶测定的亲和树脂。配体化珠用过量的生物素阻断，并用阻断缓冲液(SeaBlock(Pierce)，1％BSA，0.05％Tween 20，1mM DTT)洗涤，以去除未结合的配体并减少非特异性噬菌体结合。结合反应是通过将激酶、配体化亲和珠和测试化合物在1×结合缓冲液(20％SeaBlock、0.17×PBS、0.05％Tween 20、6mM DTT)中组合来组装。测试化合物在100％DMSO中制备为40倍储备液，并直接稀释到测定中。所有反应都在聚丙烯384孔板中进行，最终体积为0.04ml。将测定板在室温下振荡培育1小时，并用洗涤缓冲液(1×PBS，0.05％Tween 20)洗涤亲和珠。然后将珠粒重新悬浮在洗脱缓冲液(1×PBS，0.05％Tween 20，0.5μM非生物素化亲和配体)中，并在室温下振荡培育30分钟。通过qPCR测量洗脱液中的激酶浓度。

在要求的浓度下对化合物进行筛选，初步筛选结合相互作用的结果以对照百分比“％Ctrl”报告，其中较低的数字表示在下页的矩阵中更强的命中。

阴性对照＝DMSO(100％Ctrl)

阳性对照＝对照化合物(0％Ctrl)

选择性评分或S-评分是对化合物选择性的定量量度。它的计算方法是将化合物结合的激酶数量除以测试的不同激酶(不包括突变变体)的总数。

S＝命中数/测定数

该值可以使用％Ctrl作为效力阈值来计算(如下)，并提供描述化合物选择性的定量方法，以便于不同化合物的比较。

S(35)＝(％Ctrl<35的非突变激酶的数量)/(测试的非突变激酶的数量)

S(10)＝(％Ctrl<10的非突变激酶的数量)/(测试的非突变激酶的数量)

S(1)＝(％Ctrl<1的非突变激酶的数量)/(测试的非突变激酶的数量)

2.CBT-102的激酶IC50值

使用Eurofins标准KinaseProfiler测定并按照相关的标准操作程序针对每个选定的激酶测试CBT-102。在加入含有酶和底物的反应混合物之前，将所需体积的50倍测试化合物(CBT-102)储备液加入测定孔中。通过加入选定浓度的ATP来引发反应。在加入ATP之前，没有将化合物与酶/底物混合物进行预培育。

使用定制的内部分析软件处理数据。结果以DMSO对照的百分比形式表示为剩余的激酶活性。这是使用以下公式计算的：

对于IC50的确定，使用XLFit 5.3版(ID Business Solutions)分析数据。

3.CBT-102在PDX模型中的体内功效

从供体小鼠获得的PDX肿瘤片段在右上背侧皮下接种到雌性BALB/c裸鼠体内用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约150(100-200)mm³时开始随机分组。分组当天将表示为第0天，给药开始为第1天。肿瘤体积每周使用卡尺在两个维度上测量两次，且使用以下公式以mm³为单位表示体积："V＝(L×W×W)/2，其中V是肿瘤体积，L是肿瘤长度(最长的肿瘤尺寸)，W是肿瘤宽度(垂直于L的最长肿瘤尺寸)。PDX模型包括胃癌模型、肺癌模型、结肠直肠癌模型、肝癌、食道癌、乳腺癌等。

4.PDX肿瘤中的蛋白激酶表达

从PDX模型中获得肿瘤，并通过RNAseq检测蛋白激酶的表达水平。

5.评价CBT-102对M-NFS-60和RAW264.7同基因细胞系和工程化BaF3hCSF1R细胞系增殖的影响

对两个同基因细胞系M-NFS-60和RAW264.7以及工程化BaF3hCSF1R细胞系饥饿培养，然后在37℃、5％CO₂和95％的湿度下，用CBT-102和其他测试物品测试3天。然后使用CTG测定检测细胞活力。使用GraphPad Prism软件计算IC50。

6.CBT-102对皮下MC-38鼠结肠癌模型的体内功效

在37℃下、在含5％CO₂的空气气氛中用补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基体外维持MC-38肿瘤细胞。每只小鼠在右侧腹区剃毛后皮下接种含MC-38肿瘤细胞(1×10e6)的0.1mL PBS用于肿瘤发展。当平均肿瘤大小达到约100mm³时开始随机分组。第1组小鼠用媒剂处理，第2组小鼠在前11天用20mg/kg CBT-102处理，然后减至10mg/kg。

7.MC-38肿瘤中的CD3/CD4/CD8/F4-80 IHC测试

在体内功效试验结束时收集MC38肿瘤组织。然后将肿瘤组织包埋在石蜡中。通过免疫组化染色测试CD3/CD4/CD8/F4-80的表达。

实施例2

本实施例说明了对可被CBT-102有效抑制的蛋白激酶的筛选。

1.CBT-102具有独特的激酶分析谱

筛选测定测试了CBT-102对403种候选蛋白激酶的抑制功效。如表1所示，CBT-102在抑制该组蛋白激酶方面表现出不同的功效(显示为对照％)。特别是，如表2所示，在测试的403种蛋白激酶中，CBT-102对13种蛋白激酶表现出强抑制作用(显示为S(1))，对36种蛋白激酶表现出中等抑制作用(显示为S(10))。

表1

表2

2.CBT-102的激酶IC50值

如下表3所示，以下蛋白激酶显示CBT-102的IC50小于100nM：CDKL2、cKit、c-RAF、DDR1、Flt1、Flt4、CSF1R、KDR、MAP4K5、PDGFRα、PTK5、Ret、SAPK2b、ZAK。

表3

实施例3

本实施例说明DDR1的表达水平与CBT-102的功效相关。

如图1所示，CBT-102在一组PDX模型中表现出不同的体内功效。然后在这些PDX模型中测量DDR1的表达水平。分析了这些PDX模型中DDR1表达水平与CBT-102的功效之间的关系。如图2A和2B所示，PDX模型中DDR1表达水平与CBT-102的功效具有显著相关性。

在所有PDX模型中，还分析了肺癌模型中DDR1表达与CBT-102的功效之间的关系。如图3A和3B所示，肺癌PDX模型中DDR1表达水平与CBT-102的功效具有显著相关性。

实施例4

本实施例说明CBT-102通过CSF-1/CSF-1R通路抑制癌细胞增殖。

CSF-1依赖性小鼠骨髓M-NFS-60细胞用作目标细胞，而CSF-1非依赖性细胞系Raw264.7用作阴性对照。除CBT-102外，该研究还包括3种CSF-1R抑制剂：GW2580、BLZ945和培西达替尼(Pexidartinib)。如表4和图4A和4B所示，CBT-102、GW2580、BLZ945和培西达替尼有效抑制了M-NFS-60的增殖。CBT-102、GW2580、BLZ945和培西达替尼的IC50分别为0.631/0.343、1.145、3.015和0.348μM。相比之下，CSF-1非依赖性RAW264.7细胞对CBT-102(IC50为22.85μM)以及其他两种化合物BLC945(IC50>30μM)和培西达替尼(IC50＝16.36μM)显示出耐药性。在工程化BaF3hCSF1R细胞系中，CBT-102的IC50值为0.588μM，相比于类似的多激酶抑制剂索凡替尼(sulfatinib)为1.333μM，更特异的CSF1R激酶抑制剂GW2580为0.279μM。这些结果表明，CBT-102通过干扰CSF1-CSF1R通路抑制癌细胞增殖测定。

表4.CBT-102对2个同基因细胞系的IC50

2.CBT-102抑制MC-38肿瘤的生长

表5.

在第14天进行处理。用20mg/kg(10mg/kg)的CBT-102处理产生抗肿瘤功效，肿瘤接种后第34天(PG-D21)肿瘤大小为454.63mm³。(TGI：79.91％，与媒剂处理组相比p<0.001)(图5)。

3.CBT-102降低MC-38肿瘤的F4-80IHC评分

在用CBT-102处理后，MC-38肿瘤组织的F4-80 IHC评分(％)显著降低。F4-80是巨噬细胞的表面标志物。结果表明，CBT-102对肿瘤组织中的巨噬细胞有影响。与媒剂组相比，CBT-102对MC-38肿瘤中的T细胞表面标志物CD3、CD4和CD8没有显著影响(图6和7)。

序列表

<110> 浙江冠科美博生物科技有限公司

<120> 使用多靶点激酶抑制剂结合蛋白激酶生物标志物的癌症治疗

<130> 071017-8006CN01

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3840

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gtcttcccct cgtgggccct gagcgggact gcagccagcc ccctggggcg ccagctttgg 60

aggcccccga cagctgctct cgggagccgc ctcccgacac ccgagccccg ccggcgcctc 120

ccgctcccgg ctcccggctc ctggctccct ccgcctcccc cgcccctcgc cccgccgccg 180

aagaggcccc gctcccgggt cggacgcctg ggtctgccgg gaagagcgat gagaggtgtc 240

tgaaggtggc tattcactga gcgatggggt tggacttgaa ggaatgccaa gagatgctgc 300

ccccaccccc ttaggcccga gggatcagga gctatgggac cagaggccct gtcatcttta 360

ctgctgctgc tcttggtggc aagtggagat gctgacatga agggacattt tgatcctgcc 420

aagtgccgct atgccctggg catgcaggac cggaccatcc cagacagtga catctctgct 480

tccagctcct ggtcagattc cactgccgcc cgccacagca ggttggagag cagtgacggg 540

gatggggcct ggtgccccgc agggtcggtg tttcccaagg aggaggagta cttgcaggtg 600

gatctacaac gactgcacct ggtggctctg gtgggcaccc agggacggca tgccgggggc 660

ctgggcaagg agttctcccg gagctaccgg ctgcgttact cccgggatgg tcgccgctgg 720

atgggctgga aggaccgctg gggtcaggag gtgatctcag gcaatgagga ccctgaggga 780

gtggtgctga aggaccttgg gccccccatg gttgcccgac tggttcgctt ctacccccgg 840

gctgaccggg tcatgagcgt ctgtctgcgg gtagagctct atggctgcct ctggagggat 900

ggactcctgt cttacaccgc ccctgtgggg cagacaatgt atttatctga ggccgtgtac 960

ctcaacgact ccacctatga cggacatacc gtgggcggac tgcagtatgg gggtctgggc 1020

cagctggcag atggtgtggt ggggctggat gactttagga agagtcagga gctgcgggtc 1080

tggccaggct atgactatgt gggatggagc aaccacagct tctccagtgg ctatgtggag 1140

atggagtttg agtttgaccg gctgagggcc ttccaggcta tgcaggtcca ctgtaacaac 1200

atgcacacgc tgggagcccg tctgcctggc ggggtggaat gtcgcttccg gcgtggccct 1260

gccatggcct gggaggggga gcccatgcgc cacaacctag ggggcaacct gggggacccc 1320

agagcccggg ctgtctcagt gccccttggc ggccgtgtgg ctcgctttct gcagtgccgc 1380

ttcctctttg cggggccctg gttactcttc agcgaaatct ccttcatctc tgatgtggtg 1440

aacaattcct ctccggcact gggaggcacc ttcccgccag ccccctggtg gccgcctggc 1500

ccacctccca ccaacttcag cagcttggag ctggagccca gaggccagca gcccgtggcc 1560

aaggccgagg ggagcccgac cgccatcctc atcggctgcc tggtggccat catcctgctc 1620

ctgctgctca tcattgccct catgctctgg cggctgcact ggcgcaggct cctcagcaag 1680

gctgaacgga gggtgttgga agaggagctg acggttcacc tctctgtccc tggggacact 1740

atcctcatca acaaccgccc aggtcctaga gagccacccc cgtaccagga gccccggcct 1800

cgtgggaatc cgccccactc cgctccctgt gtccccaatg gctctgccta cagtggggac 1860

tatatggagc ctgagaagcc aggcgccccg cttctgcccc cacctcccca gaacagcgtc 1920

ccccattatg ccgaggctga cattgttacc ctgcagggcg tcaccggggg caacacctat 1980

gctgtgcctg cactgccccc aggggcagtc ggggatgggc cccccagagt ggatttccct 2040

cgatctcgac tccgcttcaa ggagaagctt ggcgagggcc agtttgggga ggtgcacctg 2100

tgtgaggtcg acagccctca agatctggtt agtcttgatt tcccccttaa tgtgcgtaag 2160

ggacaccctt tgctggtagc tgtcaagatc ttacggccag atgccaccaa gaatgccagg 2220

aatgatttcc tgaaagaggt gaagatcatg tcgaggctca aggacccaaa catcattcgg 2280

ctgctgggcg tgtgtgtgca ggacgacccc ctctgcatga ttactgacta catggagaac 2340

ggcgacctca accagttcct cagtgcccac cagctggagg acaaggcagc cgagggggcc 2400

cctggggacg ggcaggctgc gcaggggccc accatcagct acccaatgct gctgcatgtg 2460

gcagcccaga tcgcctccgg catgcgctat ctggccacac tcaactttgt acatcgggac 2520

ctggccacgc ggaactgcct agttggggaa aatttcacca tcaaaatcgc agactttggc 2580

atgagccgga acctctatgc tggggactat taccgtgtgc agggccgggc agtgctgccc 2640

atccgctgga tggcctggga gtgcatcctc atggggaagt tcacgactgc gagtgacgtg 2700

tgggcctttg gtgtgaccct gtgggaggtg ctgatgctct gtagggccca gccctttggg 2760

cagctcaccg acgagcaggt catcgagaac gcgggggagt tcttccggga ccagggccgg 2820

caggtgtacc tgtcccggcc gcctgcctgc ccgcagggcc tatatgagct gatgcttcgg 2880

tgctggagcc gggagtctga gcagcgacca cccttttccc agctgcatcg gttcctggca 2940

gaggatgcac tcaacacggt gtgaatcaca catccagctg cccctccctc agggagcgat 3000

ccaggggaag ccagtgacac taaaacaaga ggacacaatg gcacctctgc ccttcccctc 3060

ccgacagccc atcacctcta atagaggcag tgagactgca ggtgggctgg gcccacccag 3120

ggagctgatg ccccttctcc ccttcctgga cacactctca tgtccccttc ctgttcttcc 3180

ttcctagaag cccctgtcgc ccacccagct ggtcctgtgg atgggatcct ctccaccctc 3240

ctctagccat cccttgggga agggtgggga gaaatatagg atagacactg gacatggccc 3300

attggagcac ctgggcccca ctggacaaca ctgattcctg gagaggtggc tgcgccccca 3360

gcttctctct ccctgtcaca cactggaccc cactggctga gaatctgggg gtgaggagga 3420

caagaaggag aggaaaatgt ttccttgtgc ctgctcctgt acttgtcctc agcttgggct 3480

tcttcctcct ccatcacctg aaacactgga cctgggggta gccccgcccc agccctcagt 3540

cacccccact tcccacttgc agtcttgtag ctagaacttc tctaagccta tacgtttctg 3600

tggagtaaat attgggattg gggggaaaga gggagcaacg gcccatagcc ttggggttgg 3660

acatctctag tgtagctgcc acattgattt ttctataatc acttggggtt tgtacatttt 3720

tggggggaga gacacagatt tttacactaa tatatggacc tagcttgagg caattttaat 3780

cccctgcact aggcaggtaa taataaaggt tgagttttcc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3840

<210> 2

<211> 876

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Gly Pro Glu Ala Leu Ser Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Ser Gly Asp Ala Asp Met Lys Gly His Phe Asp Pro Ala Lys Cys Arg

20 25 30

Tyr Ala Leu Gly Met Gln Asp Arg Thr Ile Pro Asp Ser Asp Ile Ser

35 40 45

Ala Ser Ser Ser Trp Ser Asp Ser Thr Ala Ala Arg His Ser Arg Leu

50 55 60

Glu Ser Ser Asp Gly Asp Gly Ala Trp Cys Pro Ala Gly Ser Val Phe

65 70 75 80

Pro Lys Glu Glu Glu Tyr Leu Gln Val Asp Leu Gln Arg Leu His Leu

85 90 95

Val Ala Leu Val Gly Thr Gln Gly Arg His Ala Gly Gly Leu Gly Lys

100 105 110

Glu Phe Ser Arg Ser Tyr Arg Leu Arg Tyr Ser Arg Asp Gly Arg Arg

115 120 125

Trp Met Gly Trp Lys Asp Arg Trp Gly Gln Glu Val Ile Ser Gly Asn

130 135 140

Glu Asp Pro Glu Gly Val Val Leu Lys Asp Leu Gly Pro Pro Met Val

145 150 155 160

Ala Arg Leu Val Arg Phe Tyr Pro Arg Ala Asp Arg Val Met Ser Val

165 170 175

Cys Leu Arg Val Glu Leu Tyr Gly Cys Leu Trp Arg Asp Gly Leu Leu

180 185 190

Ser Tyr Thr Ala Pro Val Gly Gln Thr Met Tyr Leu Ser Glu Ala Val

195 200 205

Tyr Leu Asn Asp Ser Thr Tyr Asp Gly His Thr Val Gly Gly Leu Gln

210 215 220

Tyr Gly Gly Leu Gly Gln Leu Ala Asp Gly Val Val Gly Leu Asp Asp

225 230 235 240

Phe Arg Lys Ser Gln Glu Leu Arg Val Trp Pro Gly Tyr Asp Tyr Val

245 250 255

Gly Trp Ser Asn His Ser Phe Ser Ser Gly Tyr Val Glu Met Glu Phe

260 265 270

Glu Phe Asp Arg Leu Arg Ala Phe Gln Ala Met Gln Val His Cys Asn

275 280 285

Asn Met His Thr Leu Gly Ala Arg Leu Pro Gly Gly Val Glu Cys Arg

290 295 300

Phe Arg Arg Gly Pro Ala Met Ala Trp Glu Gly Glu Pro Met Arg His

305 310 315 320

Asn Leu Gly Gly Asn Leu Gly Asp Pro Arg Ala Arg Ala Val Ser Val

325 330 335

Pro Leu Gly Gly Arg Val Ala Arg Phe Leu Gln Cys Arg Phe Leu Phe

340 345 350

Ala Gly Pro Trp Leu Leu Phe Ser Glu Ile Ser Phe Ile Ser Asp Val

355 360 365

Val Asn Asn Ser Ser Pro Ala Leu Gly Gly Thr Phe Pro Pro Ala Pro

370 375 380

Trp Trp Pro Pro Gly Pro Pro Pro Thr Asn Phe Ser Ser Leu Glu Leu

385 390 395 400

Glu Pro Arg Gly Gln Gln Pro Val Ala Lys Ala Glu Gly Ser Pro Thr

405 410 415

Ala Ile Leu Ile Gly Cys Leu Val Ala Ile Ile Leu Leu Leu Leu Leu

420 425 430

Ile Ile Ala Leu Met Leu Trp Arg Leu His Trp Arg Arg Leu Leu Ser

435 440 445

Lys Ala Glu Arg Arg Val Leu Glu Glu Glu Leu Thr Val His Leu Ser

450 455 460

Val Pro Gly Asp Thr Ile Leu Ile Asn Asn Arg Pro Gly Pro Arg Glu

465 470 475 480

Pro Pro Pro Tyr Gln Glu Pro Arg Pro Arg Gly Asn Pro Pro His Ser

485 490 495

Ala Pro Cys Val Pro Asn Gly Ser Ala Tyr Ser Gly Asp Tyr Met Glu

500 505 510

Pro Glu Lys Pro Gly Ala Pro Leu Leu Pro Pro Pro Pro Gln Asn Ser

515 520 525

Val Pro His Tyr Ala Glu Ala Asp Ile Val Thr Leu Gln Gly Val Thr

530 535 540

Gly Gly Asn Thr Tyr Ala Val Pro Ala Leu Pro Pro Gly Ala Val Gly

545 550 555 560

Asp Gly Pro Pro Arg Val Asp Phe Pro Arg Ser Arg Leu Arg Phe Lys

565 570 575

Glu Lys Leu Gly Glu Gly Gln Phe Gly Glu Val His Leu Cys Glu Val

580 585 590

Asp Ser Pro Gln Asp Leu Val Ser Leu Asp Phe Pro Leu Asn Val Arg

595 600 605

Lys Gly His Pro Leu Leu Val Ala Val Lys Ile Leu Arg Pro Asp Ala

610 615 620

Thr Lys Asn Ala Arg Asn Asp Phe Leu Lys Glu Val Lys Ile Met Ser

625 630 635 640

Arg Leu Lys Asp Pro Asn Ile Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys Val Gln

645 650 655

Asp Asp Pro Leu Cys Met Ile Thr Asp Tyr Met Glu Asn Gly Asp Leu

660 665 670

Asn Gln Phe Leu Ser Ala His Gln Leu Glu Asp Lys Ala Ala Glu Gly

675 680 685

Ala Pro Gly Asp Gly Gln Ala Ala Gln Gly Pro Thr Ile Ser Tyr Pro

690 695 700

Met Leu Leu His Val Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu

705 710 715 720

Ala Thr Leu Asn Phe Val His Arg Asp Leu Ala Thr Arg Asn Cys Leu

725 730 735

Val Gly Glu Asn Phe Thr Ile Lys Ile Ala Asp Phe Gly Met Ser Arg

740 745 750

Asn Leu Tyr Ala Gly Asp Tyr Tyr Arg Val Gln Gly Arg Ala Val Leu

755 760 765

Pro Ile Arg Trp Met Ala Trp Glu Cys Ile Leu Met Gly Lys Phe Thr

770 775 780

Thr Ala Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Leu Trp Glu Val Leu

785 790 795 800

Met Leu Cys Arg Ala Gln Pro Phe Gly Gln Leu Thr Asp Glu Gln Val

805 810 815

Ile Glu Asn Ala Gly Glu Phe Phe Arg Asp Gln Gly Arg Gln Val Tyr

820 825 830

Leu Ser Arg Pro Pro Ala Cys Pro Gln Gly Leu Tyr Glu Leu Met Leu

835 840 845

Arg Cys Trp Ser Arg Glu Ser Glu Gln Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu

850 855 860

His Arg Phe Leu Ala Glu Asp Ala Leu Asn Thr Val

865 870 875

<210> 3

<211> 4006

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

gaagggcaga cagagtgtcc aaaagcgtga gagcacgaag tgaggagaag gtggagaaga 60

gagaagagga agaggaagag gaagagagga agcggaggga actgcggcca ggctaaaagg 120

ggaagaagag gatcagccca aggaggagga agaggaaaac aagacaaaca gccagtgcag 180

aggagaggaa cgtgtgtcca gtgtcccgat ccctgcggag ctagtagctg agagctctgt 240

gccctgggca ccttgcagcc ctgcacctgc ctgccacttc cccaccgagg ccatgggccc 300

aggagttctg ctgctcctgc tggtggccac agcttggcat ggtcagggaa tcccagtgat 360

agagcccagt gtccctgagc tggtcgtgaa gccaggagca acggtgacct tgcgatgtgt 420

gggcaatggc agcgtggaat gggatggccc cccatcacct cactggaccc tgtactctga 480

tggctccagc agcatcctca gcaccaacaa cgctaccttc caaaacacgg ggacctatcg 540

ctgcactgag cctggagacc ccctgggagg cagcgccgcc atccacctct atgtcaaaga 600

ccctgcccgg ccctggaacg tgctagcaca ggaggtggtc gtgttcgagg accaggacgc 660

actactgccc tgtctgctca cagacccggt gctggaagca ggcgtctcgc tggtgcgtgt 720

gcgtggccgg cccctcatgc gccacaccaa ctactccttc tcgccctggc atggcttcac 780

catccacagg gccaagttca ttcagagcca ggactatcaa tgcagtgccc tgatgggtgg 840

caggaaggtg atgtccatca gcatccggct gaaagtgcag aaagtcatcc cagggccccc 900

agccttgaca ctggtgcctg cagagctggt gcggattcga ggggaggctg cccagatcgt 960

gtgctcagcc agcagcgttg atgttaactt tgatgtcttc ctccaacaca acaacaccaa 1020

gctcgcaatc cctcaacaat ctgactttca taataaccgt taccaaaaag tcctgaccct 1080

caacctcgat caagtagatt tccaacatgc cggcaactac tcctgcgtgg ccagcaacgt 1140

gcagggcaag cactccacct ccatgttctt ccgggtggta gagagtgcct acttgaactt 1200

gagctctgag cagaacctca tccaggaggt gaccgtgggg gaggggctca acctcaaagt 1260

catggtggag gcctacccag gcctgcaagg ttttaactgg acctacctgg gacccttttc 1320

tgaccaccag cctgagccca agcttgctaa tgctaccacc aaggacacat acaggcacac 1380

cttcaccctc tctctgcccc gcctgaagcc ctctgaggct ggccgctact ccttcctggc 1440

cagaaaccca ggaggctgga gagctctgac gtttgagctc acccttcgat accccccaga 1500

ggtaagcgtc atatggacat tcatcaacgg ctctggcacc cttttgtgtg ctgcctctgg 1560

gtacccccag cccaacgtga catggctgca gtgcagtggc cacactgata ggtgtgatga 1620

ggcccaagtg ctgcaggtct gggatgaccc ataccctgag gtcctgagcc aggagccctt 1680

ccacaaggtg acggtgcaga gcctgctgac tgttgagacc ttagagcaca accaaaccta 1740

cgagtgcagg gcccacaaca gcgtggggag tggctcctgg gccttcatac ccatctctgc 1800

aggagcccac acgcatcccc cggatgagtt cctcttcaca ccagtggtgg tcgcctgcat 1860

gtccatcatg gccttgctgc tgctgctgct cctgctgcta ttgtacaagt ataagcagaa 1920

gcccaagtac caggtccgct ggaagatcat cgagagctat gagggcaaca gttatacttt 1980

catcgacccc acgcagctgc cttacaacga gaagtgggag ttcccccgga acaacctgca 2040

gtttggtaag accctcggag ctggagcctt tgggaaggtg gtggaggcca cggcctttgg 2100

tctgggcaag gaggatgctg tcctgaaggt ggctgtgaag atgctgaagt ccacggccca 2160

tgctgatgag aaggaggccc tcatgtccga gctgaagatc atgagccacc tgggccagca 2220

cgagaacatc gtcaaccttc tgggagcctg tacccatgga ggccctgtac tggtcatcac 2280

ggagtactgt tgctatggcg acctgctcaa ctttctgcga aggaaggctg aggccatgct 2340

gggacccagc ctgagccccg gccaggaccc cgagggaggc gtcgactata agaacatcca 2400

cctcgagaag aaatatgtcc gcagggacag tggcttctcc agccagggtg tggacaccta 2460

tgtggagatg aggcctgtct ccacttcttc aaatgactcc ttctctgagc aagacctgga 2520

caaggaggat ggacggcccc tggagctccg ggacctgctt cacttctcca gccaagtagc 2580

ccagggcatg gccttcctcg cttccaagaa ttgcatccac cgggacgtgg cagcgcgtaa 2640

cgtgctgttg accaatggtc atgtggccaa gattggggac ttcgggctgg ctagggacat 2700

catgaatgac tccaactaca ttgtcaaggg caatgcccgc ctgcctgtga agtggatggc 2760

cccagagagc atctttgact gtgtctacac ggttcagagc gacgtctggt cctatggcat 2820

cctcctctgg gagatcttct cacttgggct gaatccctac cctggcatcc tggtgaacag 2880

caagttctat aaactggtga aggatggata ccaaatggcc cagcctgcat ttgccccaaa 2940

gaatatatac agcatcatgc aggcctgctg ggccttggag cccacccaca gacccacctt 3000

ccagcagatc tgctccttcc ttcaggagca ggcccaagag gacaggagag agcgggacta 3060

taccaatctg ccgagcagca gcagaagcgg tggcagcggc agcagcagca gtgagctgga 3120

ggaggagagc tctagtgagc acctgacctg ctgcgagcaa ggggatatcg cccagccctt 3180

gctgcagccc aacaactatc agttctgctg aggagttgac gacagggagt accactctcc 3240

cctcccacaa acttcaactc ctccatggat ggggcgacac ggggagaaca tacaaactct 3300

gccttcggtc atttcactca acagctcggc ccagctctga aacttgggaa ggtgagggat 3360

tcaggggagg tcagaggatc ccacttcctg agcatgggcc atcactgcca gtcaggggct 3420

gggggctgag ccctcacccc cccctcccct actgttctca tggtgttggc ctcgtgtttg 3480

ctatgccaac tagtagaacc ttctttccta atccccttat cttcatggaa atggactgac 3540

tttatgccta tgaagtcccc aggagctaca ctgatactga gaaaaccagg ctctttgggg 3600

ctagacagac tggcagagag tgagatctcc ctctctgaga ggagcagcag atgctcacag 3660

accacactca gctcaggccc cttggagcag gatggctcct ctaagaatct cacaggacct 3720

cttagtctct gccctatacg ccgccttcac tccacagcct cacccctccc acccccatac 3780

tggtactgct gtaatgagcc aagtggcagc taaaagttgg gggtgttctg cccagtcccg 3840

tcattctggg ctagaaggca ggggaccttg gcatgtggct ggccacacca agcaggaagc 3900

acaaactccc ccaagctgac tcatcctaac taacagtcac gccgtgggat gtctctgtcc 3960

acattaaact aacagcatta atgcagtcaa aaaaaaaaaa aaaaaa 4006

<210> 4

<211> 972

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

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Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

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Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

965 970