阅读说明：本技术 半合成噢哢及其使用方法 (Semi-synthetic aurone and method of use thereof ) 是由 J·S·布莱克本 M·弗朗斯纽克 刘春明 谢彦奇 D·S·瓦特 于 2019-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了半合成噢哢(aurone)、药物组合物和治疗癌症的方法。半合成噢哢化合物包括式(I)所示的结构,或其药学上可接受的盐,其中R<Sup>1</Sup>是H、烷基氰基、被一个或多个卤素取代的烷基苯基,或其任意组合,R<Sup>2</Sup>是芳香基、杂环,或其组合。药物组合物包括半合成噢哢化合物和载体。该方法包括向需要这种治疗的患者施用有效量的半合成噢哢化合物。(The present invention provides semi-synthetic aurone (aurone), pharmaceutical compositions and methods of treating cancer. The semi-synthetic aurone compound comprises a structure shown as a formula (I), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein R 1 Is H, alkylcyano, alkylphenyl substituted by one or more halogens, or any combination thereof, R 2 Is an aromatic group, a heterocyclic ring, or a combination thereof. The pharmaceutical composition comprises the semi-synthetic aurone compound and a carrier. The method comprises administering to a patient in need of such treatment an effective amount of a semi-synthetic aurone compound.)

半合成噢哢及其使用方法

相关申请

本申请要求2018年1月22日提交的序列号62/620,120的美国临时申请的权益，该临时申请通过引用全文并入本文。

政府利益

在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的第R00 CA181500；R01 CA172379；DP2 CA228043和R21 CA205108号合同，以及国立普通医学科学研究院(National Institute of General Medical Sciences)授予的第P20 RR020171和P30GM110787号合同的支持下进行本发明。政府享有本发明的某些权力。

技术领域

本公开涉及半合成噢哢(aurone)及其使用方法。特别地，本公开涉及具有抗肿瘤活性的半合成噢哢，以及这种噢哢抑制所需患者中癌细胞生长的应用，所述癌例如白血病、结肠癌、***癌、乳腺癌或肺癌。

背景技术

噢哢包括相对少量的植物源类黄酮(flavonoid)，该植物源类黄酮是由混合的聚酮-莽草酸(polyketide-shikimate)途径产生，并且拥有一系列生物特性。几种天然存在的噢哢有抗肿瘤活性，因而人们进行了通常在低微摩尔浓度下的天然和半合成噢哢作为体外癌细胞增殖抑制剂的研究。与这些噢哢抗肿瘤活性相关的其他研究在分子水平上确定了多种作用：P糖蛋白(P-gp)或ATP结合盒亚家族G成员2(ABCG2)的药物流出调节剂、腺苷受体相互作用的调节剂、DNA切断促进剂、端粒酶抑制剂、鞘氨醇激酶抑制剂、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI₃-α)抑制剂、周期蛋白依赖性激酶抑制剂、细胞保护性NAD(P)H：醌氧化还原酶-l(NQOl)诱导剂，以及活性氧(ROS)清除剂。然而，由于报告了多种效果，必须谨慎地确定生物系统中的靶点。

因此，不断需要能够安全有效地作为抗肿瘤剂并且治疗癌症的化合物。

发明内容

在研究了本文提供的信息后，本领域普通技术人员会显而易见的明白本发明公开的主题满足了上述部分或全部的需求。

发明内容描述了本公开主题的几个实施方式，并且在许多情况下列出了这些实施方式的变化和变换。发明内容仅仅是众多和多种实施方式的示例。所提及的给定实施方式的一个或多个代表性特征同样是示例性的。这种实施方式通常可以在有或没有所提及的一个或多个特征的情况下存在；同样，这些特征可以应用于本公开主题的其他实施方式，无论该实施方式是否在本发明内容中列出。为了避免过度重复，本发明内容没有列出或指出这些特征的所有可能的组合。

在一些实施方式中，本公开主题包括具有根据式(I)所示结构的半合成噢哢化合物，或其药学上可接受的盐：

其中R¹是H、烷基氰基(alkyl cyano)、被一个或多个卤素取代的烷基苯基，或其任意组合；R²是芳香基、杂环，或其组合。在一些实施方式中，所述化合物的结构包括：

在一些实施方式中，R²包括芳香基。所述芳香基可以包括至少一个取代基，例如但不限于卤素、烷基、烷氧基、氨基、杂环，或其任意组合。在一些实施方式中，该化合物包括式(II)所示结构，或其药学上可接受的盐：

在一些实施方式中，所述杂环包括含氮环(nitrogen-containing ring)。在一些实施方式中，所述含氮环包括第一氮原子和至少一个其他非碳原子，例如但不限于氮、氧、硫，或其任意组合。在一些实施方式中，所述杂环包括4至10元杂环。在一些实施方式中，所述杂环包括吡啶基、哒嗪基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基、异喹啉基、喹啉基、吲哚基，或其任意组合。在一些实施方式中，所述杂环包括至少一个取代基，例如但不限于O、OH、卤素、烷基、烷氧基、氨基、羧基，或其任意组合。

在一些实施方式中，R²包括杂环。在一些实施方式中，所述化合物包括式(III)所示结构，或其药学上可接受的盐：

在一些实施方式中，所述杂环包括含氮环。在一些实施方式中，所述含氮环包括第一氮原子和至少一个其他非碳原子，例如但不限于氮、氧、硫，或其任意组合。在一些实施方式中，所述杂环包括4至10元杂环。在一些实施方式中，所述杂环包括吡啶基、哒嗪基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基、异喹啉基、喹啉基、吲哚基，或其任意组合。在一些实施方式中，所述杂环包括至少一个取代基，例如但不限于O、OH、卤素、烷基、烷氧基、氨基、羧基，或其任意组合。

在一些实施方式中，本文还提供了包含半合成噢哢化合物和载体的药物组合物。

在一些实施方式中，本文还提供了治疗癌症的方法，所述方法包括向所需这种治疗的患者施用有效量的半合成噢哢化合物。在一些实施方式中，所述癌症包括***癌、结直肠癌、白血病，或其任意组合。

在研究了本文的描述、附图和非限制性实施例之后，本领域普通技术人员会显而易见的明白本发明公开主题的进一步特征和优点。

附图简要说明

结合考虑下面的详细描述，将更好地理解本公开的主题，并且以上所述之外的特征、方面和优点将变得显而易见。这种详细描述参考了以下附图，其中：

图1A-B显示了半合成噢哢的形成方案和示出了多种半合成噢哢的结构的图。(A)图显示了噢哢2-4的合成方案。图例：a，杂环取代的苯甲醛(benzaldehyde)或杂芳基甲醛(heteroarylcarboxaldehydes)，50％aq.KOH，1:1EtOH-DMF，b，BrCFLCN.K2CO3，DMF；c.BrCFLAr.K2CO3，DMF。(B)图显示了根据本公开实施方式的某些半合成噢哢的结构。

图2A-B显示了某些半合成噢哢抑制癌症或肿瘤生长的效果的图。(A)图显示了半合成噢哢4a及其类似物4r对多种癌细胞系增殖的相对抑制作用。(B)图中显示了半合成噢哢4a在l0 mg/kg/天时，抑制裸鼠(nude mice)的PC-3肿瘤异种移植体，而对被处理小鼠的体重无明显影响。

图3A-B显示了与某些半合成噢哢有关的作用的图像和图。(A)图像说明半合成噢哢4a抑制了微管蛋白的聚合。用300nM的4a处理PC-3、LS174T和HEK293T细胞。4a处理6小时后，细胞形态发生了变化。(B)图说明半合成噢哢4a对细胞周期进展的作用。

图4A-E显示了半合成噢哢4a对微管结构和微管蛋白聚合的作用的图像和图。(A-C)图像显示，用4a处理抑制了PC-3细胞中的微管结构。红色免疫荧光：α-微管蛋白；蓝色：DAPI。(D)图像显示4a降低了HEK193T细胞中的微管蛋白聚合。(E)图显示4a(5μM)在体外抑制微管蛋白的聚合。秋水仙素(5pM)用作阳性对照。

图5A-F显示了提供关于半合成噢哢4a的结构及其结合潜力的信息的图像。(A)图显示了4a的化学结构。(B)图显示了4a与αβ-微管蛋白二聚体(蓝绿色表示β，绿色表示α)界面中的秋水仙素结合位点的结合。(C-D)近摄图显示了4a(灰色短棒)和微管蛋白(洋红色和绿色带状表示)相互作用的环境。氢键由黑色虚线表示。(E)图像显示秋水仙素的结构。(F)图像显示4a(灰色短棒)和秋水仙素(黄色线)在秋水仙素结合位点的叠加。

图6A-G显示了半合成噢哢4a及其类似物4r在斑马鱼模型中抑制Myc诱导的T-ALL的作用的图像和图。(A-C)图像显示了第0天使用(A)DMSO、(B)4a和(C)4r处理的斑马鱼。(D)图像为DMSO处理斑马鱼5天后，表明在用DMSO处理的对照鱼中Myc诱导的T-ALL被GFP标记的胸腺淋巴瘤发育成T-ALL所证明。(E)图像为4a处理斑马鱼5天后，表明半合成噢哢阻止了T-ALL的进展。(F)图像为4r处理斑马鱼5天后，表明半合成噢哢阻止了T-ALL的进展。(G)图显示了DMSO和4r处理的斑马鱼中，白血病负担的百分比变化。

图7A-D显示了使用半合成噢哢4a为模型在抑制癌细胞增殖中本公开的半合成噢哢的潜在机制的图和图像。(A)图显示了NCI60筛选分析。将细胞系分成两组：敏感组和耐受组。分析两组中的蛋白质水平。由CCNA2基因编码的细胞周期蛋白(Cyclin)A2的表达与4a的反应有显著相关性。(B)图像显示4a通过降低酪氨酸15的磷酸化来诱导Cdc2(CDK1)的活化。(C)图显示4a与CDK抑制剂RO3306对LS174T结肠癌和PC3***癌细胞的增殖有协同作用。(D)图像说明了4a敏感性和耐受性的机制：4a抑制微管蛋白的聚合和细胞周期的进展；癌细胞可能会通过激活CDK而形成耐受性或反馈拯救(feedback rescue)机制。例如，4a诱导的应激可以激活Chkl，进而抑制Weel并激活cdc25，导致Y15位点CDK1磷酸化的减少。

虽然本公开容易有多种修改和替代形式，但其

具体实施方式

已在图中以实施例的方式示出，并在下文中详细描述。然而，应当理解的是，对具体实施方式的描述并不是为了限制公开涵盖由所附权利要求所限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。任何与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中，包括下面所述的方法和材料。

按照专利法的长期惯例，本申请(包括权利要求书)中使用的术语“一个”、“一种”和“所述”指的是“一个或多个”、“一种或多种”。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个细胞，以此类推。

术语“包含”、“包括”和“具有”意在包容，并意味着可以有所列举要素以外的附加要素。

除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分数量、属性如反应条件等的数字都应理解为在所有情况下都用术语“约”来修饰。因此，除非有相反的指示，本说明书和权利要求书中规定的数字参数是近似值，可以根据本公开主题所寻求获得的所需属性而变化。

当指质量、重量、时间、体积、浓度、百分比或类似的值或量时，如本文所使用的术语“约”，是指在一些实施方式中具体的量有±50％的变化、在一些实施方式中具体的量有±40％的变化、在一些实施方式中具体的量有±30％的变化、在一些实施方式中具体的量有±20％的变化、在一些实施方式中具体的量有±10％的变化、在一些实施方式中具体的量有±5％的变化、在一些实施方式中具体的量有±1％的变化、在一些实施方式中具体的量有±0.5％的变化、在一些实施方式中具体的量有±0.1％的变化，因为这种变化适合于使用所公开的方法。

如本文所使用的，范围可以表示为从一个特定数值的近似值，和/或到另一个特定数值的近似值。还可以理解的是，本文公开了许多值，并且本文除了公开各个数值本身之外，也公开了该特定数值的近似值。例如，如果公开了数值“10”，那么也公开了“约10”，即“10”的近似值。还可以理解为，也公开了两个特定单位之间的各个单位。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。

如本文所使用的，术语“半合成”指的是噢哢带有在噢哢天然产品中发现的骨架以及在噢哢天然产品中未发现的官能团和/或附加环。

本文所用的方法或工艺步骤的所有组合可按任何顺序进行，除非被提及组合的上下文中另有相反的规定或明确相反的暗示。

具体实施方式

本文件中阐述了本公开主题的一个或多个实施方式的细节。对本文件中描述的实施方式以及其他实施方式的修改，对本领域普通技术人员在研究了本文提供的信息之后，将是显而易见的。本文件中提供的信息，特别是所述的实例性实施方式的具体细节，主要是为了清楚地理解，而没有任何不必要的限制。在发生冲突的情况下，以本文说明书(包括定义)为准。

本公开的主题涉及半合成噢哢，或其药学上可接受的盐或组合物。在一些实施方式中，半合成噢哢包括根据式(I)所示的化合物，其药学上可接受的盐，或其药物组合物：

R¹包括但不限于H、烷基氰基(例如C₁-C₈-CN基团)、被一个或多个卤素取代的烷基苯基(例如C₁-C₈-Ph-Xn。其中Ph是苯基基团，X代表卤素如F、Cl、Br或I，n代表1-4的整数，优选1、2或3)，或其组合。R²包括但不限于芳香基(如苯基、萘基等)，或杂环如杂芳基。

包括根据式(I)的不同R¹基团的多个实施方式的实例包括但不限于：

R¹＝H

R¹＝烷基氰基

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基)

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基

R¹＝卤代烷基苯基

当R²是芳香基时，芳香基可以是未被取代的或被取代的。合适的取代基包括但不限于卤素(例如F、Cl、Br或I中的一个或多个)、烷基(例如C₁-C₈)、烷氧基(例如OC₁-C₈中的一个或多个)、氨基(例如烷基氨基或二烷基氨基(dialkylamino)基团)、杂环，或其任意组合。例如，在一些实施方式中，本文公开的半合成噢哢包括式(II)所示的化合物，其药学上可接受的盐，或其药物组合物：

在一个实施方式中，芳香基的杂环取代基是含氮环。在另一个实施方式中，含氮环包括氮原子和至少一个其他非碳原子，例如但不限于氮、氧、硫或其组合。在另一个实施方式中，杂环是单环或多环的，并且包括4-10元环。合适的单环杂环包括但不限于吡啶基、哒嗪基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基，或其组合。合适的多环杂环包括但不限于融合环，如异喹啉基、喹啉基、吲哚基；螺环(spirocyclicring)；或其组合。此外或可选地，杂环可以是未被取代的或被取代的，例如用O、OH、卤素(例如F、Cl、Br或I中的一个或多个)、烷基(例如C₁-C₈)、烷氧基基团(例如OC₁-C₈中的一个或多个)、氨基基团(例如烷基氨基或二烷基氨基基团)、羧基，或其任意组合中的一个或多个取代。

包括根据式(II)的不同R²基团的多个实施方式的实例包括但不限于：

R²＝吡咯烷基取代的芳香基

R²＝吗啉基取代的芳香基

R²＝硫吗啉基取代的芳香基

包括不同的非杂环取代的芳香R²基团的多个实施方式的实例包括但不限于：

其中R²是杂环，本文公开的半合成噢哢包括例如式(III)所示的化合物，其药学上可接受的盐，或其药物组合物：

在一个实施方式中，所述杂环是含氮环。在另一个实施方式中，所述含氮环包括氮原子和至少一个其他非碳原子，例如但不限于氮、氧、硫或其组合。在另一个实施方式中，所述杂环是单环或多环的，并且包括4-10元环。合适的单环杂环包括但不限于吡啶基、哒嗪基、吡咯烷基、吗啉基、硫吗啉基，或其组合。合适的多环杂环包括但不限于融合环，如异喹啉基、喹啉基、吲哚基；螺环；或其组合。此外或可选地，所述杂环可以是未被取代的或被取代的，例如用O、OH、卤素(例如F、Cl、Br或I中的一个或多个)、烷基(例如C₁-C₈)、烷氧基基团(例如O C₁-C₈中的一个或多个)、氨基基团(例如烷基氨基或二烷基氨基基团)、羧基，或其任意组合中的一个或多个取代。

包括根据式(III)的不同R²基团的多个实施方式的实例包括但不限于：

R²＝吡啶基

R²＝吡啶基

R²＝吡啶基

R²＝异喹啉基

R²＝喹啉基

R²＝喹啉基

R²＝烷氧基取代的喹啉基

R²＝烷氧基取代的喹啉基

R²＝烷氧基取代的喹啉基

R²＝烷基取代的吲哚基

R²＝烷基取代的吲哚基

在一些实施方式中，本文还提供了使用本文公开的半合成噢哢的方法。在一个实施方式中，所述方法包括向受试者施用本文公开的半合成噢哢化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物中的一种或多种。在另一个实施方式中，包括施用药学有效量的本文所公开的半合成噢哢化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物，以治疗所需的受试者。在另一个实施方式中，药学有效量的半合成噢哢化合物抑制癌细胞生长和/或治疗癌症。因此，在一些实施方式中，受试者包括患有癌症的患者。

虽然本公开的化合物可能不需要添加剂就可以给药，但在一些实施方式中，优选将所述化合物作为药物组合物。根据另一个方面，本公开提供了药物组合物，所述组合物包含式(I)所示的半合成噢哢化合物或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物的化合物或混合物，以及一种或多种药学上可接受的添加剂。合适的药学上可接受的添加剂包括但不限于药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选的一种或多种其它治疗成分。一种或多种添加剂必须是“可接受的”，即与制剂的其它成分相容且对接受者无害。术语“药学上可接受的载体”包括载剂和稀释剂。

在一些实施方式中，本公开的化合物和/或组合物对于治疗作为患者的动物，特别是包括人类在内的哺乳动物是有用的。因此，患有诸如癌症等增殖性疾病的人类和其他动物，特别是哺乳动物，可以通过向患者单独施用有效量的本公开的半合成噢哢或其药学上可接受的盐、任选地药学上可接受的添加剂来治疗，或可以与其他已知的药剂组合来治疗。根据本公开的治疗也可以通过将本公开的化合物和/或组合物与其它常规癌症疗法一起施用，所述疗法如放射治疗或手术或施用其它抗癌剂。在一些实施方式中，半合成噢哢，或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的组合物，以丝状的微管蛋白支架为靶点。因此，在一些实施方式中，这种化合物对于治疗包括结直肠癌和***癌、白血病、乳腺癌、肺癌在内的多种癌症是有用的。

本公开的主题由以下具体但非限制性的实施例进一步说明。以下实施例可包括在与本公开的主题有关的开发和实验过程中，在不同时间收集的具有代表性的数据的数据汇编。本领域的技术人员仅仅使用常规实验将认识到或能够确定，与本文所述的具体物质和方法的众多等价变化。

实施例

在本实施例之前，某些噢哢是已知的，但是由于它们效力有限并且生物、细胞靶点不确定，因此不被认为是实用的抗肿瘤剂。特别是，已发表的工作导致了具有不同水平的抗肿瘤活性的半合成噢哢：具有2-(香豆素-4-基)亚甲基和2-(呋喃-2-基)亚甲基的苯并呋喃-3(2//)-酮对人类白血病K562细胞具有活性；具有2-(哌嗪-l-基)亚甲基的苯并呋喃-3(2//)-酮对多种实体瘤细胞系具有低微摩尔范围的IC50值；具有2-(吲哚-3-基)亚甲基的苯并呋喃-3(2//)-酮对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系的细胞增殖具有抑制作用。然而，这些杂芳基取代的噢哢之间的相对效力，以及在这些情况下的一个或多个特定的生物靶点仍然是未知的。

考虑到这一点，进行了涉及许多天然存在的噢哢中发现的C-6羟基和C-2亚苄基(benzylidene)亚基的修饰的结构-活性(SAR)研究。参见下面的方案1。“C-2亚苄基亚基”也称为“C-2(苯基)亚甲基亚基”，后一种命名方式不仅用于描述取代的苯基体系(如4-氯苯基)亚甲基，也用于描述杂环体系(如(4-吡啶基)亚甲基)。

方案1：显示C-2位亚苄基亚基的噢哢结构骨架和编号系统

在开发本公开的半合成噢哢的过程中，制备并测试了几种半合成噢哢。文献表明，靶向微管动力学的微管抑制剂有两种类型：稳定剂如紫杉醇，和去稳定剂，如长春花生物碱和秋水仙素。这些药剂在三个已经良好定性的结合位点上与微管蛋白亚基结合：紫杉醇结合位点、长春花(Vinca)结合位点和秋水仙素结合位点。靶向紫杉醇结合位点和长春花结合位点的药剂在癌症治疗中得到了广泛的应用；然而，靶向秋水仙素结合位点的药剂尚未在临床实践中发挥作用，尽管目前有几个候选药剂在进行临床试验。本文报道的半合成噢哢为开发癌症治疗的秋水仙素靶向微管抑制剂提供了一种新的药效模型。

通过反复的合成和测试，确定了在结肠LS174T和***癌PC-3细胞增殖试验中具有良好体外抑制活性的噢哢药效模型中的C-2杂芳基亚甲基亚基。特别是，分别具有2-喹啉基亚甲基(quinolylmethylene)、(8-甲氧基-2-喹啉基)亚甲基和(5-甲氧基-/V-乙基-3-吲哚基)亚甲基的杂芳基取代的亚甲基噢哢4(图1A)被鉴定为10μM浓度下最有效的类似物(表1)。

表1：带有C-2杂环取代的苯基亚甲基基团的噢哢2或带有C-2杂芳基亚甲基基团的噢哢3。

但有一个例外，在其他位点对这些杂芳基取代的亚甲基噢哢4进行修饰，或者用杂环取代的苯基基团来取代杂芳基亚甲基基团，未能产生相对于三个杂芳基亚甲基取代的噢哢3d、3e、3g和3(1)而言具有改善活性的噢哢(表1)。在这些噢哢3中，根据ADME计算，吲哚基取代的噢哢似乎是最有希望的候选物，并且进行了额外的SAR研究，以确定比噢哢更有效的类似物。虽然大部分的SAR努力都集中在吲哚基取代的系列上，但也研究了其他杂芳基。

将噢哢3中的C-6羟基与多种烷基溴化物进行烷基化，可得到杂芳基取代的噢哢4(图1A)。对噢哢4中C-6烷氧基基团的修饰和C-2杂芳基亚甲基亚基的修饰的SAR研究显示，在C-6的氰基甲氧基或2，6-二氯苄氧基基团，与下列C-2杂芳基亚甲基亚基中的一种具有协同效应：A-甲基或N-乙基-3-吲哚基亚甲基：5-甲氧基-A-甲基或5-甲氧基-A-乙基-3-吲哚基亚甲基；以及4-吡啶基亚甲基基团。这些研究中最相关的部分总结在表2中。

表2：涉及噢哢4中C-6烷氧基基团的修饰与C-2杂芳基取代亚甲基亚基的修饰的SAR研究，并使用LS174T细胞增殖试验作为读数对象。

在300nM浓度下，有两个候选物显示出显著的抑制作用(>90％)：(Z)-2-((2-((1-乙基-5-甲氧基-l//-吲哚-3-基)亚甲基)-3-氧代-2.3-二氢苯并呋喃-6-基)氧基)乙腈(4a)和(Z)-6-((2,6-二氯苄基)氧基)-2-(吡啶-4-基亚甲基)苯并呋喃-3(2//)-酮(4r)(图1B)。除氰基甲氧基(cyanomethoxy)和2,6-二氯苄氧基以外的C-6烷氧基基团的活性比4a和4r低(表2)。这些具有其他位置取代基(例如4i和4m中C-7的甲基基团)的被杂芳基取代的噢哢4的修饰也导致化合物的活性降低。

在多种癌细胞系中测定噢哢4a和4r具有抑制作用，所述癌细胞系包括***癌PC-3、结直肠癌LS174T、肺癌A549、乳腺癌MCF-7和卵巢癌Ovcar-8和NCI/ADR-RES(表1-3，图2A)。

表3：NCI60细胞系中4a的IC50。

表4：白血病细胞系中4a和4r的IC50。

在为期五天的治疗中，噢哢4a和4r显示出在体外对这些癌细胞系有强效剂量依赖性抑制，IC50值在50-300nM范围内(图2A)。最重要的是，用***癌PC-3异种移植体在免疫缺陷裸鼠中评估了噢哢4a的体内肿瘤抑制作用。与载剂相比，以10mg/kg/天施用噢哢4a显示出显著的抑制肿瘤生长的作用(图2B)。噢哢4a抑制了肿瘤，并且没有明显的总体毒性，由小鼠体重发生最小的变化所反映(图2B)。综上所述，SAR研究确定了具有特定C-2杂芳基亚甲基和C-6烷氧基基团的半合成噢哢4在纳摩尔范围内，在细胞增殖研究中具有良好的体外活性，在体内***PC-3异种移植体研究中具有良好的减少肿瘤体积的作用，并且由于体内研究期间体重损失最小而具有最小的总体毒性。

细胞形态学和体外微管蛋白聚合研究表明，噢哢4a(图1B)通过抑制微管蛋白聚合来抑制细胞增殖(图3A-4E)。NCI-60筛选证实，4a的机制与其他微管蛋白抑制剂的机制相似。计算对接(Computational docking)研究表明，噢哢4a与秋水仙素结合位点(CBS)结合(图5A-F)。先前的晶体学研究表明，在经聚合的微管中，游离的微管蛋白二聚体从“直线”排列状态转变为“曲线”状态。在这些构象变化过程中，β-微管蛋白的T7环转化为CBS。秋水仙素与CBS结合，阻止T7环向CBS翻转，从而抑制微管蛋白的聚合。重要的是，计算模型表明，噢哢4a与T7环具有很强的相互作用(图5F)，这支持了噢哢4a具有类似于秋水仙素作用机制的假说。这些结果也表明，在4a中引入其他化学部分以占据秋水仙素C环在CBS中结合的位置，可能会提高药效。

除了总体形态的变化和计算研究之外，还在NCI-60细胞系和其他多种细胞系中测试了噢哢4a的功效，在这些细胞系中，噢哢4a表现出了广谱的抗癌活性(图2A，表1-4)。值得注意的是，NCI/ADR-RES细胞系由于表达了P-糖蛋白，对阿霉素和许多其它癌症化疗药物具有耐受性。结果(图2A，表3)表明，噢哢la显示出对表达多药耐药细胞系的细胞具有强大的细胞毒性，而不大可能是P-糖蛋白的底物。

在裸鼠中使用可显著抑制PC-3肿瘤异种移植体剂量的噢哢4a，并没有显示出普遍的毒性(图2B)。噢哢4a和4r也在斑马鱼模型中进行了测试，在斑马鱼身上也没有观察到总体毒性，但在体内观察到对Myc诱导的T-ALL有显著抑制(图6A-G)。更具体地说，DMSO显示白血病负担增加25.94％，+/-13.87％，而噢哢4a显示白血病负担减少45.58％，+/-10.67％。组间差异具有显著性，在p＝0.00l 1。

微管抑制剂是高效的抗癌药剂，广泛应用于癌症化疗中。然而，大多数患者在短时间内就会产生耐受性。有鉴于此，分析了这些60个细胞系的蛋白表达数据库，并且发现细胞周期蛋白A2水平与4a敏感性显著相关(图7A)。还注意到，4a处理减少了CDK1的Y15磷酸化。增加细胞周期蛋白A2或去磷酸化CDK1的Y15，导致细胞周期蛋白A2/CDK1活化，这是G2/M转换所必需的(图7B)。此外，发现CDK1抑制剂RO3306增强了4a抑制癌细胞增殖的效果(图7C)。这些结果表明，4a处理抑制了有丝***，并且细胞可能试图通过增强细胞周期蛋白a2/CDKl的活性来挽救细胞周期的进展(图7D)。这些结果还表明，高水平的细胞周期蛋白A2或高活性的CDK1可能导致4a耐受性。

材料和方法

化学品

除非另有说明或按文献程序合成，化学品购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯)或飞世尔科技公司(Fisher Scientific)(宾夕法尼亚州匹兹堡)。除非另有说明，否则使用商业供应商的溶剂，而不需要进一步纯化。核磁共振谱在瓦里安(Varian)仪器上测定(¹H，400MHz；¹³C，100Mz)。质谱用安捷伦(Agilent)1100(大气压化学电离)仪器获得。熔点在开放毛细管中用布奇(Buchi)B-535仪器测定，并且未校正。除非另有说明，化合物在制备层默克(Merck)硅胶F254上进行色谱分析。

(2Z)-6-羟基-2-(4-吡咯烷基-1-基亚苄基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(2a)。

黄色晶体(83％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.83-2.07(m,4H),3.26-3.32(m,4H),6.61(d,J＝8.9Hz,2H),6.66-6.72(m,2H),6.77(d,J＝1.9Hz,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.9Hz,2H),11ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ24.95,47.24,98.42,111.97,112.58,112.94,113.69,118.62,125.39,133.16,144.73,148.49,165.58,166.87,180.64ppm；MS(ACPI)m/z 308.1(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(4-吗啉基-4-基亚苄基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(2b)。

黄色晶体(78％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.15-3.30(m,4H),3.63-3.80(m,4H),6.70(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.73(s,1H),6.78(d,J＝1.9Hz,1H),7.02(d,J＝9Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝9Hz,2H),11.09ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ47.04,65.89,98.52,111.66,112.78,113.35,114.27,121.93,125.64,132.71,145.65,151.64,165.98,167.29,181.02ppm；MS(ACPI)m/z 324.1(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)亚苄基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮盐酸盐/酯(2c)。

黄色晶体(77％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.83(s,3H),3.04-3.24(m,4H),3.4-3.6(m,2H),3.9-4.2(m,2H),6.72(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.75(s,1H),6.8(d,J＝2Hz,1H),7.11(d,J＝9.2Hz,2H),7.60(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝9.2Hz,2H),10.2(s,1H),11.16ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ41.9,44.3,51.7,98.5,111.2,112.9,113.2,115.2,122.8,125.7,132.7,145.9,150.1,166.3,167.4,181.1ppm；MS(ACPI)m/z 337.1(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(4-硫吗啉基-4-基亚苄基)]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(2d)。

黄色晶体(84％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ2.58-2.68(m,4H),3.56-3.86(m,4H),6.7(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),6.72(s,1H),6.77(d,J＝1.9Hz,1H),7(d,J＝9Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,1H),7.81(d,J＝9Hz,2H),11.05ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ24.82,49.69,98.44,111.76,112.72,113.39,114.64,120.9,125.56,133.02,145.47,150.15,165.87,167.16,180.89ppm；MS(ACPI)m/z340.1(MH⁺,100)。

(2Z)-2-[2-氯-4-(二甲基氨基)亚苄基]-6-羟基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(2e)。

黄色晶体(83％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.01(s,6H),6.71(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.77(d,J＝1.9Hz,1H),6.79-6.84(m,2H),6.95(s,1H),7.6(d,J＝8.4Hz,1H),8.16(d,J＝9.7Hz,1H),11.1ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ39.59,98.52,106.31,111.27,111.86,112.86,113.14,115.87,125.69,132.51,136.25,145.7,151.44,166.02,167.2,180.77ppm；MS(ACPI)m/z 316.2(MH⁺,100)。

(2Z)-2-[4-(二乙基氨基)-2-甲氧基亚苄基]-6-羟基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(2f)。

黄色晶体(75％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.15(t,J＝7Hz,7H),3.44(q,J＝7Hz,4H),3.88(s,3H),6.22(d,J＝2.4Hz,1H),6.43(dd,J＝9,2.4Hz,1H),6.68(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.75(d,J＝2Hz,1H),7.05(s,1H),7.56(d,J＝8.4Hz,1H),8.03(d,J＝9Hz,1H),10.93ppm(s,1H)；¹³CNMR(100MHz,DMSO-d₆)δ12.55,43.96,55.47,93.64,98.34,104.78,106.17,107.43,112.46,113.8,125.26,132.59,144.45,150.55,160.29,165.33,166.56,180.43ppm；MS(ACPI)m/z 340.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(吡啶基-2-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3a)。

黄色晶体(93％产率)；mp 246-248℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.68(s,1H),6.74(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.81(d,J＝2Hz,1H),7.35-7.46(m,1H),7.66(d,J＝8.5Hz,1H),7.89-7.99(m,1H),8.15(dd,J＝8,1Hz,1H),8.64-8.74(m,1H),11.35ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ98.55,109.54,112.25,113.08,123.12,125.63,125.83,136.55,148.58,149.75,151.14,166.75,168.16,181.29ppm；MS(ACPI)m/z240.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(吡啶基-3-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3b)。

黄色晶体(83％产率)；mp 255-257℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.72(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.81(d,J＝2Hz,1H),6.83(s,1H),7.51(dd,J＝8,4.8Hz,1H),7.63(d,J＝8.5Hz,1H),8.34(dt,J＝8,2Hz,1H),8.57(dd,J＝4.8,2Hz,1H),9.04(d,J＝2Hz,1H),11.3ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ98.84,104.69,112.14,113.54,125.8,126.15,130.27,141.63,145.08,146.94,149.38,167.29,168.06,180.92ppm；MS(ACPI)m/z 240.0(MH⁺,100)。

2Z)-6-羟基-2-(吡啶基-4-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3c)。

黄色晶体(91％产率)；mp 300-302℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.73(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.76(s,1H),6.82(d,J＝2Hz,1H),7.65(d,J＝8.5Hz,1H),7.79-7.88(m,2H),8.42-8.82(m,2H),11.37ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ98.84,106.96,112.27,113.42,124.37,126.26,139.29,149.8,150.21,167.16,168.27,181.26ppm；MS(ACPI)m/z240.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(异喹啉基-1-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3d)。

黄色晶体(78％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.71-6.76(m,2H),7.43(s,1H),7.69(d,J＝8.3Hz,1H),7.7-7.77(m,1H),7.79-7.85(m,1H),7.87(d,J＝5.6Hz,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),8.35(d,J＝8.9Hz,1H),8.69(d,J＝5.6Hz,1H),11.3ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ98.78,105.12,112.39,113.23,120.99,125,126.42,127.44,128.25,130.59,135.8,142.65,149.81,151.34,167.15,169.05,182.01ppm；MS(ACPI)m/z 290.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(喹啉基-2-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3e)。

黄色晶体(72％产率)；mp 249-251℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.75(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.78-6.9(m,2H),7.56-7.73(m,2H),7.75-7.88(m,1H),7.93-8.13(m,2H),8.29(d,J＝8.7Hz,1H),8.48(d,J＝8.7Hz,1H),11.39ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ98.84,110,112.29,113.41,122.62,126.29,126.88,127.47,127.79,129.08,130.11,136.72,147.82,149.55,151.88,167.13,168.36,181.53ppm；MS(ACPI)m/z 290.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(6-甲氧基喹啉基-2-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3f)。

黄色晶体(70％产率)；mp 269-271℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.91(s,3H),6.74(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.77(s,1H),6.83(d,J＝2Hz,1H),7.34-7.48(m,2H),7.65(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝9Hz,1H),8.24(d,J＝8.7Hz,1H),8.35ppm(d,J＝8.7Hz,1H)；¹³CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ55.43,98.57,105.61,110.07,112.12,113.27,122.35,122.71,125.84,128.02,130.45,135.1,143.82,148.85,149.1,158.02,167.07,168.12,181.16ppm；MS(ACPI)m/z 320.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(8-甲氧基喹啉基-2-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3g)。

黄色晶体(68％产率)；mp 250-252℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ4(s,3H),6.75(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.81(s,1H),6.85(d,J＝2Hz,1H),7.09-7.30(m,1H),7.45-7.62(m,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,1H),8.3(d,J＝8.7Hz,1H),8.42(d,J＝8.7Hz,1H),11.38ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ55.75,98.59,109.12,110.09,112.2,113.21,119.05,122.67,125.9,127.71,127.77,136.19,139.81,149.11,150.13,155.13,166.87,168.12,181.22ppm；MS(ACPI)m/z 320.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(喹啉基-4-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3h)。

黄色晶体(64％产率)；mp 278-280℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.76(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.81(d,J＝2Hz,1H),7.39(s,1H),7.61-7.75(m,2H),7.78-7.91(m,1H),8.09(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),8.15(d,J＝4.6Hz,1H),8.34(dd,J＝8.5,1.4Hz,1H),9.03(d,J＝4.6Hz,1H),11.4ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ98.54,102.42,112.17,113.13,121.61,123.19,125.5,125.84,126.86,129.12,129.49,135.85,147.94,149.72,150.05,166.79,168.06,180.62ppm；MS(ACPI)m/z 290.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-(1H-吲哚(indol)-3-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3i)。

黄色晶体(55％产率)；mp 280-282℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ6.72(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.85(d,J＝2Hz,1H),7.11-7.28(m,3H),7.51(d,J＝7.8Hz,1H),7.62(d,J＝8.5Hz,1H),8.01(d,J＝7.7Hz,1H),8.21(d,J＝2.8Hz,1H),10.99(s,1H),11.99ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ98.75,105.36,108.49,112.4,112.76,114.45,118.98,120.86,122.74,125.52,126.9,131.31,136.43,145.43,165.79,166.9,180.52ppm；MS(ACPI)m/z 278.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3j)。

黄色晶体(78％产率)；mp 272-274℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.9(s,3H),6.72(d,J＝8.4Hz,1H),6.83(s,1H),7.13-7.32(m,3H),7.51(d,J＝8Hz,1H),7.6(d,J＝8.1Hz,1H),7.99(d,J＝7.8Hz,1H),8.19(s,1H),11.02ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ33.13,98.48,104.67,107.3,110.54,112.6,114.26,118.96,120.96,122.64,125.41,127.2,134.74,136.76,145.12,165.57,166.65,180.17ppm；MS(ACPI)m/z 292.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3k)。

黄色晶体(82％产率)；mp 301-303℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.84(s,3H),3.86(s,3H),6.71(dd,J＝8.5,2Hz,1H),6.82(d,J＝2Hz,1H),6.88(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),7.21(s,1H),7.39(d,J＝8.8Hz,1H),7.53-7.64(m,2H),8.12(s,1H),11.03ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ33.28,55.45,98.41,100.92,105.32,107.19,111.38,112.54,112.73,114.33,125.32,127.99,131.82,134.99,144.74,155.05,165.48,166.48,180.07ppm；MS(ACPI)m/z 322.0(MH⁺,100)。

(2Z)-2-[(1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-6-羟基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3l)。

黄色晶体(77％产率)；mp 265-267℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)；δ1.39(t,J＝7.2Hz,3H),3.85(s,3H),4.27(q,J＝7.2Hz,2H),6.72(dd,J＝8.4,2Hz,1H),6.83(d,J＝2Hz,1H),6.87(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),7.23(s,1H),7.42(d,J＝8.8Hz,1H),7.56-7.64(m,2H),8.18(s,1H),10.98ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)；δ15.38,41.3,55.46,98.49,101.1,105.37,107.42,111.41,112.56,112.76,114.38,125.36,128.22,130.74,133.5,144.76,155.02,165.47,166.52,180.12ppm；MS(ACPI)m/z 336.0(MH⁺,100)。

(2Z)-2-[(1-乙基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-6-羟基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3m)。

黄色晶体(79％产率)；mp 278-280℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.39(d,J＝7.2Hz,3H),4.3(q,J＝7.2Hz,2H),6.74(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),6.87(d,J＝2.1Hz,1H),7.11-7.35(m,3H),7.52(d,J＝8Hz,1H),7.63(d,J＝8.4Hz,1H),7.99(d,J＝7.7Hz,1H),8.25(s,1H),11.02ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ15.29,41.14,98.57,104.65,107.54,110.54,112.62,114.29,119.13,120.93,122.62,125.4,127.42,133.22,135.71,145.16,165.61,166.79,180.22ppm；MS(ACPI)m/z 306.1(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-7-甲基-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3n)。

黄色晶体(89％产率)；mp 293-295℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ2.29(s,3H),3.91(s,3H),6.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.13(s,1H),7.18-7.32(m,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.1Hz,1H),8.03(d,J＝7.9Hz,1H),8.07(s,1H),10.83ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆)δ7.89,33.15,104.34,107.5,107.52,110.51,111.6,113.86,119.08,120.84,122.06,122.61,127.07,134.58,136.79,145.24,163.11,164.81,180.77ppm；MS(ACPI)m/z 306.1(MH⁺,100)。

(2Z)-6-羟基-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-7-甲基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3o)。

黄色晶体(83％产率)；mp 297-299℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ2.28(s,3H),3.84(s,3H),3.88(s,3H),6.75(d,J＝8.3Hz,1H),6.88(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.19(s,1H),7.31-7.49(m,2H),7.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.02(s,1H),10.8ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,DMSO-d₆)δ7.89,33.33,55.53,100.96,104.89,107.29,107.5,111.36,111.55,112.68,113.97,122,127.98,131.8,134.72,144.97,155.02,162.98,164.71,180.69ppm；MS(ACPI)m/z 336.1(MH⁺,100)。

(Z)-2-((2-((1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基)-3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈(4a)。

向670mg(2mmol)(2Z)-2-[(1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-6-羟基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(3l)的10mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入830mg(6mmol，3当量(eq))无水碳酸钾。将该混合物加热至60℃，并加入0.152mL(2.4mmol，1.2eq)的氯乙腈。将该混合物在60℃下再搅拌8小时，冷却，并倒入100mL的0.1N硫酸溶液中。过滤收集沉淀物，用水洗涤，干燥并从N,N-二甲基甲酰胺-甲醇中重新结晶，得到487mg(65％)4a的黄色晶体：mp230-232℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.44(d,J＝7.2Hz,3H),3.86(s,3H),4.33(q,J＝7.2Hz,2H),5.39(s,2H),6.9(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.97(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.29(d,J＝2.2Hz,1H),7.37(s,1H),7.51(d,J＝8.9Hz,1H),7.63(d,J＝2.4Hz,1H),7.77(d,J＝8.6Hz,1H),8.23ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ14.67,40.97,53.89,55.34,98.17,101.45,106.18,107.17,110.99,111.68,112.46,115.45,116.87,124.84,127.89,130.8,133.46,144.2,154.96,162.6,165.49,179.58ppm；MS(ACPI)m/z 375.2(MH⁺,100)。

5-苄氧基-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛(carboxaldehyde)。

在氩气环境下，向37mg(0.14mmol,1eq)5-苄氧基-1H-吲哚-3-甲醛(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)的0.3mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入5.7mg(0.196mmol,1.4eq)的60％氢化钠的矿物油。将混合物搅拌40min，并滴加17μL(0.21mmol,1.5eq)的碘化乙烷。将该反应混合物在25℃下搅拌12h。将产物用二氯甲烷稀释，先后用盐水和水洗涤，干燥，在硅胶(silica gusing)上用1∶1乙酸乙酯-己烷进行层析，得到31mg(76％)的5-苄氧基-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛：¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.96(s,1H),7.92(d,J＝2.5Hz,1H),7.69(s,1H),7.54-7.47(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.35-7.3(m,1H),7.26(d,J＝5Hz,1H),7.05(dd,J＝2.5,8.9Hz,1H),5.15(s,2H),4.2(q,J＝7.3Hz,2H),1.54(t,J＝7.3Hz,3H)。¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ184.36,155.81,137.49,137.21,132.07,128.52,127.88,126.24,117.95,114.97,110.79,104.80,70.62,42.04,15.09。

5-(叔丁基二甲基硅氧基)-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛。

在-78℃的氩气环境下，向14.5mg(0.05mmol,1eq)的5-苄氧基-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛、22mg(0.3mmol,3eq)五甲基苯和0.4mL无水DMF(0.4mL)中，滴加300μL(0.3mmol,6eq)三氯化硼的1M二氯甲烷溶液。搅拌1h后，用4mL饱和氯化铵水溶液淬灭反应。将该混合物用二氯甲烷萃取。将有机溶液先后用盐水和水洗涤，干燥并浓缩，得到直接用于下一步反应的粗产物。向该粗产物中加入0.4mL 9mg(0.06mmol,1.2eq)叔丁基二甲基硅烷基氯(tert-butyldimethylsilyl chloride)和20.4mg(0.15mmol,3eq)咪唑的无水N,N-二甲基甲酰胺。将该混合物搅拌2h。所述产物用二氯甲烷萃取，先后用盐水溶液和水洗涤，并干燥。将产物在硅胶上用1∶1的乙酸乙酯-己烷进行层析，得到10mg(63％)的5-(叔丁基二甲基硅氧基)-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛：¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.94(s,1H),7.75(d,J＝2.3Hz,1H),7.68(s,1H),7.21(d,J＝8.8Hz,1H),6.87(dd,J＝2.4,8.8Hz,1H),4.18(q,J＝7.3Hz,2H),1.54(t,J＝7.3Hz,3H),1.01(s,9H),0.22(s,6H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl3)δ188.58,156.51,141.95,136.86,130.9,122.25,122.18,116.26,114.72,46.39,30.18,22.64,19.43,4.48。

2-((3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈。

向33.5μL(1.2eq)溴乙腈和60mg(0.4mmol,1eq)6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮(1)的1mL乙腈溶液中加入110mg(0.8mmol,2eq)无水碳酸钾。将混合物在25℃下搅拌过夜。产物在硅胶60上以1∶5至1∶1的乙酸乙酯-己烷洗脱梯度进行柱层析纯化，以提供45mg(60％)2-((3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.67(s,2H),4.86(s,2H),6.67(d,J＝2.2Hz,1H),6.73(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),7.65ppm(d,J＝8.6Hz,1H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ＝53.52,75.82,98.06,111.31,114.15,116.52,125.97,164.33,175.99,197.62ppm。

(Z)-2-((2-((1-乙基-5-羟基-1H-吲哚-3-基)亚甲基)-3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈(4b)。

向36mg(0.11mmol,1eq)5-(叔丁基二甲基硅氧基)-1-乙基-1H-吲哚-3-甲醛的2mL无水二氯甲烷溶液中加入30mg(0.16mmol,1.4eq)2-((3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈和366mg(3.6mmol,32eq)氧化铝(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)。将混合物在25℃下搅拌6小时，过滤并浓缩。残余物用824^L 1M(2.5eq)四(正丁基)氟化铵的四氢呋喃溶液在25℃下处理1小时。产物从约1:1的甲醇-二氯甲烷中重结晶，得到24mg(60％)黄色晶体的4b：mp 208-210℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.43(t,J＝7.2Hz,4H),4.29(q,J＝7.2Hz,2H),5.38(s,2H),6.8(dd,J＝8.8,2.2Hz,1H),6.96(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.11(s,1H),7.3(dd,J＝6.4,2.1Hz,2H),7.76(d,J＝8.5Hz,1H),8.17(s,1H),9.16ppm(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ15.35,41.35,54.05,98.26,103.37,106.73,106.76,111.45,112.11,112.83,116.19,117.02,125.35,128.45,134.08,144.17,152.8,162.79,165.73,179.84ppm。

叔丁基2-(3-甲酰基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)醋酸盐/酯。

在氩气环境下，向105mg(0.6mmol,1eq)5-甲氧基-1H-吲哚-3-甲醛(伊利诺斯州芝加哥的VWR公司)的1mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入32mg(0.8mmol,1.33eq)60％氢化钠的矿物油(60wt％)溶液。将混合物在0℃下搅拌40min。向该溶液中滴加104μL(0.7mmol,1.16eq)的叔丁基溴乙酸盐/酯(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司)。将混合物在25℃下搅拌12h，并用乙酸乙酯萃取该溶液。将合并的有机溶液先后用盐水和水洗涤，并干燥。产物在硅胶60上用1∶5和1∶2乙酸乙酯-己烷梯度洗脱进行柱层析纯化，获得119mg(69％)叔丁基2-(3-甲酰基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)醋酸盐/酯：mp 92-94℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.89(s,1H),8.20(s,1H),7.60(d,J＝2.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.9Hz,1H),6.93(dd,J＝2.5,8.9Hz,1H),5.14(s,2H),3.79(s,3H),1.42(s,9H)。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ184.76,167.30,155.96,141.74,132.46,125.19,117.34,113.31,111.84,102.70,82.01,55.37,48.36,27.68。

(Z)-2-(3-((6-(氰基甲氧基)-3-氧代苯并呋喃-2(3H)-亚基(ylidene))甲基)-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸(4c)。

向45mg(0.24mmol,1.2eq)2-(3-氧代-2,3-二氢苯并呋喃-6-基)氧)乙腈的3mL无水二氯甲烷溶液中加入58mg(0.2mmol,1eq)叔丁基2-(3-甲酰基-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸盐/酯和646mg(6.4mmol,32eq)氧化铝。将混合物在25℃下搅拌6h，过滤，浓缩，并从约(ca.)1∶4的甲醇-二氯甲烷中重结晶，得到纯的叔丁基(Z)-2-(3-((6-(氰基甲氧基)-3-氧代苯并呋喃-2(3H)-亚基)甲基)-5-甲氧基-1H-吲哚-1-基)乙酸盐/酯。将该产物在2mL甲酸中60℃回流2小时。将溶液浓缩，得到48mg60％)黄色晶体的4c：mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.85(s,3H),5.18(s,2H),5.38(s,2H),6.88(dd,J＝8.9,2.4Hz,1H),6.97(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.23(d,J＝2.1Hz,1H),7.37(s,1H),7.43(d,J＝8.9Hz,1H),7.63(d,J＝2.4Hz,1H),7.78(d,J＝8.5Hz,1H),8.22(s,1H),13.18ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ54.04,55.56,98.11,100.99,106.62,107.83,111.63,112.24,113.01,116.17,116.94,125.52,128.02,131.69,135.55,144.83,155.23,162.94,165.92,169.99,180.10ppm；MS(ACPI)m/z 391.2(MH⁺,100)。

噢哢4d-4q合成的一般方法。向2mmol噢哢3的10mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入830mg(6mmol)无水碳酸钾。将混合物加热至60℃，并加入2.4mmol的适当的苄基氯。混合物在60℃下搅拌8h，冷却，并倒入100mL 0.1N硫酸水溶液中。过滤收集沉淀物，用水洗涤，干燥，并且从N,N-二甲基甲酰胺-甲醇1∶1-1∶2中重结晶。

(2Z)-6-[(2-氟苄基)氧]-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4d)。

黄色晶体(76％产率)；mp 241-243℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.93(s,3H),5.34(s,2H),6.93(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.14-7.35(m,6H),7.39-7.72(m,4H),8.02(d,J＝7.8Hz,1H),8.15ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl3)δ33.47,64.31(d,J＝4.6Hz),97.42,105.95,108.57,109.8,112.12,115.52(d,J＝21.1Hz),116.62,119.17,121.28,123.01,124.44(d,J＝3.4Hz),125.55,127.87,129.61,129.64,130.18(d,J＝8.4Hz),134.01,136.96,146.01,160.43(d,J＝247.5Hz),165.36,167,181.75ppm；MS(ACPI)m/z 400.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯苄基)氧]-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4e)。

黄色晶体(69％产率)；mp 206-208℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.93(s,3H),5.35(s,2H),6.93(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.17-7.36(m,4H),7.38-7.49(m,2H),7.5-7.59(m,2H),7.6-7.73(m,2H),8.04(d,J＝7.7Hz,1H),8.21ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ33.53,67.78,97.54,106.03,108.61,109.92,112.24,116.72,119.18,121.36,123.08,125.56,127.24,127.96,128.82,129.51,129.64,132.74,133.67,134.17,137.01,146.08,165.37,167.04,181.78ppm；MS(ACPI)m/z 416.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氟苄基)氧]-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4f)。

黄色晶体(73％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ3.94(s,3H),5.31(s,2H),6.9(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.19-7.40(m,6H),7.54-7.61(m,2H),7.69(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(d,J＝7.8Hz,1H),8.21ppm(s,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ33.67,58.99,98.11,106.19,107.8,111.09,111.95(t,J＝18.7Hz),112.36(d,J＝24.2Hz),112.88,116.21,119.65,121.54,123.22,125.56,127.5,132.56(t,J＝10.2Hz),135.55,137.28,145.29,161.63(dd,J＝256.8,7.1Hz),165.48,166.82,180.58ppm；MS(ACPI)m/z418.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4g)。

黄色晶体(65％产率)；mp 247-249℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ3.9(s,3H),5.4(s,2H),6.84(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.95(d,J＝2.1Hz,1H),7.18-7.48(m,7H),7.75(d,J＝8.5Hz,1H),7.92(d,J＝7.7Hz,1H),7.97ppm(s,1H)；¹³C NMR(1010MHz,CDCl3)δ33.63,65.82,97.65,106.12,108.75,109.96,112.23,116.81,119.33,121.43,123.16,125.67,128.01,128.72,131,131.28,134.2,137.1,137.18,146.18,165.83,167.1,181.94ppm；MS(ACPI)m/z 450.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯-6-氟苄基)氧]-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4h)。

黄色晶体(76％产率)；mp 225-227℃；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.87(s,3H),5.28(d,J＝1.8Hz,2H),6.8(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.91(d,J＝2.1Hz,1H),7.03-7.13(m,1H),7.24-7.41(m,6H),7.72(d,J＝8.5Hz,1H),7.90(d,J＝7.6Hz,1H),7.94ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ33.59,61.83(d,J＝4.1Hz),97.63,106.05,108.73,109.94,112.17,114.57(d,J＝22.5Hz),116.79,119.3,121.41,121.61(d,J＝17.4Hz),123.14,125.62,125.82(d,J＝3.3Hz),128,131.31(d,J＝9.7Hz),134.18,136.74(d,J＝4.6Hz),137.09,146.16,162.12(d,J＝251.8Hz),165.64,167.07,181.89ppm；MS(ACPI)m/z 434.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-7-甲基-2-[(1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4i)。

黄色晶体(87％产率)；mp 232-234℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:2.25(s,3H),3.93(s,3H),5.40(s,2H),7.15-7.33(m,4H),7.46-7.62(m,4H),7.66(d,J＝8.5Hz,1H),8.05(d,J＝7.9Hz,1H),8.12ppm(s,1H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl3)δ8.16,33.57,66.25,105.45,107.75,108.88,109.85,110.91,116.61,119.22,121.23,122.6,123.01,127.89,128.62,130.73,131.71,134,136.96,137.05,146.24,163.15,164.54,182.64ppm；MS(ACPI)m/z 464.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯-4-氟苄基)氧]-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4j)。

黄色晶体(85％产率)；mp 184-186℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.85(s,3H),3.89(s,3H),5.3(s,2H),6.85-6.97(m,2H),7.20(d,J＝2.1Hz,1H),7.26-7.37(m,2H),7.45(d,J＝8.9Hz,1H),7.56(dd,J＝8.9,2.6Hz,1H),7.61(d,J＝2.4Hz,1H),7.65-7.75(m,2H),8.16ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ33.66,55.84,67.19,97.45,100.58,106.26,108.23,110.78,111.98,113.39,114.44(d,J＝21.1Hz),116.8,117.08(d,J＝24.9Hz),125.4,128.63,129.66(d,J＝3.6Hz),130.14(d,J＝9Hz),132.03,133.55(d,J＝10.5Hz),134.43,145.67,155.62,162.34(d,J＝250.5Hz),165.03,166.78,181.59ppm；MS(ACPI)m/z464.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯-6-氟苄基)氧]-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4k)。

黄色晶体(71％产率)；mp 200-202℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.85(s,3H),3.9(s,3H),5.33(d,J＝1.8Hz,2H),6.86-6.95(m,2H),7.26-7.4(m,3H),7.42-7.49(m,2H),7.51-7.6(m,1H),7.62(d,J＝2.4Hz,1H),7.69(d,J＝8.5Hz,1H),8.15ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ33.56,55.78,61.65(d,J＝4.2Hz),97.38,100.51,106.13,108.18,110.73,111.96,113.29,114.43(d,J＝22.6Hz),116.63,121.47(d,J＝17.2Hz),125.31,125.67(d,J＝3.4Hz),128.54,131.18(d,J＝9.9Hz),131.95,134.42,136.56(d,J＝4.8Hz),145.63,155.52,161.96(d,J＝251.9Hz),165.39,166.75,181.59ppm；MS(ACPI)m/z464.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4l)。

黄色晶体(69％产率)；mp 233-235℃；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.8(s,3H),3.89(s,3H),5.34(s,2H),6.8(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.89(d,J＝2.1Hz,1H),6.93(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.15-7.41(m,6H),7.71(d,J＝8.5Hz,1H),7.87ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ33.69,55.9,65.74,97.58,100.66,106.22,108.31,110.8,112.07,113.45,116.79,125.49,128.63,130.91,131.23,132.07,134.43,137.09,145.77,155.63,165.68,166.89,181.71ppm；MS(ACPI)m/z 480.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-[(5-甲氧基-1-甲基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-7-甲基-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4m)。

黄色晶体(74％产率)；mp 241-243℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ2.25(s,3H),3.84(s,3H),3.9(s,3H),5.41(s,2H),6.9(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),7.2(d,J＝8.5Hz,1H),7.29(s,1H),7.41-7.55(m,2H),7.57-7.63(m,3H),7.66(d,J＝8.5Hz,1H),8.08ppm(s,1H)；¹³CNMR(126MHz,CDCl3)δ＝8.21,33.83,55.97,66.32,100.72,105.78,107.83,108.59,110.8,110.96,113.51,116.75,122.66,128.66,128.7,130.76,131.77,132.1,134.27,137.11,146.02,155.62,163.16,164.55,182.67ppm；MS(ACPI)m/z 494.2(MH⁺,100)。

(2Z)-2-[(1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-6-[(2-氟苄基)氧]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4n)。

黄色晶体(63％产率)；mp 139-141℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.42(t,J＝7.2Hz,3H),3.85(s,3H),4.29(q,J＝7.2Hz,2H),5.31(s,2H),6.83-6.94(m,2H),7.18-7.33(m,4H),7.4-7.53(m,2H),7.56-7.64(m,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,1H),8.19ppm(s,1H)；¹³CNMR(126MHz,CDCl₃)δ15.39,41.93,55.79,64.27(d,J＝4.6Hz),97.36,100.63,106.29,108.29,110.81,112.06,113.32,115.48(d,J＝21.1Hz),116.63,123.03(d,J＝14.2Hz),124.43(d,J＝3.6Hz),125.4,128.78,129.61(d,J＝3.6Hz),130.15(d,J＝8.2Hz),130.97,132.69,145.6,155.48,160.41(d,J＝247.2Hz),165.25,166.82,181.64ppm；MS(ACPI)m/z444.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-[(1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4o)。

黄色晶体(73％产率)；mp 211-213℃；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.54(t,J＝7.2Hz,3H),3.9(s,3H),4.2(q,J＝7.2Hz,2H),5.36(s,2H),6.82(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),6.89-6.97(m,2H),7.2-7.42(m,6H),7.73(d,J＝8.5Hz,1H),7.97ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ15.46,42.02,55.91,65.75,97.62,100.76,106.33,108.42,110.91,112.09,113.41,116.82,125.51,128.63,128.9,130.91,131.09,131.22,132.76,137.09,145.75,155.59,165.68,166.89,181.74ppm；MS(ACPI)m/z 494.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯-6-氟苄基)氧]-2-[(1-乙基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4p)。

黄色晶体(74％产率)；mp 198-200℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.46(t,J＝7.2Hz,3H),4.36(q,J＝7.2Hz,2H),5.35(d,J＝1.8Hz,2H),6.91(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.21-7.33(m,3H),7.33-7.41(m,2H),7.47(d,J＝8.1Hz,1H),7.52-7.59(m,1H),7.61(d,J＝8.1Hz,1H),7.7(d,J＝8.5Hz,1H),8.08(d,J＝7.8Hz,1H),8.28ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ15.31,41.73,61.68,97.46,105.98,108.61,109.95,112.02,114.42(d,J＝22.7Hz),116.6,119.18,121.22,121.44(d,J＝17.2Hz),122.88,125.36,125.66,128.06,131.18(d,J＝9.8Hz),132.51,135.96,136.55(d,J＝4.8Hz),145.95,161.95(d,J＝252.5Hz),165.46,166.87,181.69ppm；MS(ACPI)m/z 448.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-[(1-乙基-1H-吲哚-3-基)亚甲基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4q)。

黄色晶体(68％产率)；mp 213-215℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.46(t,J＝7.2Hz,3H),3.35(s,3H),4.37(q,J＝7.2Hz,2H),5.43(s,2H),6.92(dd,J＝8.5,2.2Hz,1H),7.18-7.34(m,3H),7.40(d,J＝2.2Hz,1H),7.52(dd,J＝8.9,7.2Hz,1H),7.59-7.65(m,3H),7.71(d,J＝8.5Hz,1H),8.05-8.13(m,1H),8.29ppm(s,1H)；¹³C NMR(126MHz,CDCl3)δ15.43,41.85,65.77,97.6,106.13,108.76,110.03,112.17,116.75,119.35,121.33,122.99,125.55,128.17,128.66,130.93,131.22,132.58,136.08,137.11,146.07,165.75,167,181.83ppm；MS(ACPI)m/z 464.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,6-二氯苄基)氧]-2-(吡啶基-4-基亚甲基)-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4r)。

向1.5g(10mmol)6-羟基苯并呋喃-3(2H)-酮(1)的30mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中加入4.14g(30mmol,3eq)无水碳酸钾，随后加入2.35g(12mmol,1.2eq)2,6-二氯苄基氯(伊诺凯有机物公司(AcrosOrganics))。将混合物在25℃下搅拌8h，并用200mL水稀释。收集沉淀物，用水洗涤，干燥，用1∶100二氯甲烷-甲醇进行柱层析纯化，得到1.79g(58％)淡黄色晶体的6-((2,6-二氯苄基)氧)苯并呋喃-3(2H)-酮：mp 153-155℃。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.64(s,2H),5.34(s,2H),6.67-6.77(m,2H),7.29(d,J＝7.2Hz,1H),7.33-7.42(m,2H),7.58(d,J＝9Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3)δ65.57,75.56,97.32,111.98,114.76,125.15,128.56,130.9,130.96,136.97,167.18,176.32,197.49ppm；MS(ACPI)m/z 309.2(MH⁺,100)。向50mL新鲜配制的0.2M(5eq)甲醇钠(sodium methoxide)溶液中加入618mg(2mmol)6-((2,6-二氯苄基)氧)苯并呋喃-3(2H)-酮和214mg(2mmol,1eq)4-吡啶甲醛的5mL甲醇溶液。将混合物在25℃下搅拌12h。将溶液浓缩，并且倒入100mL冷水中。使用1N盐酸水溶液酸化混合物至约(ca.)pH 6。过滤收集沉淀物，并且从2:1N,N-二甲基甲酰胺-甲醇中重结晶，获得445mg(56％)4r：mp 219-222℃；¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.41(s,2H),6.7(s,1H),6.88(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.96(d,J＝2.2Hz,1H),7.28-7.36(m,1H),7.36-7.45(m,2H),7.68-7.78(m,3H),8.7ppm(d,J＝5.2Hz,2H)；¹³CNMR(126MHz,CDCl3)δ66.04,98,108.3,113.23,114.8,124.74,126.45,128.78,130.92,131.17,137.19,139.95,150.3,150.36,167.19,168.85,182.73ppm；MS(ACPI)m/z 398.0(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2-氯苄基)氧]-2-[2-氯-4-(二甲基氨基)亚苄基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4s)。

黄色晶体(71％产率)；mp>220℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ4.15(s,6H),6.16(s,2H),7.61-7.7(m,2H),7.77(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),7.85(s,1H),8.08(d,J＝2.1Hz,1H),8.21-8.31(m,2H),8.35-8.41(m,1H),8.45-8.5(m,1H),8.54(d,J＝8.6Hz,1H),9.03ppm(d,J＝8.8Hz,1H)；¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ39.63,68.01,107.11,111.25,111.95,112.85,114.66,115.69,125.42,127.49,129.53(2C),130.34,130.59,132.61,132.97,133.3,136.51,145.56,151.64,165.66,167.09,180.91ppm；MS(ACPI)m/z441.2(MH⁺,100)。

(2Z)-6-[(2,5-二氟苄基)氧]-2-[4-(二乙基氨基)-2-甲氧基亚苄基]-1-苯并呋喃-3(2H)-酮(4t)。

黄色晶体(80％产率)；mp 184-186℃；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.15(t,J＝7Hz,6H),3.45(q,J＝7Hz,4H),3.89(s,3H),5.29(s,2H),6.23(d,J＝2.3Hz,1H),6.43(dd,J＝9.1,2.3Hz,1H),6.92(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.12(s,1H),7.22(d,J＝2.1Hz,1H),7.27-7.4(m,2H),7.44-7.54(m,1H),7.66(d,J＝8.5Hz,1H),8.05ppm(d,J＝9.1Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ12.54,43.98,55.5,64.03,93.62,97.81,104.8,107.06,107.33,112.37,115.41,116.69-117.33(m,3C),124.94(dd,J＝17.3,8.3Hz),124.96,132.69,144.34,150.79,156.45(d,J＝242.8Hz),158.05(d,J＝242.7Hz),160.51,164.76,166.32,180.42ppm；MS(ACPI)m/z 466.2(MH⁺,100)。

生物品

细胞培养。LS174T(结肠癌细胞)、PC-3(***癌细胞)、MCF-7(乳腺)和A549(肺)细胞在美国菌种保存中心推荐的培养基中，在37℃、5％CO2环境下，在水套式培养箱中培养。Ovcar-8和NCI/ADR-RES是来自Markos Leggas博士的馈赠。α-微管蛋白抗体，TRITC偶联的抗兔抗体。

增殖抑制试验。将癌细胞以每孔1mL培养基中的20000个细胞的密度播种到24孔板中，在37℃下培养过夜。向细胞中加入化合物和载剂对照DMSO。6天后，移除培养基，加入100微升胰蛋白酶。然后用PBS重悬细胞，并用Vi-CELL XR 2.03(美国贝克曼库尔特公司)进行计数。以化合物处理组的成活细胞数与DMSO处理组的成活细胞数之比R作为相对生长，并计算生长抑制百分比为：(1-R)*100。初始测试时，将化合物以最终浓度10μM加入细胞中。10μM的活性化合物将以更低的浓度进行测试。

体外微管蛋白聚合试验。体外微管蛋白聚合试验参照微管蛋白制造商的方法进行。简言之，将微管蛋白粉(美国细胞骨架(Cytoskeleton)公司)溶解在冰上的冷缓冲液[100mM PIPES(pH 6.9)、2mM MgCl₂、1mM GTP和5％甘油]中。然后将得到的微管蛋白溶液等分(80μL,3.75μg/μL)到96孔半面积板(half-area plate)(美国康宁公司)的孔中。在加入DMSO或测试化合物后，将板放置在配备有热控制器(可以将温度调节到37℃(美国DYNEX技术有限公司))的Spectra MR^TM微孔板分光光度计上。每30s记录一次350nm处的读数，持续1小时。

体内微管组装试验。按照Blagosklommy等人(Cancer research 55，4623-4626(1995))的方法，检测接触化合物后细胞中不溶性聚合微管和可溶性微管蛋白二聚体的数量。将细胞以50％的融汇度接种在6孔板中，并培养过夜。加入DMSO或化合物，并将细胞额外孵育6小时。去除培养基，用PBS洗涤细胞三次，然后加入裂解缓冲液[20mM Tris-HCl(pH6.8)、1mM MgCl₂、2mM EGTA、20μg/mL抑肽酶、20μg/mL亮抑酶肽、1mM PMSF、1mM原钒酸盐(orthovanadate)和0.5％NP40]。将裂解液在12000g离心10min，得到上清液和沉淀，与加样缓冲液混合后煮沸。然后如我们以前的工作所述，对β-微管蛋白进行标准的蛋白印迹分析(ACS Chem Biol 8,796-803,doi:10.1021/cb3005353(2013))。

免疫荧光成像。通过共聚焦免疫荧光成像检查微管蛋白网络。简言之，将PC3细胞以80000/mL的密度放置到装有圆形显微镜玻璃盖玻片的24孔板上。在37℃下培养24小时后，向细胞中加入DMSO或化合物，再孵育6小时。然后去除培养基，用PBS洗细胞三次。加入抗α-微管蛋白的第一抗体，在4℃孵育过夜。额外洗涤后，加入TRITC偶联的抗兔第二抗体40分钟，然后额外洗涤，用DAPI染色。最后洗涤，盖玻片倒置到玻璃玻片上。使用在557nm激发和在576nm发射的尼康共聚焦显微镜拍摄图像(40×)。

分子对接。从RCSB蛋白数据库下载αβ-微管蛋白与秋水仙素结合的X射线晶体结构(pdb:4O2B)，并使用AutoDockTools-1.5.6(斯克利普斯研究所的分子图形实验室)制备。简言之，使用PyMOL(1.7.4.5教育(Edu)版)将αβ-微管蛋白二聚体从4O2B中分离。去除水分子，添加极性氢和科尔曼(Kollman)电荷。对接口袋(秋水仙素结合位点)定义如下：搜索空间：

中心_x,y,z＝14.815,9.422,-20.186。配体4a由Openbabel制备。使用AutoDock vina-1.1.2、使用基于梯度的迭代局部搜索方法和用于局部优化的Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno(BFGS)方法进行4a与秋水仙素结合位点的分子对接。穷尽度(Exhaustiveness)设置为14，模式数为9。其他参数均为默认值。分析并提出了具有最低结合自由能的经对接的微管蛋白-4a复合物。

斑马鱼模型中抗白血病活性的体内评价。

在12孔板中，将21日龄的Rag2:Myc-GFP斑马鱼用DMSO、噢哢4a或4r的1.5mL鱼系统水溶液(fish system water)处理。斑马鱼用化合物处理2天，从药物中取出后1天，在新鲜化合物中再处理2天。在处理开始和结束时，使用装备有荧光的解剖显微镜在350ms曝光下对动物进行成像。在Photoshop中，将GFP图像叠加到各个动物的明视野图像上，通过在ImageJ中将GFP+区域与动物的总面积进行标准化，来计算白血病负担的百分比变化。

体内评价异种移植体的抗癌活性和总体毒性。将悬浮在PBS中的PC-3细胞以2×10⁶个细胞/200μl(PBS)的密度皮下注射到免疫缺陷裸鼠的下侧腹。肿瘤形成后，以腹膜内方式向小鼠施用在吐温(tween)80(5％)、DMSO(10％)、PEG400(25％)和PBS(60％)中配制的4A溶液，每日剂量为10mg(化合物)/kg(小鼠)。用空白载剂作为对照。测量肿瘤和小鼠体重，并以长度×宽度²/2来计算肿瘤体积。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请在此通过引用并入本文，其程度与各个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明要通过引用并入本文的程度相同，包括以下列表中列出的参考文献：

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[6]Pathak，N.P.，Ind J App Res 6，800-802(2016).

虽然公开的内容容易具有多种修改和替代形式，但其具体实施方式已在图中以实施例的方式示出，并在下文中详细描述。然而，应当理解的是，对具体实施方式的描述并不是为了限制本公开的内容，并不为了涵盖属于所附权利要求所定义的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。