阅读说明：本技术 一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂 (Bacterial ribosome inhibitor screening method and inhibitor thereof ) 是由 罗有福 杨涛 桑梓苔 于 2019-04-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂,其特征在于该筛选体系为细菌核糖体粗提物介导的原位点击化学反应偶联细菌体外转录/翻译体系。向细菌核糖体粗提物中分别加入合成砌块,而后加入荧光素酶质粒和细菌转录/翻译体系反应试剂,最后利用荧光素酶检测系统和酶标仪测定体系荧光强度值,下降越多者对应的原位点击化学产物极为活性越好的细菌核糖体小分子抑制剂。本发明同时公开了利用上述筛选方法得到的一系列新型细菌核糖体抑制剂及其在制备抗金黄色葡萄球菌药物方面的用途。本发明公开的细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂为开发和制备抗菌药物方面具有极好的应用前景。(The invention relates to a screening method of a bacterial ribosome inhibitor and the inhibitor thereof, which is characterized in that the screening system is an in-situ click chemistry reaction coupling bacterial in-vitro transcription/translation system mediated by a bacterial ribosome crude extract. And (2) respectively adding the synthetic building blocks into the crude extract of the bacterial ribosome, then adding a luciferase plasmid and a bacterial transcription/translation system reaction reagent, and finally determining the fluorescence intensity value of the system by using a luciferase detection system and a microplate reader, wherein the more the fluorescence intensity value is reduced, the more the corresponding in-situ click chemical product is reduced, and the bacterial ribosome small-molecule inhibitor with better activity is obtained. The invention also discloses a series of novel bacterial ribosome inhibitors obtained by the screening method and application thereof in preparing anti-staphylococcus aureus medicaments. The screening method of the bacterial ribosome inhibitor and the inhibitor thereof disclosed by the invention have excellent application prospects in the aspects of developing and preparing antibacterial drugs.)

一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂

技术领域

本发明涉及抗菌药物研究领域，具体涉及一系列细菌核糖体抑制剂和利用细菌核糖体粗提物构建的一种新的原位点击化学偶联细菌体外翻译体系的细菌核糖体抑制剂筛选方法。

背景技术

点击化学(Click chemistry)，也称作链接化学、动态组合化学等。是指通过小单元的拼接，快速完成多种分子的化学合成，并建立以碳杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法。点击化学反应通常具有以下特点：反应原料易得；反应操作简单，条件温和；产物产率高、反应的立体选择性好；反应迅速，具有较高的动力学驱使力；所得产物后处理过程简单；符合原子经济性等。点击化学能最大程度上降低化学反应对环境的不利影响。目前应用于药物开发的点击化学反应主要涉及以下4种反应类型：环加成反应、亲和开环反应、非醇醛的羰基化学反应和碳碳多键的加成反应。

原位点击化学(In situ click chemistry),是目前点击化学在合成化学中应用的较多的方法。指在合成过程中，发生点击反应的物质都在溶液中生成，无须分离提纯等处理步骤，直接向反应体系中加入发生点击反应试剂并开启反应。例如，以酶为原位点击化学模版，连接各模块组分以合成该酶自身的抑制剂。该方法已经成功运用至诸多药物靶标蛋白的抑制剂分子的发现实例中。包括乙酰胆碱酯酶和细菌核糖体等。

以细菌核糖体为生物模版的原位点击化学传统方法为：首先培养细菌，例如大肠杆菌，随后需经过收菌、破菌、蔗糖梯度离心和超速离心等较为复杂的分离纯化步骤得到细菌核糖体。将点击化学反应模块依次与分离纯化所得的细菌核糖体在适合的溶液中温和孵育一定时间使点击化学反应发生，例如叠氮-炔基环加成反应等。反应结束后，使用液质联用(LC-MS)分析方法分析原位点击化学反应样品检测点击化学反应终产物。已有相关文献报道利用该方法筛选并发现具有抗菌活性的基于索利霉素骨架的核糖体抑制剂小分子化合物。

在以往的原位点击化学产物分析方法中，最常用的即为LC-MS分析。相比本发明偶联筛选平台中的细菌体外翻译体系，LC-MS方法检测反应产物难以实现高通量筛选，具体表现在：1)点击化学反应体系仍需要样品沉淀除去生物模版蛋白等预处理过程，才能进行LC-MS进样检测；2)LC-MS的液相分离及质谱条件均需要提前调试已达到最好的检测效果3)LC-MS分析样品需转移到进样瓶中，依次逐个进行分析，即使以5分钟/个的分析速度，仍然无法做到较高通量的筛选。

本发明中将原位点击化学过程与细菌体外转录/翻译体系有机的偶联在一起。细菌体外翻译体系是在非细胞体系中即体外模拟细菌在核糖体及其他必须物料的配合下经过转录和翻译过程合成所需蛋白质的过程。就常用的研究实例而言具体为以下几个步骤：首先构建包含有荧光蛋白基因的可在细菌体系进行转录和翻译的质粒；随后，一般在微孔板或PCR管中，将质粒与细菌转录和翻译过程中所需的所有物料，例如氨基酸混合物、ATP、CTP和GTP等，进行混合，使体系在合适温度下孵育，使得质粒在体外进行转录及翻译，生成荧光蛋白。该蛋白的表达量的变化即反映出核糖体生物活性的变化。本发明正是利用生物靶标即细菌核糖体的生物活性对原位点击化学反应所得的小分子产物进行高通量筛选以得到有效的细菌核糖体小分子抑制剂。

对于核糖体参与的转录和翻译过程最终产生的荧光蛋白的含量测定，本发明中采用的是发光激酶试验体系，现有大量的商用试剂盒可用于该步骤(例如Promeg公司的Kinase-Luminescent kinase assay platform Kit等)。该试剂盒的原理为，在ATP存在的情况下，试验底物荧光素(试剂盒中提供)在荧光蛋白的酶催化作用下生成氧化荧光素同时发出荧光，利用酶标仪检测荧光强度从而对催化酶即荧光蛋白的含量进行测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种细菌核糖体抑制剂筛选方法及其抑制剂，以克服现有方法的不足。

如权利要求1中所述的一种细菌核糖体抑制剂筛选方法，其特征在于：是一种化学合成偶联活性测试的高通量筛选体系。

如权利要求1所述的一种细菌核糖体抑制剂的筛选方法，其特征在于化学合成阶段为一种原位点击化学反应。

如权利要求2所述的一种原位点击化学反应的生物催化模板为细菌核糖体粗提物。

如权利要求2所述的一种原位点击化学反应，其特征在于反应合成砌块为叠氮基构建块和含炔基构建块。

如权利要求2所述的一种原位点击化学反应，其特征在于其反应类型为[2+3]偶极环加成反应。

如权利要求3所述的本发明的原位点击化学生物模版细菌核糖体粗提物，其具体制备步骤为：将细菌培养至一定阶段，离心、收菌、破菌后所得。具体步骤为：将细菌在37℃摇床中，在细菌培养基中培养至OD600～2后，低温高速离心收集菌体。经高压均质器和细胞破碎仪对菌体进行破碎。最终经过10min低温高速离心(12,000RCF,SS-34,10,000rpm,10min,4℃)获得细菌核糖体粗提物。

如权利要求3所述的细菌核糖体粗提物可来自于大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。

如权利要求2所述的本发明中的原位点击化学反应合成砌块为叠氮基构建块和含炔基构建块。

如权利要求1所述的一种细菌核糖体抑制剂筛选方法，其特征在于将基于生物靶标活性的核糖体翻译生成蛋白质的过程与原位点击化学反应相偶联，对核糖体粗提物作为原位点击化学生物催化模版催化生成的***环加成产物进行高通量筛选，得到有效的核糖体小分子抑制剂。

如权利要求1所述的一种细菌核糖体抑制剂筛选方法，其具体操作步骤为：在多孔板中，将细菌核糖体粗提物与炔基构建块(5μM)在0℃共同孵育30min，随后加入叠氮基构建块(50μM)，在室温下共同孵育24h，该过程中原位点击化学反应发生生成相应产物。随后加入细菌体外转录/翻译体系发生的物料混合液[500mM醋酸钾,87.5mM Tris-acetate[pH8.0],67.5mM醋酸胺,50g/mL of亚叶酸,5mM DTT,87.5mg/mL聚乙二醇,5.0mM ATP,1.25mM[每种]核糖核苷三磷酸,50mM c,2.5mM环化AMP,250g/mL of大肠杆菌tRNA],氨基酸混合物(每种氨基酸浓度均为1.25mM),荧光质粒pSAluc]在37℃下共同孵育1小时，该过程中细菌核糖体粗提物中的核糖体发挥其转录翻译蛋白质的生物活性生成荧光蛋白，通过发光激酶试验体系对荧光蛋白进行定量以衡量细菌核糖体的生物活性及其收到抑制的程度。

如权利要求1中所述的一系列细菌核糖体抑制剂包括化学结构为2c的小分子化合物和结构通式为(I)所示的一类小分子化合物：

结构通式(I)中，R1为氢元素，或1，2，3，4位的单取代、多取代的F、Cl、Br，硝基，甲氧基，乙酰基，三氟甲氧基；R₂为氢元素，或5，6，7，8，9位的单取代、多取代的F。

小分子化合物2c为：3-(1-(4-([1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-氟苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2c)

2-(1-(2,4',6-三氟醚-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2a)

1-(3'-(4-(2-吡啶基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-[1,1'-联苯]-4-基)乙酮(2b)

3-(1-(2,3',6-三氟醚-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2d)

1-(4'-(4-(吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-[1,1'-联二苯]-4-基)乙酮(2e)

2-(1-(3,5-二氟-3',4'-二甲氧基-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2f)

3-(1-(2,2',6-三氟醚-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2g)

3-(1-(3'-(三氟甲氧基)-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2h)

2-(1-([1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2i)

附图说明

图1，用于实施例1和实施例2中活性砌块筛选的叠氮合成砌块1a～1i的化学结构。

图2，以大肠杆菌(BL21)核糖体粗提物为体系基质的原位点击化学偶联细菌体外转录/翻译体系对叠氮合成七块1a～1i的荧光筛选结果。

图3，以金黄色葡萄球菌(ATCC33591)核糖体粗提物为体系基质的原位点击化学偶联细菌体外转录/翻译体系对叠氮合成七块1a～1i的荧光筛选结果。

图4，实施例1和实施例2中筛选得到的细菌核糖体抑制剂2c和2h以及其他原位点击化学产物(2a，2b，2d～2g，2i)化学结构。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的筛选方法进行详细描述：

实施例1

将大肠细菌(BL21)在37℃摇床中，于3L LB培养基中培养至OD600～2后，低温高速离心收集菌体。经高压均质器和细胞破碎仪对菌体进行破碎。最终经过10min低温高速离心(12,000RCF,SS-34,10,000rpm,10min,4℃)获得25mL大肠杆菌核糖体粗提物。

在96孔板中，将100mL上述制备的大肠杆菌核糖体粗提物与选定的炔基构建块2-乙炔基吡啶(体系终浓度为5μM)在0℃冰浴环境下共同孵育30min，随后加入待筛选叠氮基构建块(体系终浓度为50μM)，在室温下共同孵育24h。随后加入细菌体外转录/翻译体系发生的物料混合液40μM[500mM醋酸钾,87.5mM Tris-acetate[pH 8.0],67.5mM醋酸胺,50g/mL of亚叶酸,5mM DTT,87.5mg/mL聚乙二醇,5.0mM ATP,1.25mM[每种]核糖核苷三磷酸,50mM c,2.5mM环化AMP,250g/mL of大肠杆菌tRNA],氨基酸混合物(每种氨基酸浓度均为1.25mM),荧光质粒pSAluc]在37℃下共同孵育1小时。取出75μL孵育液转移至另一块96孔板，加入75μL Promega公司的Kinase-

Luminescent kinase assay platform Kit试剂盒中的底物缓冲液，室温放置10分钟后，置于酶标仪上读取荧光强度值。与空白对照组相比荧光强度值下降越多的叠氮基构建块对应生成的点击化学产物(三氮唑环加成产物)即为有效的细菌核糖体小分子抑制剂。

为验证该筛选方法的有效性，对图1中选取的9个叠氮构建块(1a～1i)进行筛选。

筛选结果如图2所示：单独加入2-乙炔基吡啶对荧光强度值没有影响，说明2-乙炔基吡啶对于细菌核糖体活性没有明显的抑制活性。而与空白对照组相比，叠氮基构建块1c和1h组的荧光强度值下降明显。说明在加入叠氮基构建块后，1c和1h与2-乙炔基吡啶发生原位点击化学反应生成的***环加成产物具有抑制细菌核糖体的生物活性。

实施例2

将金黄色葡萄球菌(ATCC33591)在37℃摇床中，于3L BHI培养基中培养至OD600～2后，低温高速离心收集菌体。经高压均质器和细胞破碎仪对菌体进行破碎。最终经过10min低温高速离心(12,000RCF,SS-34,10,000rpm,10min,4℃)获得20mL大肠杆菌核糖体粗提物。

在96孔板中，将100mL上述制备的金黄色葡萄球菌核糖体粗提物与选定的2-乙炔基吡啶(体系终浓度为5μM)在0℃共同孵育30min，随后加入待筛选叠氮基构建块(体系终浓度为50μM)，在室温下共同孵育24h。随后加入细菌体外转录/翻译体系发生的物料混合液40μM[500mM醋酸钾,87.5mM Tris-acetate[pH 8.0],67.5mM醋酸胺,50g/mL of亚叶酸,5mMDTT,87.5mg/mL聚乙二醇,5.0mM ATP,1.25mM[每种]核糖核苷三磷酸,50mM c,2.5mM环化AMP,250g/mL of大肠杆菌tRNA],氨基酸混合物(每种氨基酸浓度均为1.25mM),荧光质粒pSAluc在37℃下共同孵育1小时。取出75μL孵育液转移至另一块96孔板，加入75μL Promega公司的Kinase-

Luminescent kinase assay platform Kit试剂盒中的底物缓冲液，室温放置10分钟后，置于酶标仪上读取荧光强度值。荧光强度值与空白对照组相比下降越多的炔基构建块对应生成的点击化学产物即为有效的细菌核糖体小分子抑制剂。

为验证该筛选方法的有效性，对图1中的9个叠氮构建块1a～1i进行筛选。

筛选结果如图3所示：单独加入2-乙炔基吡啶对荧光强度值没有影响，说明2-乙炔基吡啶对于细菌核糖体活性没有明显的抑制活性。而与空白对照组相比，叠氮基构建块1c和1h组的荧光强度值下降明显。说明在加入叠氮基构建块后，1c和1h与2-乙炔基吡啶发生原位点击化学反应生成的***环加成产物具有抑制细菌核糖体的生物活性。

为验证实施例1和实施例2中叠氮基构建块与2-乙炔基吡啶反应生成的***环加成产物(2a～2i)的细菌核糖体抑制活性，利用化学合成方法合成图4中的点击化学产物：

***环加成产物2a～2i化学合成步骤及其核磁、质谱特征数据如下：

2-(1-(2,4',6-三氟-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2a)

反应封管中，向4-叠氮基-2,4',6-三氟-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.51(s,1H),8.68(d,J＝4.4Hz,1H),8.14(m,1H),8.05(m,2H),7.97(td,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.60(m,4H),7.44(m,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.30,158.84,150.25,149.56,149.00,137.92,137.51,134.28,132.44(2C),129.22(2C),126.94,124.07,122.07,120.40,104.90,104.74,104.58.HRMS(Q-TOF):calculated forC₁₉H₁₁F₃N₄[M]:352.0936.Found[M+H]⁺:353.1010.

1-(3'-(4-(2-吡啶基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-[1,1'-联苯]-4-基)乙酮(2b)

反应封管中，向1-(3'-叠氮-[1,1'-联二苯]-4-基)乙酮(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),8.68(d,J＝4.4Hz,1H),8.40(m,1H),8.15(m,1H),8.10(m,3H),8.03(m,2H),7.97(td,J＝7.6,2.0Hz,1H),7.91(m,1H),7.75(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(m,1H),2.65(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ198.05,150.16,149.99,148.75,143.52,141.07,137.84,137.74,136.71,131.16,129.37(2C),127.76(2C),127.71,123.85,122.09,120.44,120.29,119.00,27.30.HRMS(Q-TOF):calculated for C21H₁₆N₄O[M]:340.1324.Found[M+H]⁺:341.1400.

2-(1-(4-([1,3]二氧杂环戊烯-5-基)-2-氟苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2c)

反应封管中，向5-(4-叠氮-3-氟苯基)-[1,3]二氧杂环戊烯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.06(d,J＝2.0Hz,1H),8.67(m,1H),8.14(m,1H),7.94(m,3H),7.74(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.43(m,2H),7.34(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.07(d,J＝8.0Hz,1H),6.11(s,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ150.25,149.82,148.69,148.37,148.19,143.47,137.87,132.15,126.66,124.93,123.89,123.56,123.53,121.45,120.35,115.16,109.29,107.79,101.94,100.00.HRMS(Q-TOF):calculated forC₂₀H₁₃FN₄O₂[M]:360.1023.Found[M+H]⁺:361.1101.

2-(1-(2,3',6-三氟-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2d)

反应封管中，向4-叠氮-2,3',6-三氟-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.49(m,1H),8.66(m,1H),8.03(m,4H),7.59(s,1H),7.41(m,4H).¹³CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ163.64,161.27,158.83,150.22,149.55,149.00,137.87,137.53,131.12,130.18,126.84,124.04,122.05,120.38,117.49,116.29,104.82,104.67,104.51.HRMS(Q-TOF):calculated for C₁₉H₁₁F₃N₄[M]:352.0936.Found[M+H]⁺:353.1006.

1-(4'-(4-(吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)-[1,1'-联二苯]-4-基)乙酮(2e)

反应封管中，向1-(4'-叠氮-[1,1'-联二苯]-4-基)乙酮(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),8.68(d,J＝5.2Hz,1H),8.16(m,3H),8.08(m,2H),8.02(m,2H),7.96(m,3H),7.42(m,1H),2.64(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ197.98,150.18,149.94,148.79,143.51,139.57,137.84,136.89,136.52,129.45(2C),128.91(2C),127.46(2C),123.87,121.73,121.12(2C),120.34,27.29.HRMS(Q-TOF):calculated for C₂₁H₁₆N₄O[M]:340.1324.Found[M+H]⁺:341.1400.

2-(1-(3,5-二氟-3',4'-二甲氧基-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2f)

反应封管中，向4-叠氮-3,5-二氟-3',4'-二甲氧基-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.13(s,1H),8.67(d,J＝4.8Hz,1H),8.15(m,1H),7.97(td,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.89(d,J＝10.0Hz,2H),7.44(m,3H),7.10(m,1H),3.90(s,3H),3.84(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ158.34,155.84,150.52,150.29,149.69,149.66,147.98,144.97,137.92,129.52,126.78,123.98,120.35,120.15,112.57,111.10,110.71,110.51,110.48,56.25,56.14.HRMS(Q-TOF):calculated for C₂₁H₁₆F₂N₄O₂[M]:394.1241.Found[M+H]⁺:395.1318.

2-(1-(2,2',6-三氟-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2g)

反应封管中，向4-叠氮-2,2',6-三氟-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(s,1H),8.69(d,J＝4.4Hz,1H),8.12(m,3H),7.97(m,1H),7.60(m,2H),7.43(m,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.37,158.90,150.24,149.57,149.00,138.14,137.90,132.80,132.23,125.25,124.06,122.17,120.40,116.38,115.66,112.15,104.81,104.65,104.50.HRMS(Q-TOF):calculated for C₁₉H₁₁F₃N₄[M]:352.0936.Found[M+H]⁺:353.1017.

2-(1-(3'-(三氟甲氧基)-[1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2h)

反应封管中，向4'-叠氮-3-(三氟甲氧基)-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),8.68(d,J＝4.0Hz,1H),8.16(m,3H),7.97(m,3H),7.84(m,1H),7.77(s,1H),7.65(t,J＝8.0Hz,1H),7.42(m,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ150.18,149.93,149.54,149.52,148.78,141.60,139.07,137.84,136.80,131.52,128.84(2C),126.41,123.87,121.73,121.10(2C),120.79,120.34,119.89.HRMS(Q-TOF):calculated for C₂₀H₁₃F₃N₄O[M]:382.1041.Found[M+H]⁺:383.1122.

2-(1-([1,1'-联二苯]-4-基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)吡啶(2i)

反应封管中，向4-叠氮-1,1'-联二苯(50mg,1.0eq.)的叔丁醇溶液中(5mL)依次加入铜粉(1eq.)，五水合硫酸铜(0.5eq.)，2-乙炔基吡啶(2eq.)，65℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应体系冷却至室温。而后向反应体系中加入20mL水淬灭反应，20mL二氯甲烷萃取3次。真空旋干有几层的粗产品，柱层析分离得目标产物2a(收率28.41％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.39(s,1H),8.68(d,J＝4.8Hz,1H),8.14(m,3H),7.95(m,3H),7.77(m,2H),7.52(m,2H),7.43(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ150.16,149.99,148.73,140.92,139.25,137.81,136.24,129.55(2C),128.48(3C),127.24(2C),123.82,121.68,121.07(2C),120.32.HRMS(Q-TOF):calculated for C₁₉H₁₄N₄[M]:298.1218.Found[M+H]⁺:299.1300.

为验证该细菌核糖体筛选方法得的有效性，对所得的***环加成产物2a～2i的核糖体抑制活性进行测定。

实施例3

测定***环加成产物小分子2a～2i在浓度为1μM时对细菌核糖体生物活性的抑制率百分比。

小分子的细菌核糖体抑制活性测定采用体外细菌偶联的转录/翻译实验进行测定。蔗糖密度梯度超速离心法制备大肠杆菌(BL21)核糖体亚基50S和30S。0℃冰浴下与1μM小分子共同孵育1h。随后加入细菌体外转录/翻译体系发生的物料混合液[500mM醋酸钾,87.5mM Tris-acetate(pH 8.0),67.5mM醋酸胺,50g/mL of亚叶酸,5mM DTT,87.5mg/mL聚乙二醇,5.0mM ATP,1.25mM/每种核糖核苷三磷酸,50mM c,2.5mM环化AMP,250g/mL of大肠杆菌tRNA],氨基酸混合物(每种氨基酸浓度均为1.25mM)以及荧光质粒pSAluc，混合液在37℃下共同孵育1小时。取出75μL孵育液转移至另一块96孔板，加入75μL Promega公司的Kinase-Luminescent kinase assay platform Kit试剂盒中的底物缓冲液，室温放置10分钟后，置于酶标仪上读取荧光强度值，与空白对照组荧光强度值对比计算得到抑制率百分比。结果如下表1所示：***环加成产物2c和2h在1μM浓度下，对细菌核糖体活性的抑制率达到百分之百，而其他小分子在该作用浓度下对细菌核糖体生物活性没有明显抑制作用。

表1中的结果说明，本发明方法筛选所得结果与小分子核糖体抑制活性吻合效果较好。筛选得到的阳性小分子化合物2c和2h具有极好的核糖体抑制活性，是有效的细菌核糖体小分子抑制剂。

表1:小分子化合物细菌核糖体抑制率百分比(100μM)和体外抗菌活性测定结果MIC(μg/mL)

为验证该方法筛选所得化合物的体外抗菌活性，对所得的***环加成产物2a～2i进行体外抗菌活性进行测定，验证在筛选中荧光强度下降最多的叠氮构建块所对应的***环加成产物小分子2c和2h是否具有较好的抗菌活性。

实施例4

测定对MRSA菌株ATCC33591和MSSA菌株ATCC25923的最低抑菌浓度即MIC。

受试菌株：MRSA ATCC33591，MSSA ATCC25923

实验方法：从MHA平板挑取单克隆菌于3mL MHB中，过夜培养。取过夜菌液测OD600，稀释至3mL MHB中(OD＝0.05)，37℃220rpm摇菌至对数生长期(0.4～0.8OD)，测OD600，调整菌液至1×105CFU/mL备用。利用多点接种仪，涂板于系列倍比稀释的琼脂平板，37℃静置培养18h。细菌生长的最小浓度即MIC。

以上结果说明：1)本发明中的筛选方法是一种简洁、高效和快速的细菌核糖体抑制剂筛选方法；2)经验证，利用该方法筛选所得的小分子化合物2c和2h是高效的核糖体小分子抑制剂，且具有较好的体外抗金黄色葡萄球菌活性，具有抗菌药开发潜力。