***在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用
阅读说明：本技术 ***在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用 (Application of dexamethasone in preparation of medicine for preventing or relieving jellyfish sting ) 是由 肖良 叶瑞威 梁洪昱 张晶 刘文文 李俊 刘青 家常亮 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医药技术领域,提供了地塞米松或其衍生物在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。通过实验验证,小鼠蜇伤前10min给药能显著延长小鼠的生存时间并降低小鼠死亡率；明显减轻水母毒素引起的小鼠心脏功能指标、肝功能指标和肾脏功能指标的变化程度；通过对小鼠的转录组学分析发现小鼠蜇伤前10min给药能明显改善多脏器的联合损伤,减弱多脏器之间的炎症程度,为地塞米松或其衍生物预防水母蜇伤提供了新的理论依据。由于地塞米松是成熟的抗炎和免疫抑制剂,其商品名有醋酸地塞米松片等,其药理作用明确、毒副作用小,药物安全性已得到临床认可,本发明提供的地塞米松的新适应症可较快实现临床转化。(The invention relates to the technical field of medicines, and provides application of dexamethasone or a derivative thereof in preparation of a medicine for preventing or relieving jellyfish sting. Experiments prove that the survival time of the mouse can be obviously prolonged and the death rate of the mouse can be reduced by administering the medicament 10min before the mouse is bitten; obviously reducing the change degree of the cardiac function index, the liver function index and the kidney function index of the mouse caused by the jellyfish toxin; transcriptomics analysis on mice shows that the combined injury of multiple organs can be obviously improved by administering the drug 10min before the mice sting, the inflammation degree among the multiple organs is weakened, and a new theoretical basis is provided for dexamethasone or derivatives thereof to prevent jellyfish sting. The dexamethasone is a mature anti-inflammatory and immunosuppressant, has the trade name of dexamethasone acetate tablets and the like, has definite pharmacological action, small toxic and side effects and clinical approval of drug safety, and can quickly realize clinical transformation.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，提供了***的新用途，具体涉及***或其衍生物在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用。
背景技术
水母(Jelly fish)是世界上最古老而神秘的生物之一，大约在6.5亿年前就已经存在于地球上，几乎分布于所有海域。在数量上，近几十年水母数量呈爆发式增长，不仅导致海洋生态系统的破坏，对海洋渔业造成灾难性的损害，而且水母蛰伤事件不断增多，每年都有成千上万人遭受伤害，成为十分棘手的问题。
自20世纪40年代开始，Pubmed就开始关注并逐渐报道了葡萄牙战舰水母(Portuguese man-of-war)、Irukandji水母、海黄蜂水母(Chironex fleckeri)、沙海蜇(Stomolophus meleagris)以及霞水母(Cyanea capillata)等代表性有毒水母蜇伤的病例、处治以及中毒机理的相关研究，基本明确了水母蜇伤可以分为局部皮肤症状和全身中毒两大类。局部皮肤症状包括剧痛、瘙痒、皮疹、色素沉着等；全身中毒症状则由水母蜇伤后出现的严重炎症反应引起，如果长时间浸泡于水母毒素中，水母毒素很有可能会穿透皮肤进入血液，进一步引起心脏、肝脏、肾脏等体内多个脏器的广泛损伤导致死亡。
目前主流观点认为心血管毒性是水母毒素(TE)的主要致死原因，抗毒血清、MgSO4、Ca2+通道阻断剂等是水母延迟毒性全身综合征(DJES)的有效治疗剂。但是不同水母间的拮抗效应存在着显著的差异，甚至同种实验在不同实验室的干预效果都会存在完全相反的情况，例如C.fleckeri抗毒血清、MgSO4以及维拉帕米等。
***(DXMS)是一种人工糖皮质激素，具有显著的抗炎和免疫抑制作用，在临床上广泛应用于哮喘、过敏等疾病，通过糖皮质激素受体(GR)发挥其生理作用。但***在母蜇伤中的防治作用目前尚未有文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种***或其衍生物的新医药用途。
本发明的第一方面在于提供***或其衍生物在制备预防或缓解水母蜇伤药物中的应用，该预防或缓解水母蜇伤药物为减轻蜇伤后血液指标改变或降低蜇伤后炎症反应的药物。
优选的，减轻蜇伤后血液指标改变的药物为减轻心脏功能、肝脏功能以及肾脏功能血液指标改变的药物。
应用***后，心脏功能、肝脏功能以及肾脏功能血液指标改变程度远低于作为阳性对照的PBS-TE组，如心脏功能血液指标方面，乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平显著低于PBS-TE组。肝功能血液指标方面，丙氨酸转移酶(ALT)，天冬氨酸转移酶(AST)以及总胆红素(TBIL)，直接胆红素(DBIL)，间接胆红素(IBIL)水平显著低于PBS-TE组；总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，球蛋白(GLB)水平明显高于PBS-TE组。肾功能血液指标方面，肌酐(creatinine，Cr)水平轻度高于阳性对照组，尿素氮(BUN)水平显著低于阳性对照组。但上述血液指标均与空白对照组水平存在一定差异，表明DXMS可以明显抑制和改善DJES症状，但无法完全逆转这一症状。
优选的，降低蜇伤后炎症反应的药物为抑制NF-κB信号通路的药物。NF-kB信号通路在水母蜇伤全身中毒中可能发挥了重要的损伤作用，成为水母蜇伤全身中毒潜在的作用新机理。
本发明中的***衍生物指的是能够发挥药理作用的***化合物，如氢化可的松、***等。
为了验证***对于水母蜇伤造成的多脏器损伤的防护效果，本发明通过对小鼠生存实验，血液学实验，多脏器切片和多脏器转录组学来验证***对于水母蜇伤造成的多脏器损伤的防护效果。
选择ICR小鼠，7周龄的雄性小鼠进行实验，蜇伤前10分钟予以小鼠尾静脉注射***(3mg/kg)。小鼠的蜇伤方式为尾静脉注射水母毒素，剂量为2mg/kg，将小鼠放置在盛有0.5cm高海水的1000ml饭盒中。
通过实验发现，小鼠蜇伤前10min给药能显著延长小鼠的生存时间；明显减轻水母毒素引起的小鼠心脏功能指标、肝功能指标和肾脏功能指标的变化程度；而通过对小鼠的转录组学分析发现小鼠蜇伤前10min给药能明显改善多脏器的联合损伤，减弱多脏器之间的炎症程度。
本发明所述的预防或缓解水母蜇伤药物是***或其衍生物作为唯一活性成份或者是包含***或其衍生物的药物组合物。
本发明所述的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型，例如其可以是为汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、脂质体制剂、气雾剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、膜剂或海绵剂。
本发明的上述药物或药物组合物适用于海上工作人员、海军战士、海边游客、海上救生员遭遇到水母蜇伤的情况，可用于预防或缓解水母蜇伤，即提前给药于可能遭遇水母损伤的人群，给药方式不限于口服、注射等。
发明的作用与效果
通过实验验证，小鼠蜇伤前10min给药能显著延长小鼠的生存时间并降低小鼠死亡率；明显减轻水母毒素引起的小鼠心脏功能指标、肝功能指标和肾脏功能指标的变化程度；通过对小鼠的转录组学分析发现小鼠蜇伤前10min给药能明显改善多脏器的联合损伤，减弱多脏器之间的炎症程度，为***或其衍生物预防水母蜇伤提供了新的理论依据。
此外，由于***是成熟的抗炎和免疫抑制剂，其商品名有醋酸***片等，其药理作用明确、毒副作用小，药物安全性已得到临床认可，本发明提供的***的新适应症可较快实现临床转化。另外，***的靶点“NF-kB通道”在不同组织中表达差异较小(目前报道主要高表达于肝脏、肾脏、肌肉、血管内皮等组织)，较其他抗炎而言，特异性较弱，而水母毒素为混合型化合物，特异性强的抗炎药物并不适用。因此，***在水母蜇伤造成的多脏器损伤的防护应用上具有巨大潜力，本发明也为预防水母蜇伤带来的损伤提供了新的临床药物。
附图说明
图1是***对蜇伤小鼠生存状况的影响结果图，其中，A为不同剂量***对老鼠24小时内生存率的影响结果图，B为***半数有效剂量结果图，用于衡量小鼠的生存情况。
图2为***对蜇伤引起的小鼠血液学影响的结果图。其中，A为损伤类相关酶指标中的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，肌酸激酶(creatine kinase，CK)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)的变化水平对比；B为损伤类相关酶指标中的丙氨酸转移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸转移酶(Aspartatetransferase，AST)的变化水平对比；C为总胆红素(total bilirubin，TBIL)，直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)，间接胆红素(indirectbilirubin，IBIL)的变化水平对比；D为总蛋白(total protein，TP)，白蛋白(albumin，ALB)，球蛋白(globulin，GLB)的变化水平对比；E为肌酐(creatinine，Cr)的变化水平对比；F为尿素氮(BUN)的变化水平对比。
图3***预注射后小鼠脏器信号通路变化比较图：A为心脏的差异信号通路变化比较图；B为肝脏的差异信号通路变化比较图；C为肾脏的差异信号通路变化比较图。
图4为***对蜇伤后小鼠各脏器炎症因子变化图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
实施例1：***能够改善小鼠蜇伤后的生存情况和死亡率
一、实验方法
选取ICR7周龄的雄性小鼠进行实验，将实验小鼠分为四大组：实验组DXMS-TE组(n＝12)、阳性对照组PBS-TE组(n＝12)、阴性对照组DXMS-PBS组(n＝12)、空白对照组PBS-PBS组(n＝12)。
称取小鼠质量并记录后，静脉按照计量0.5ml/10mg注射各分组的第一种对应试剂，10min后再次按照计量0.5ml/10mg注射分组的第二种对应试剂。每只小鼠先后总共注射两次，依次每组注射两只小鼠，分别放入两个装有20ml海水的带孔饭盒中，并记录注射时间。
四组应平行实验，按上述步骤重复六次。TE注射后持续观察24h，观察小鼠的中毒症状，记录小鼠死亡时间以及数量，使用GraphPadprism 7.00软件计算小鼠中位生存时间和生存曲线。
二、实验结果
结果显示，阳性对照组小鼠均出现了趴伏，颤抖，蹒跚等中毒症状，成功构建了DJES小鼠模型。实验组小鼠尽管也出现了中毒症状，但中毒程度明显轻于阳性对照组小鼠。
我们采用对DJES模型鼠尾静脉注射***的方法进行了毒理评价中的生存时间分析，发现注射高剂量的DXMS可以明显提高小鼠的降低小鼠的死亡率并且改善小鼠的生存状态(无明显的趴伏，颤抖，蹒跚等症状)。
小鼠的死亡中位时间与DXMS浓度成反比。提前对DJES小鼠注射DXMS后的表现可以分为：>3mg/kg，生存率>75％，有明显的拮抗作用；1～3mg/kg，生存率50％～75％，拮抗效果较小；～1mg/kg，几乎无拮抗效果，生存率15％～25％(图1A)；超过24h后所有小鼠都开始正常进食水，并逐渐恢复，不再出现死亡现象。最后通过测定梯度浓度下所对应的生存率求得了DXMS的半数有效剂量(IC50)＝1.005mg/kg(图1B)。
实施例2：***能够改善小鼠血液学指标的变化
一、实验方法：
为了验证***对对蜇伤后多脏器的血液指标影响，对蜇伤后的小鼠血液进行血生化分析。
选取ICR7周龄的雄性小鼠进行实验，将实验小鼠分为四大组：实验组DXMS-TE组(n＝6)、阳性对照组PBS-TE组(n＝6)、阴性对照组DXMS-PBS组(n＝6)、空白对照组PBS-PBS组(n＝6)。每组小鼠试剂注射8h后，眼眶取血至0.5％肝素钠溶液浸泡后的离心管中，3000r，离心10min，取上清液，立即采用SIEMENS试剂盒测定以下指标：
肝肾功能相关指标：总蛋白(total protein，TP)，白蛋白(albumin，ALB)，球蛋白(globulin，GLB)，总胆红素(total bilirubin，TBIL)，直接胆红素(direct bilirubin，DBIL)，间接胆红素(indirect bilirubin，IBIL)，肌酐(creatinine，Cr)，尿素氮(BUN)；损伤类相关酶指标：丙氨酸转移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸转移酶(Aspartate transferase，AST)，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)，肌酸激酶(creatine kinase，CK)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)。
二、实验结果
心脏功能指标中，PBS-TE组小鼠都显著高于空白对照组；DMXS-TE组LDH、CK和CK-MB都明显低于PBS-TE组，其中CK和CK-MB两项特异性心功能指标DXMS-TE小鼠要显著低于PBS-TE组(图2A)。
肝功能指标中，DXMS-TE组ALT、AST以及TBIL、DBIL、IBIL等显著低于PBS-TE组，且只略高于作为空白对照的PBS-PBS组；而PBS-TE组显著高于空白对照组(图2B和图2C)。对于TP，ALB和GLB，PBS-TE组明显低于空白对照组，其中TP为显著降低，而DXMS-PBS较PBS-TE明显升高，且GLB显著升高(图2D)。
肾功能指标中，DXMS-TE组sCre轻度高于阳性对照组，而阳性对照略高于空白对照组，有趣的是阴性对照组又相对于空白对照组明显下降(图2E)；BUN中，DXMS-TE组显著低于阳性对照组，但是高于空白对照组，而阳性对照组明显高于对于空白对照组和阴性对照组(图2F)。
上述结果表明，DXMS可以明显抑制和改善小鼠中毒症状，但无法完全逆转这一症状。
实施例3：***能够明显改善小鼠多脏器中多脏器的炎症指标的上升
一、实验方法：
进行实验分组，分为四大大组DXMS-TE组(n＝4)、DJES组(n＝4)、阴性对照组(n＝4)和空白对照组(n＝4)。分别采取各个组小鼠试剂注射8h后的肾脏、肝脏、心脏和皮肤样品，随后进行总RNA提取，经OligodT富集去除rRNA、链特异性cDNA文库构建以及IlluminaHiSeq4000测序仪测序等；所获得原始下机数据后的分析工作则包括FastQC软件评估测序质量、Hisat2软件比对参考基因组、StringTie软件估计转录本丰度、R软件Ballgown计算FPKM以及筛选差异基因等；进一步PCA分析、相关性分析、差异基因聚类分析、GO功能注释以及KEGG功能注释等则由康成生物的自定义程序Python/R/Shell等完成。
二、实验结果
病理切片和血液学指标中发现实验组多脏器的损伤症状较与阳性对照组显著减弱，而较与空白对照组仍有微弱损伤，因此我们采用多脏器转录组测序的方法来检测四组小鼠模型体内重要脏器基因水平的表达差异并分析其潜在的作用机理。
我们总共构建了48个样品的转录组，包括空白对照、阳性对照、阴性对照和对DJES模型预先注射DXMS四个大组，每个大组又包括心脏、肝脏和肾脏三个器官，每个器官n＝4。
DXMS-TE与阳性对照对比分析后，在心脏、肝脏和肾脏器官分别检测到29178，26675和29842个差异表达的基因。其中心脏上调表达的差异基因为13505个，下调表达的则为15673个；而肝脏中上调表达了14480个基因，下调表达了12195个基因；在肾脏中上调表达了19953个基因，下调表达了9889个基因。而实验组与空白对照相比较后在心脏、肝脏和肾脏器官分别检测到了28517，26710和30314个差异表达基因，其中心脏上调表达的差异基因为13409个，下调表达的则为15408个；而肝脏中上调表达了12685个基因，下调表达了14025个基因；在肾脏中上调表达了14657个基因，下调表达了15657个基因。
随后我们利用自动注释系统KAAS(KEGG自动注释服务器)对3个器官差异表达的基因进行了注释：其中相较于阳性对照组，心脏上差异表达基因注释到297条信号通路，肝脏中差异表达的基因注释到313条信号通路，肾脏中差异表达的基因共注释到302条信号通路。根据上调基因的富集程度中分别展示了实验组相较于阳性对照组心脏(图3A)、肝脏(图3B)和肾脏(图3C)的前15条差异富集的信号通路，例如TNF-signaling-pathway、IL-17-signaling-pathway、Toll-like-receptor-signaling-pathway、NF-kappa-B-signaling-pathway等且发现几乎都与炎症、免疫以及应激相关。
与此同时，对实验组和阳性对照组都与空白对照组进行差异基因分析，在先前实验中DJES模型组中检测到了33个多脏器共同上调的炎症相关基因，分析比较两组中这33个炎症因子在小鼠的心脏、肝脏和肾脏差异表达情况。发现实验组和阳性对照组中的炎症因子普遍都为上调，其中阳性对照组都为显著上调，而实验组的上***况大多数显著低于阳性对照组，特别是Tlr2和Pde4B分子还出现了下调的情况(Tlr2在肾脏中的差异倍数为-0.21，Pde4B在心脏和肾脏中的差异倍数为-0.01和-0.29)。但是仍有几个炎症因子与阳性对照组相差无几(差异倍数之差<1)，心脏中为S100a8、S100a9、Adamts4、Junb和Egr1，S100a9表达倍数超过了阳性对照组，肾脏中为Ccl5、S100a8、S100a9和Junb而肝脏中则为Cxcl1、Cxcl9、Serpina3f和Junb，其中Cxcl9和Serpina3f表达倍数超过了阳性对照组(图4)。
进一步开展实验组与阳性对照组的差异基因分析，发现DXMS注射后的小鼠脏器中，33个炎症因子显著下调，仅有个别炎症因子出现轻微上调的情况，在心脏中Retnlg和S100a9差异倍数为0.03和0.10，在肝脏中Cxcl9和Serpina3f差异倍数为0.06和0.15。提示预先注射DXMS后可明显拮抗和改善DJES模型中严重的炎症、免疫或者应激反应，且显著改善小鼠的存活率和生存状态，揭示了炎症反应在水母蜇伤全身中毒中发挥了重要的损伤作用。通过机理分析，DXMS通过抑制NF-kB信号通路的表达发挥抗炎作用，NF-kB信号通路在水母蜇伤全身中毒中可能发挥了重要的损伤作用，成为水母蜇伤全身中毒潜在的作用新机理。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。