阅读说明：本技术 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物及其应用 (Medicine for resisting novel coronavirus SARS-CoV-2 and its application ) 是由 王健伟 雷晓波 肖霞 任丽丽 王聪慧 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一系列抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物及其应用,体外细胞试验结果表明：所述的化合物能显著抑制SARS-CoV-2对正常细胞的侵染,在细胞水平对新型冠状病毒SARS-CoV-2有抑制作用,能显著降低病毒在细胞中的毒价,并抑制其在细胞中的增殖,且具有剂量依赖性。因此,可作为新型冠状病毒SARS-CoV-2抑制剂,具有治疗人感染该病毒后导致的COVID-19肺炎,或者动物感染后导致的其它疾病的潜力。(The invention discloses a series of medicines for resisting novel coronavirus SARS-CoV-2 and application thereof, and in vitro cell test results show that: the compound can obviously inhibit the infection of SARS-CoV-2 to normal cells, has an inhibiting effect on novel coronavirus SARS-CoV-2 at a cell level, can obviously reduce the virus price of the virus in the cells, and inhibits the proliferation of the virus in the cells, and has dose dependence. Therefore, the compound can be used as a novel coronavirus SARS-CoV-2 inhibitor, and has the potential of treating COVID-19 pneumonia caused by human infection with the virus or other diseases caused by animal infection.)

抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物及其应用

技术领域

本发明属于病毒学领域和药物化学领域，具体是涉及抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2 病毒复制的化合物，该化合物抑制SARS-CoV-2病毒复制的机制，以及该化合物在预防和治疗与SARS-CoV-2病毒引起的相关疾病，尤其是与炎症，自身免疫相关疾病上的用途。

背景技术

新型冠状病毒SARS-CoV-2与中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV，严重急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV同属于冠状病毒科，冠状病毒(Coronavirus，CoVs)为有包膜的单股正链RNA病毒，其基因组长大约为26000-32000bp，是目前已知的最大的RNA病毒。

截止2020年5月13日，全球新冠肺炎确诊病例约420多万例，死亡约29万例。导致死亡率过高的因素之一是缺乏有效的治疗方案。目前人们迫切需要有效的抗病毒药物来对抗SARS-CoV-2的感染，这不仅可以减轻患者的疾病负担，而且可以降低患者感染他人的风险。而开发新型的药物需要数年的时间来确定其安全性和有效性，这对于在短期内控制 SARS-CoV-2的感染来说可能并不实际。因此最快捷的方式是从FDA上市药物中筛选抵抗 SARS-CoV-2感染的药物。目前，已在广泛应用抗病毒药物如：沙奎那韦(saquinavir)、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)和洛匹那韦 (lopinavir)主要用于人类免疫缺乏病毒(HIV)，一种导致获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及其相关病变的病原性反转录病毒。吉利德科学公司研发的抗埃博拉病毒的试验药物瑞德西韦 (remdesivir)，可抑制RNA合成酶(RdRp)，有希望抑制COVID-19冠状病毒。因此，目前迫切需要找到更多安全、有效的治疗冠状病毒的药物。然而，上述药物具有毒副作用，可能对病人本身造成不必要的损伤，因此寻找一种毒性小的抗SARS-CoV-2药物成为治疗COVID-19 急需的解决方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对上述存在的问题，提供一种避免有严重毒副作用的药物的使用，且具有稳定效果的治疗COVID-19方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物组合物，所述药物可以抑制SARS-CoV-2病毒的复制，所述药物包括有效量的Amlodipine Besylate、Fendiline HCl、DronedaroneHCl、 Trifluoperazine 2HCl、Tetrandrine、Conivaptan HCl、Nilotinib、Vandetanib(ZD6474)、Clofazimine、 Sertraline HCl、Thioridazine HCl、Celecoxib、Vortioxetine、Monensin sodium salt、Actidione、Raloxifene HCl、Temsirolimus(CCI-779,NSC683864)、Salifungin中的一种或多种。

进一步的，这种药物组合物中的有效成分还可以为上述化合物的缀合物，所述缀合物是为了施用治疗分子或并入标记，其实例包括但不限于烷基、烯基、炔基、酰氨基、氨基、醚、硫醚、酯、亚烷基、杂亚烷基、芳基或杂环基，其各自均可如本领域所公知的任选取代的。

进一步的，本发明提供上述药物组合物在制备治疗或预防新型冠状病毒的药物中的用途，其中所述冠状病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV。

进一步的，本发明提供一种药物组合物在制备治疗或预防冠状病毒的药物中的用途，所述组合物为Amlodipine Besylate、Fendiline HCl、Dronedarone HCl、Trifluoperazine 2HCl、 Tetrandrine、Conivaptan HCl、Nilotinib、Vandetanib(ZD6474)、Clofazimine、Sertraline HCl、 Thioridazine HCl、Celecoxib、Vortioxetine、Monensin sodium salt、Actidione、Raloxifene HCl、 Temsirolimus(CCI-779,NSC683864)、Salifungin中的一种或多种；

进一步的，本发明提供一种药物组合物在制备治疗或预防感染病毒后导致的COVID-19肺炎的药物中的用途，所述组合物为Amlodipine Besylate、Fendiline HCl、Dronedarone HCl、Trifluoperazine 2HCl、Tetrandrine、Conivaptan HCl、Nilotinib、Vandetanib(ZD6474)、Clofazimine、Sertraline HCl、Thioridazine HCl、Celecoxib、Vortioxetine、 Monensin sodium salt、Actidione、Raloxifene HCl、Temsirolimus(CCI-779,NSC 683864)、 Salifungin中的一种或多种。

优选的，所述组合物为Nilotinib、Clofazimine、Celecoxib、Actidione、Raloxifene HCl 中的一种或多种。

优选的，所述组合物中还包括至少一种选自抗病毒剂、皮质类固醇、免疫调节剂、血管活性药物和治疗病毒感染和/或由病毒感染引起的疾病和已知药物的治疗剂，优选的，其中所述的治疗剂是抗病毒剂优选的，其中所述的治疗剂是免疫调节剂；

优选的，治疗剂选自干扰素，咪喹莫特，瑞喹莫德，鬼臼脂素，博来霉素和类视黄醇；

优选的，其中所述的治疗剂选自干扰素-α、洛匹那韦、利诺那韦、利巴韦林、磷酸氯喹、阿比多尔；

优选的，所述组合物中还包括至少一种选自镇咳药，粘液溶解药，祛痰药，退热药，镇痛药和鼻减充血剂；

优选的，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV。

进一步，本发明提供一种药物组合物在制备治疗或预防感染病毒后导致的COVID-19 肺炎的药物中的用途，其中包括给予有效量的上述药物组合物和/或其药学上可接受的盐，多晶型物，溶剂合物，水合物，代谢物，前药或非对映异构体形式；优选的，包含在药学上可接受的载体。

进一步，上述的药物组合物经口服，胃肠外，静脉内，肌内，透皮，经由口腔途径，皮下或通过栓剂。

发明效果

本发明的积极效果在于在细胞水平内证明了Amlodipine Besylate、FendilineHCl、 Dronedarone HCl、Trifluoperazine 2HCl、Tetrandrine、Conivaptan HCl、Nilotinib、Vandetanib (ZD6474)、Clofazimine、Sertraline HCl、Thioridazine HCl、Celecoxib、Vortioxetine、 Monensin sodium salt、Actidione、Raloxifene HCl、Temsirolimus(CCI-779,NSC 683864)、 Salifungin等18种FDA上市药物可以有效的抑制SARS-CoV-2病毒的复制，这些化合物可以直接成为治疗SARS-CoV-2的药物。

体外细胞试验结果表明：上述18种药物及其组合物对Vero正常细胞的毒性作用很小，但是能显著抑制SARS-CoV-2病毒对正常细胞的侵染，在细胞水平对新型冠状病毒SARS-CoV-2有抑制作用，能显著降低病毒在细胞中的毒价，并抑制其在细胞中的增殖，且具有剂量依赖性。

因此，上述18种药物及其组合物可作为新型冠状病毒SARS-CoV-2的复制抑制剂，具有治疗人感染该病毒后导致的COVID-19肺炎，或者动物感染后导致的其它疾病的潜力，同时还具有安全性高，毒副作用小等优点。

附图说明

图1化合物对Vero细胞中SARS-CoV-2病毒复制的抑制，其中，(a)AmlodipineBesylate、 (b)Fendiline HCl、(c)Dronedarone HCl、(d)Trifluoperazine 2HCl、(e)Tetrandrine、(f) Conivaptan HCl、(g)Nilotinib、(h)Vandetanib(ZD6474)、(i)Clofazimine、(j)Sertraline HCl、 (k)Thioridazine HCl、(l)Celecoxib、(m)Vortioxetine、(n)Monensin sodium salt、(o)Actidione、 (p)Raloxifene HCl、(q)Temsirolimus(CCI-779,NSC 683864)、(r)Salifungin

具体实施方式

非洲绿猴肾细胞Vero购自ATCC；SARS-CoV-2病毒由样本中分离；一步法绝对定量PCR酶Fast Virus 1-Step Master Mix(4444434)，Trizol LS购自Thermo；核酸提取试剂盒Direct-zol^TMRNA MiniPrep(R2052)购自Zymo Research；CCK8试剂盒(40203)购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.上清中RNA提取

按照核酸提取试剂盒说明书操作，具体如下：

1)在加入Trizol LS的样品中加入等体积的无水乙醇，混匀后将液体转移到Zymo-Spin^TM IICR柱上，该柱子放置在收集管上，10000g离心1min

2)将Zymo-Spin^TM IICR柱转移到新的收集管上

3)在Zymo-Spin^TM IICR柱中加入400μl的Direct-zol^TM RNA PreWash，10000g离心1min，弃掉流穿液后，重复该步骤

4)在Zymo-Spin^TM IICR柱中加入700μl的RNA Wash Buffer，10000g离心2min

5)将Zymo-Spin^TM IICR柱转移到干净的EP管上，加入50μl的无核酸酶的水，10000g离心1min

6)RNA样品可直接用于后续实验或是冻于-80℃冰箱

2.绝对定量PCR

将RNA标准品进行10倍稀释，1×10⁹，1×10⁸，……1×10⁴，每组样品重复两孔

绝对定量PCR体系

Fast Virus 1-Step Master Mix(4×)	5μl
		引物1(50μM)	0.1μl
引物2(50μM)	0.1μl
		探针(20μM)	0.1μl
核酸	5μl
		水	9.4μl

PCR扩增程序：50℃，15min，95℃，3min；95℃，15s，60℃，45s+Plate Read，共50 个循环

扩增过程及荧光信号检测、数据的存储和分析均由荧光定量PCR仪及自带软件完成。

3.细胞活性检测

1)在96孔板中接种Vero细胞，37℃，5％CO₂培养箱培养过夜

2)向培养板中加入不同浓度的药物(30，10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04，0.014μM)

3)将培养板在培养箱孵育24h

4)向每孔中加入10μl的CCK8溶液(注意不要在孔中生产气泡，它们会影响OD值的读数)

5)将培养板在培养箱内孵育1-4h

6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度

7)若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCl溶液或者1％W/V SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基(除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算

细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100

A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度

A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度

A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度

细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

Vero细胞加入不同浓度(30，10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04，0.014μM)的待测化合物，于37℃，5％CO₂孵箱处理1h，之后加入0.1MOI的SARS-CoV-2病毒，继续37℃培养1h。随后利用空白培养基洗细胞一遍，并加入上述还有不同浓度的(30，10，3.33，1.11，0.37，0.12， 0.04，0.014μM)待测化合物，继续培养至病毒感染24h后，提取培养上清的RNA，并利用绝对定量PCR检测病毒拷贝数的变化，以0.014μM待测化合物处理的病毒拷贝数为最大感染值，其他浓度的拷贝数除以0.014μM组的拷贝数，得到病毒复制比例。利用graphpad 7.0软件对数据进行非线性拟合(％inhibition)，得到待测化合物的IC₅₀。

Vero细胞加入不同浓度(30，10，3.33，1.11，0.37，0.12，0.04，0.014μM)的待测化合物，于37℃培养24h，之后利用CCK8试剂盒对细胞活性进行检测。利用graphpad 7.0软件对数据进行非线性拟合(％cell viability)，得到待测化合物的CC₅₀。

通过SI＝CC₅₀/IC₅₀(CC50：cytotoxicity concentration，使50％细胞死亡时的药物浓度 IC50：inhibition concentration，半数抑制浓度)，计算获得结果，具体数据如表1所示。

表1抑制SARS-CoV-2的药物的汇总

从数据中可以看出：对本领域技术人员而言，在药物的筛选过程中SI数值越高说明药物毒性越低，在筛药实验中SI一般大于10比较好，而上述药物中Nilotinib、Clofazimine、 Celecoxib、Actidione、Raloxifene HCl的SI都要远远的大于10，说明了上述几种药物有显著的药物应用前景，可以对其进行进一步的研究。

同时，从图1的结果中可以看出，随着加入化合物浓度增加，病毒毒价降低，呈剂量依赖性，给药物的制备提供了考量思路。若想让药物应用到临床上，其中一点就是药物本身的毒性要低，不会给人体带来太大的负作用。其中CC50越高，说明使50％细胞死亡的药物浓度越高；IC50越低，说明抑制效率达到50％的药物浓度越低；所以CC50越高，IC50越低，SI的值就越高，药物毒性就越低。

从表1分析可知，对于冠状病毒感染有效的药物属于广泛的药物治疗范畴，包括用于治疗神经性疾病、激素、离子通道、酶和一些抗菌剂等。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本发明欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本发明中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。