基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒
阅读说明：本技术 基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒 (miRNA chemiluminescence detection kit based on constant-temperature enzyme-free multistage amplification ) 是由 王慧敏 杨慧然 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒,通过核酸互补杂交,目标miRNA特异性地打开发卡探针,发生催化发卡自组装反应,生成大量双链DNA产物,双链产物继续引发杂交链式反应,形成含有多个G-四链体的DNA纳米线,G-四链体与氯化血红素结合形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的G-四链体/氯化血红素DNAzyme。在过氧化氢的存在下,DNAzyme催化鲁米诺的氧化反应,产生多级扩增的化学发光信号。本发明试剂盒可以检测低至16 pM的miRNA；该检测方法无需荧光基团修饰、外部光源和蛋白酶介入,通过多级扩增反应即可有效提高miRNA检测的灵敏度,从而解决了现有检测方法由于自发荧光、荧光漂白、串光以及稳定性低导致的灵敏度有限的难题。(The invention discloses a miRNA chemiluminescence detection kit based on constant-temperature enzyme-free multistage amplification, wherein a hairpin probe is specifically opened by a target miRNA through nucleic acid complementary hybridization to generate a catalytic hairpin self-assembly reaction to generate a large amount of double-strand DNA products, the double-strand products continuously initiate a hybridization chain reaction to form a DNA nanowire containing a plurality of G-quadruplexes, and the G-quadruplexes are combined with hemin to form a G-quadruplex/hemin DNAzyme with horseradish peroxidase-like catalytic activity. In the presence of hydrogen peroxide, DNAzyme catalyzes the oxidation reaction of luminol, producing a multi-stage amplified chemiluminescent signal. The kit can detect miRNA with the size of 16 pM; the detection method does not need fluorescent group modification, external light source and protease intervention, and can effectively improve the sensitivity of miRNA detection through multistage amplification reaction, thereby solving the problem of limited sensitivity caused by autofluorescence, fluorescence bleaching, cross-luminescence and low stability of the existing detection method.)
技术领域
本发明属于分子生物学和医学检测领域，具体涉及到一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在细胞内具有多种重要的调节作用，其异常表达与癌症的进程密切相关，可以作为肿瘤标志物，为癌症的早期诊断、预后和相关生物学功能研究提供重要信息。
然而，由于miRNA序列短、含量低、同源性高等特点，限制了miRNA的检测应用。因此，发展高灵敏度、高特异性的miRNA检测方法对实现癌症的早期诊断具有重要意义。核酸扩增技术是生物学和医学等领域的一项重要技术，广泛应用于目标物检测，可以对一些特异性的病原体或疾病标记物进行识别。其中，恒温无酶核酸扩增技术对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，且反应条件也不受酶反应环境的制约，主要包括催化发夹自组装(CHA)、杂交链式反应(HCR)和核酸酶(DNAzyme)介导的反应，适用性更强，相比于传统检测手段，该试剂盒更简单灵敏。但是目前还没有一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒，其中，所述miRNA-21的序列如表1所示，具体为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA。
基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒由DNA粉末、反应底物和缓冲溶液组成，所述的DNA粉末包括发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7，具体序列如下：
H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6，
和/或H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
所述的反应底物包括氯化血红素、鲁米诺和过氧化氢溶液；
所述的缓冲溶液为HEPES缓冲液(10mM HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，含有600mM氯化钠和50mM氯化钾)。
发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
作为优选方案，所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒检测miRNA-21的方法，包括如下步骤：
(1)用HEPES缓冲溶液分别将发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7粉末配制为100μM溶液，震荡分散均匀，然后分别退火，再按摩尔浓度比进行混合，加入目标物miRNA-21，共同孵育12小时，再加入氯化血红素溶液，孵育1小时得到反应液，然后将反应液稀释20倍；
(2)向稀释20倍的反应液中加入鲁米诺溶液后，置于发光杯中，快速注入过氧化氢溶液，通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，实现对miRNA-21的检测；
所述的H1核酸分子序列如SEQ ID NO：1，
H2核酸分子序列如SEQ ID NO：2，
H3核酸分子序列如SEQ ID NO：3，
H4核酸分子序列如SEQ ID NO：4，
H5核酸分子序列如SEQ ID NO：5，
H6核酸分子序列如SEQ ID NO：6，
和/或H7核酸分子序列如SEQ ID NO：7。
步骤(1)中发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为1-2：1-2：6-7：8-9：7-8：8-9：0.3-0.8。
作为优选方案，所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8；或者所述的发卡H1、发卡H2、发卡H3、发卡H4、发卡H5、发卡H6、发卡H7的摩尔浓度比为2：2：6：8：7：8：0.5。
本发明的又一技术方案是将所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒在制备检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量的药物上的应用。
所述的基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒通过检测细胞裂解液中的miRNA-21的含量在制备区分肿瘤细胞与正常细胞的药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括HepG2、或HL-7702细胞。
本发明具有以下优点：本发明的试剂盒中，miRNA-21能引发上游CHA反应，生成的产物能够继续引发下游HCR，同时激活DNAzyme，产生多重级联放大的化学发光信号，具有稳定性好、灵敏度高和特异性强的优点。当存在miRNA-21时，能形成含有多个G-四链体结构的DNA纳米线，与氯化血红素复合后，大大提高催化活性；另外，基于核酸纳米结构的限域化作用，还能大大增加了反应物的利用率。本发明试剂盒不需外部激发光源，可以避免自发荧光、荧光漂白和串光等问题，具有较低的背景信号；本发明试剂盒所使用的发卡探针不需经过荧光基团修饰，大大减低检测成本；本发明试剂盒基于恒温无酶多级串联CHA-HCR-DNAzyme核酸扩增反应，能够有效提高miRNA检测的特异性和灵敏性，为癌症的早期诊断、治疗和预后判断提供高效的新方法。通过改变功能发卡H7的序列，也可以对其他核酸、蛋白等生物分子进行检测。
表1：文中所涉及核酸分子的序列
附图说明
附图1为本发明检测目标物的原理图。
附图2为CHA与HCR比值优化图。
附图3为机理验证图。
附图4为优化发卡H3浓度图。
附图5为优化发卡H5浓度图。
附图6为优化发卡H1浓度图。
附图7为CHA-HCR-DNAzyme、CHA-DNAzyme及HCR-DNAzyme的信号扩增效果图。
附图8为基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒对不同浓度miRNA-21的检测图。
图9为基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒对不同细胞裂解液中miRNA-21的检测图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
本发明的实施例中所用到的各试剂如下：
HEPES：购自Sigma，99.5％；
HEPES钠盐：购自Sigma，96％；
氯化钠：购自Sigma，99％；
氯化钾：购自国药集团化学试剂有限公司，含量≥99.5％；
鲁米诺：购自Sigma，≥97％(HPLC)；
氯化血红素：购自Sigma，≥97％(HPLC)；
30％过氧化氢溶液：购自成都市科隆化学品有限公司；
二甲亚砜：购自国药集团化学试剂有限公司；
DEPC水：多聚甲醛和焦碳酸二乙酯处理过的水，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
HEPES缓冲液(10mM HEPES缓冲溶液，pH＝7.5，含有600mM氯化钠和50mM氯化钾)配制方法：称取0.834g HEPES、0.2603g HEPES钠盐、17.49g氯化钠、1.8638g氯化钾于烧杯中，加入DEPC水溶解后定容至500mL，然后在25℃条件下用1M的氢氧化钠溶液调pH至7.5；
DNA母液(100μM)的配制方法：DNA粉末经TE buffer(pH＝8.0)按照DNA管上标签提示量溶解，-20℃保存。
氯化血红素溶液(4μM)的配制方法：称取0.0326g氯化血红素粉末溶于5mL二甲亚砜，得到10mM的氯化血红素溶液，用二甲亚砜逐级稀释至4μM即可；
鲁米诺溶液(250μM)的配制方法：称取0.025g鲁米诺粉末溶于2.5ml浓氨水中，再加入25ml DEPC水进行稀释，得到5mM鲁米诺溶液，再取1μL 5mM鲁米诺溶液加入19μLHEPES溶液，得到250μM的鲁米诺溶液；
H2O2溶液(1.5mM)的配制方法：取2μL 30％H2O2溶液溶于17.58μL HEPES溶液中，得到1M的H2O2溶液，取1μL 1M的H2O2溶液溶于9μL HEPES溶液中，得到100mM的H2O2溶液，最后取1.8μL 100mM的H2O2溶液溶于118.2μL HEPES溶液中，即可得到浓度为1.5mM的H2O2溶液。
发卡探针的设计构思如下：运用NUPACK软件设计相关发卡探针，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成相关核酸序列。附图1为多级扩增反应用于目标物检测的原理图，目标物I首先通过链置换反应打开发夹H1得到I-H1中间体，随后发夹H2取代I-H1中的I，生成产物H1-H2，取代下来的I继续参与H1和H2的反应生成多个双链产物H1-H2。产物H1-H2使T的两部分序列靠近，从而引发下游HCR。T通过链置换反应，依次打开发夹H3、H4、H5和H6，生成中间产物T-H3-H4-H5-H6，并露出与T相同的序列，继续引发发夹的依次打开，最后生成长的双链DNA纳米线，即T-(H3-H4-H5-H6)N。DNA纳米线能够拉近修饰在发夹H3和H5上的两部分G4序列的距离，形成完整的G4，加入hemin之后，形成具有类辣根过氧化物酶催化活性的G4/hemin DNAzyme，在过氧化氢的存在下，DNAzyme催化鲁米诺发光，且发光强度与目标物浓度呈正相关，通过此种方法达到检测目标物的目的。
实施例1
为了提高信号放大效果，对DNA孵育溶液中CHA(包括发卡H1、H2)和HCR(包括发卡H3、H4、H5、H6)反应物的浓度比值进行优化。具体为CHA和HCR的发卡反应物浓度比值为4：1、2：1、1：1、1：2、1：4。
首先将1μL单个发卡母液与15.67μL HEPES缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μM的单个发卡溶液，再通过PCR仪在95℃保持5min、25℃保持2h的条件下分别进行退火。
然后，按照不同的浓度比值将反应物发卡混合，例如，CHA和HCR浓度比值为4：1时的具体操作为，取5.83μL的发卡H1和H2，以及1.46μL的发卡H3、H4、H5和H6，加入25μL HEPES缓冲液，得到CHA和HCR浓度比值为4:1的核酸孵育液。其他比例关系依此进行换算，不同CHA和HCR发卡浓度比的核酸孵育液与1.25μL I(可以引发CHA反应和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)共孵育12小时，加入9.85μL浓度为4μM的氯化血红素溶液，1小时后得到含有G-四链体/氯化血红素DNAzyme的反应液，将反应液稀释20倍，向稀释20倍的反应液中加入13.13μL浓度为250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL浓度为1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。试验结果如图2所示，通过对比不同CHA和HCR发卡浓度比值下的信背比，发现当比值为1:4时，信背比最大，所以最终确定1:4为最优的CHA和HCR发卡浓度比值。
实施例2
本实施例设计了反应体系中依次缺少单个发卡的对照实验，检测不同实验组产生的化学发光信号，方法及各原料的量同实施例1。
实验结果如附图3所示。当从上游CHA中去掉发夹H1或H2，或者从下游HCR中去掉发夹H3、H4和H5时，目标物引发的反应荧光均较低，证明上游CHA或者下游HCR被阻断时，CHA-HCR-DNAzyme无法发生信号放大。当从下游HCR中去掉发夹H6时，目标物引发的反应会产生较小的荧光，这是由于此时的反应等同于CHA反应，缺发夹H6的HCR只能作为信号输出工具，而不再放大信号。同样的，在无目标物的缺发夹体系中荧光也较低。由此说明CHA-HCR-DNAzyme反应只能在上游CHA和下游HCR的反应物共同存在时，加入目标物之后，才能产生多级放大的化学发光信号。
实施例3
本实施例对发卡浓度进行了优化。通过缺发卡试验，得出发卡H1、H3和H5产生的背景信号较大，进一步优化H1、H3或H5单个发卡的浓度，得到最佳反应浓度，具体操作步骤及其他试剂的量均同实施例1。具体调节内容如下：
H3：500nM、600nM、700nM、800nM，结果如图4所示。
H5：500nM、600nM、700nM、800nM，结果如图5所示。
H1：50nM、100nM、150nM、200nM，结果如图6所示。
通过改变上述H1、H3、H5的发卡浓度，发现当发卡H1为200nM、H3为600nM及H5为700nM时的信背比最高，所以最终确定核酸孵育液中，发卡H1、H2、H3、H4、H5和H6的浓度依次为200nM、200nM、600nM、800nM、700nM、800nM。
实施例4
为了验证多级信号扩增效果以及检测能力，我们通过设计了二级CHA-DNAzyme和HCR-DNAzyme反应，将其与多级CHA-HCR-DNAzyme反应的检测效果进行比较。
多级CHA-HCR-DNAzyme反应由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成。所述DNA孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6和18.43μL HEPES缓冲液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。取1μL 100μM的单个发卡母液，与15.67μL HEPES缓冲液混合均匀后，得到浓度为6μM的单个发卡溶液。将6μM的单个发卡溶液通过PCR仪在温度为95℃保持5min、25℃保持2h的条件下进行退火。退火之后按照上述发卡体积进行混合，混合后加入1.25μLI(可以引发CHA-DNAzyme反应和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)，最终保证在整个核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM和H6为800nM。6个发卡与I共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，反应1h后得到反应液，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。
实施例4-1
为证明该检测试剂盒具有较高的灵敏性和放大效果，将其与其它两种试剂盒做对比：即基于二级CHA-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为I(能够引发CHA-DNAzyme和CHA-HCR-DNAzyme反应的目标物)，由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的DNA孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5和24.26μL HEPES缓冲溶液；发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的miRNA化学发光检测试剂盒相同。
实施例4-2
基于二级HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒：目标物为T(能够引发HCR-DNAzyme反应的目标物)，由42.5μL的DNA孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的DNA孵育溶液包括4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6和21.35μL HEPES缓冲溶液，发卡退火浓度及反应底物溶液与基于恒温无酶多级核酸扩增反应的miRNA化学发光检测试剂盒相同。
实施例4、实施例4-1、实施例4-2三种试剂盒对不同浓度的目标物的检测结果如附图7所示，实施例4中的测试剂盒相比于其它两种检测试剂盒，可以检测更低浓度的目标物，且对同一浓度的目标物检测时，信号放大效果更明显，如图所示，在目标物浓度为5nM时，基于二级CHA-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有2300左右，基于二级HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度只有1600左右，而基于多级CHA-HCR-DNAzyme核酸扩增反应的化学发光检测试剂盒的化学发光强度有6800左右，证明本发明所设计的多级扩增试剂盒的信号扩增效果更好，而且，通过线性曲线计算可得，CHA-DNAzyme、HCR-DNAzyme和CHA-HCR-DNAzyme的检测限分别为0.41nM、2.67nM和0.021nM，明显可以看出，本发明所设计的多级扩增试剂盒的检测灵敏度更高。
实施例5
一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒用于溶液中miRNA-21的检测。
所述试剂盒由43.75μL的核酸孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6、2.19μL发卡H7、1.25μL miRNA-21和16.24μL HEPES缓冲溶液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。发卡H1-H6在浓度为6μM时、发卡H7在浓度为1μM时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再加入1.25μL不同浓度的miRNA-21，保证在核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM、H6为800nM、H7为50nM。发卡与miRNA-21共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号。该检测试剂盒的检测效果如附图8所示，化学发光强度与miRNA-21浓度呈现良好的线性关系，在miRNA-21浓度为0-100pM范围内，得到线性曲线为y＝11738.11795+29.7558*x(R2＝0.9939)，计算出检测限为16pM，能够通过检测化学发光强度来计算样品中miRNA-21的浓度，从而实现miRNA-21的高灵敏检测。
实施例6
一种基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒用于细胞中miRNA-21的检测。
用胰酶分别将2×106个人肝癌细胞(HepG2)和人正常肝细胞(HL-7702)消化，分散在1mL的PBS溶液中，在1000rpm下离心5min，除去PBS溶液，将细胞重新分散在250μL的Tris-HCl溶液中，通过超声波细胞粉碎机在0℃下粉碎20min，最后在4℃下，12000rpm离心20min，得到的上清液为细胞裂解液。
所述试剂盒由43.75μL的核酸孵育溶液和131.25μL的反应底物溶液组成；所述的核酸孵育溶液包括1.46μL发卡H1、1.46μL发卡H2、4.38μL发卡H3、5.83μL发卡H4、5.11μL发卡H5、5.83μL发卡H6、2.19μL发卡H7、1.25μL miRNA-21和16.24μL HEPES缓冲溶液；131.25μL的反应底物溶液包括9.85μL氯化血红素溶液、13.13μL鲁米诺溶液和108.27μL过氧化氢溶液。发卡H1-H6在浓度为6μM时、发卡H7在浓度为1μM时进行退火，退火条件为95℃保持5min、25℃保持2h，退火之后按照上述发卡体积进行混合，再分别加入1.25μL不同细胞裂解液，保证在核酸孵育液中发卡H1和H2浓度为200nM，发卡H3为600nM、H4为800nM、H5为700nM、H6为800nM、H7为50nM。发卡与细胞裂解液共孵育12h后，加入4μM的氯化血红素溶液，室温下反应1h，将反应液稀释20倍，再加入13.13μL的250μM的鲁米诺溶液，混合均匀后放入发光杯中，随后注入108.27μL的1.5mM的过氧化氢溶液，立即通过微弱化学发光测量仪检测化学发光信号，不同细胞内化学发光强度如图9所示。通过实施例5中的线性曲线(图8)换算得到HepG2和HL-7702细胞中的miRNA-21的浓度分别为92.3pM和19.8pM，HepG2细胞中的miRNA-21比HL-7702细胞中的高，因此，该试剂盒能够通过检测化学发光强度来计算细胞中miRNA-21的浓度，通过细胞中miRNA-21含量的不同为区分癌细胞和正常细胞提供一定的数据支撑。
SEQUENCE LISTING
SEQUENCE LISTING
<110> 三峡大学
<120>基于恒温无酶多级扩增的miRNA化学发光检测试剂盒
<160> 10
<210> 1
<211>54
<212> RNA
<213> H1
<400> 1
CTCTATCATTATCTTGCTTCATCTTCATCAAGATAATGATAGAGACCGACACTC
<210> 2
<211>53
<212> RNA
<213> H2
<400> 2
GCTTCATCTTCATCTTCTCTATCATTATCTTGATGAAGATGAAGCAAGATAAT
<210> 3
<211>60
<212> RNA
<213> H3
<400> 3
GAGTGTCGGAGATGAAGATGAAGCCATCGTGCTTCATCTTCATCTCCGTGGGTAGGGCGG
<210> 4
<211>48
<212> RNA
<213> H4
<400> 4
GCTTCATCTTCATCTCCGGTTTTGCGGAGATGAAGATGAAGCACGATG
<210> 5
<211>54
<212> RNA
<213> H5
<400> 5
GTGGGTCAAAACCGGAGATGAAGATGAAGCTTGCCTGCTTCATCTTCATCTCCG
<210> 6
<211>48
<212> RNA
<213> H6
<400> 6
GCTTCATCTTCATCTCCGACACTCCGGAGATGAAGATGAAGCAGGCAA
<210> 7
<211>62
<212> RNA
<213> H7
<400> 7
TCAACATCAGTCTGATAAGCTAAGAGTGTCGGTCTCTATCATTATCTTAGCTTATCAGACTG
<210> 8
<211>25
<212> RNA
<213> I
<400> 8
GAGTGTCGGTCTCTATCATTATCTT
<210> 9
<211>24
<212> RNA
<213> T
<400> 9
GCTTCATCTTCATCTCCGACACTC
<210> 10
<211>24
<212> RNA
<213> miR-21
<400> 10
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA