阅读说明：本技术 一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法 (Preparation method of compound natural preservative for chilled donkey meat ) 是由 章海风 吴丹枫 周晓燕 李春梅 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种冷鲜驴肉复配保鲜剂的制备方法,本发明采用天然抑菌剂和天然抗氧化剂,以抑菌效果较好的生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z为天然抑菌剂,进行复配优化,确定最佳配比；同时用抗氧化效果较好的抗坏血酸、迷迭香醇提物和白藜芦醇为天然抗氧化剂,进行复配优化,确定最佳配比；综合得到最佳复配保鲜剂配比。现代食品保鲜剂通常是合成化学品,如山梨酸钾、苯甲酸盐、丁基羟基茴香醚(BHA)和乳酸钠,且合成食品添加剂的健康风险低于监管机构定义的建议限值。天然保鲜剂由于其抑菌效果和在人体中具有更好的耐受性,因此越来越受消费者喜爱。许多香料如丁香和生姜等已被实验证明具有抗病原菌和腐败菌的活性。(The invention relates to a preparation method of a compound preservative for chilled fresh donkey meat, which adopts a natural bacteriostatic agent and a natural antioxidant, takes ginger alcohol extract, clove alcohol extract and Nisin Z with better bacteriostatic effect as the natural bacteriostatic agent, carries out compound optimization and determines the optimal proportion; simultaneously, ascorbic acid, rosemary alcohol extract and resveratrol with good antioxidant effect are used as natural antioxidants for compounding optimization, and the optimal proportion is determined; the optimal compounding ratio of the preservative is comprehensively obtained. Modern food preservatives are typically synthetic chemicals such as potassium sorbate, benzoate, Butylated Hydroxyanisole (BHA) and sodium lactate, and the health risks of synthetic food additives are below regulatory agency-defined recommended limits. The natural preservative is more and more popular with consumers due to the bacteriostatic effect and better tolerance in human bodies. Many flavors such as clove and ginger have been experimentally demonstrated to have activity against pathogenic and spoilage bacteria.)

一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法，属于食品生物保鲜技术领域。

背景技术

驴肉是高蛋白质、低饱和脂肪酸、富含维生素和矿物质的营养食品。驴肉产品比传统的牛肉和猪肉产品显示出更低的饱和脂肪酸、更高的多不饱和脂肪酸含量。从营养学和食品学的角度来看，驴肉是集药、补、食于一体的食材。近年来深受消费者欢迎，但是在分割、运输、储藏及销售等过程中易被微生物感染。目前食品工业常采用添加适量的化学防腐剂来延长肉类的货架期。随着研究的深入发现，几乎所有的化学防腐剂对人类的健康都存在潜在的危害。

目前一些植物可以作为天然保鲜剂来防止食物的腐败变质，天然保鲜剂在人体中具有更好的耐受性，相较于化学合成品更健康，更符合消费者的需求。复配抑菌剂的理论基础依于栅栏效应，单一防腐剂虽然有很好的抑菌性能，但抑菌谱各有侧重，将不同抑菌剂科学合理复配，对不同的细菌进行多靶攻击，发挥复配抑菌剂的协同作用，达到保鲜的目的。复配天然抗氧化剂在不同肉类食品中显现出卓越的抗氧化性能，有效延迟肉类脂质和蛋白质氧化以及改善肉制品的感官特性方面。

发明内容

本发明的目的在于开发驴肉的保鲜技术，推广冷鲜驴肉市场，克服化学合成保鲜剂存在的缺陷和不足，通过16S rDNA鉴定冷鲜驴肉的腐败菌，结合微量酶标仪法、抗氧化能力单因素实验、感官评定和响应面优化等方法，得到一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法，该保鲜剂能有效抑菌和防止驴肉氧化，保护冷鲜驴肉的营养品质，有效延长保质期，达到安全又保鲜的目的。

本发明的目的是这样实现的，一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

步骤1)、驴肉优势腐败菌鉴定：将冷鲜驴肉样品真空包装于灭菌后的食品级PE包装袋中，于4℃冷藏储存至15d，驴肉腐败变质后，测得驴肉的腐败菌相中含有乳酸菌、假单胞菌、肠杆菌、热死环丝菌，且乳酸菌、假单胞菌、肠杆菌、热死环丝菌分别占腐败菌相的54.81％、34.07％、5.19％、4.81％；将乳酸菌、假单胞菌、肠杆菌、热死环丝菌菌种分离纯化进行16S rDNA鉴定，冷鲜驴肉的腐败优势菌为清酒乳杆菌(G⁺)和荧光假单胞菌(G^-)，4种肠杆菌为哈夫尼肠杆菌(G^-)、液化沙雷氏菌(G^-)、蜂窝哈夫尼亚菌(G^-)和解鸟氨酸拉乌尔菌(G^-)；

香辛料的提取：称取80目香辛料20.00g置于500mL圆底烧瓶内，按料液比1:10(g/mL)加入95％乙醇溶液，将装有香辛料和乙醇的圆底烧瓶于85℃水浴锅中回流提取香辛料3h，抽滤，再重复提取香辛料3次，并抽滤；接着合并滤液，再用旋转蒸发仪真空浓缩(50℃，-0.1MPa)滤液，蒸发溶剂，用无菌蒸馏水溶解香辛料粗提物，-20℃冷冻保存12h，真空冷冻干燥48h得香辛料醇提物；提取的香辛料醇提物分别为：生姜醇提物、丁香醇提物和迷迭香醇提物；同时，准备食品级Nisin Z、抗坏血酸和白藜芦醇；其中，生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z为天然抑菌剂，抗坏血酸、迷迭香醇提物和白藜芦醇为天然抗氧化剂；

步骤2)、以步骤1)鉴定的清酒乳杆菌(G⁺)、荧光假单胞菌(G^-)、液化沙雷氏菌(G^-)、蜂窝哈夫尼亚菌(G^-)和解鸟氨酸拉乌尔菌(G^-)为受试菌种；通过96孔板微量酶标仪法测得生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z对受试菌种的最低抑菌浓度(MIC)；用不同浓度的生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z处理冷鲜驴肉，真空包装于4℃温度中放置10d后，进行感官评定得到感官评定最佳浓度；综合96孔板微量酶标仪法和感官评定得到的结果为单因素实验结果，在单因素基础上运用Design Expert8.0.6进行实验设计，设计3因素3水平响应面实验，利用响应面优化得到生姜醇提物41.07mg/mL、丁香醇提物5.39mg/mL和Nisin Z56.28mg/mL，考虑到实际操作的可行性，将此反应在以上理论值基础上修正并检测验证得生姜醇提物40.00g/mL、丁香醇提物5.50mg/mL和Nisin Z 55.00mg/mL；通过对抗坏血酸、迷迭香醇提物和白藜芦醇抗氧化能力单因素试验(DPPH自由基清除能力的测定方法)得到三种抗氧化剂DPPH自由基清除率最好浓度；用不同浓度抗坏血酸、迷迭香醇提物和白藜芦醇处理冷鲜驴肉，真空包装于4℃温度中放置10d后，进行感官评定得到感官评定最佳浓度；综合抗氧化能力单因素试验和感官评定得到的结果为单因素实验结果，在单因素基础上运用Design Expert8.0.6进行实验设计，设计3因素3水平响应面实验，利用响应面优化得到抗坏血酸30.64mg/mL、迷迭香醇提物0.68mg/mL和白藜芦醇31.83mg/mL，考虑到实际操作的可行性，将此反应在以上理论值基础上修正并检测验证得抗坏血酸30.00mg/mL、迷迭香醇提物0.65mg/mL和白藜芦醇30.00mg/mL；

最终得到最优复合保鲜剂配方为生姜醇提物40.00mg/mL、丁香醇提物5.50mg/mL、Nisin Z55.00mg/mL、抗坏血酸30.00mg/mL、迷迭香醇提物0.65mg/mL和白藜芦醇30.00mg/mL。

使用时，将经步骤2)将配制好的复配保鲜剂对冷鲜驴肉喷淋，食品级PE保鲜袋真空包装，密封冷藏，完成冷鲜驴肉的冷藏。

天然复合保鲜剂中各物质的配比为生姜醇提物：丁香醇提物：Nisin Z＝1：1：1配制，抗坏血酸：迷迭香醇提物：白藜芦醇＝1：1：1配制；在无菌环境中均匀喷洒于驴肉表面，正反面各一次，喷淋1次约0.1mL，晾干5min后真空包装放置于4℃冰箱中。

本发明方法先进科学，通过本发明，提供了一种冷鲜驴肉复配天然保鲜剂的制备方法，包括下述步骤：步骤1)、鉴菌：将冷鲜驴肉真空包装于灭菌后的食品级PE包装袋中，于4℃冷藏储存放至驴肉腐败变质后，测定方法参照国标GB 4789.2-2016《食品微生物菌落总数的测定》。腐败菌菌种的分离纯化：从选择性培养基上挑选典型菌落，在其相应的平板上作划线分离，分离纯化2-3次，将代表性菌株移植斜面，保藏备检。进行16S rDNA鉴定。所用到的微生物培养基和培养条件：

表1微生物培养基与培养条件

Table 1 Microbial culture medium and culture conditions

步骤2)、选取步骤1鉴定的优势腐败菌为指示菌，提取生姜醇提物、丁香醇提物和迷迭香醇提物。用微量酶标仪96孔法测生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z的最低抑菌浓度(MIC)并结合感官评定得到各自最佳浓度，据此通过响应面优化得到最优天然复合抑菌剂；同时采用DPPH法测定白藜芦醇、迷迭香醇提物和抗坏血酸抗氧化活性最大浓度并结合驴肉感官评定得到各自最佳浓度，据此通过响应面优化得到最优复合天然抗氧化剂。综合得到最优天然保鲜剂配方。

步骤3)、根据步骤2得出复合天然保鲜剂配比结果，对冷鲜驴肉进行无菌喷洒处理。食品级PE保鲜袋真空包装，密封于4℃贮藏，通过检测细菌菌落总数、TVB-N值是否符合GB/T 9961-2008中冷鲜肉的卫生标准，获得添加复配天然保鲜剂的货架期。

步骤4)、步骤3已确定货架期的基础上，研究复配天然保鲜剂对真空包装冷鲜驴肉4℃冷藏条件下营养品质的影响。

本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：

本发明采用天然抑菌剂和天然抗氧化剂，以抑菌效果较好的生姜醇提物、丁香醇提物和Nisin Z为天然抑菌剂，进行复配优化，确定最佳配比；同时用抗氧化效果较好的抗坏血酸、迷迭香醇提物和白藜芦醇为天然抗氧化剂，进行复配优化，确定最佳配比；综合得到最佳复配保鲜剂配比。现代食品保鲜剂通常是合成化学品，如山梨酸钾、苯甲酸盐、丁基羟基茴香醚(BHA)和乳酸钠，且合成食品添加剂的健康风险低于监管机构定义的建议限值。天然保鲜剂由于其抑菌效果和在人体中具有更好的耐受性，因此越来越受消费者喜爱。许多香料如丁香和生姜等已被实验证明具有抗病原菌和腐败菌的活性。

目前国内外关于驴肉的研究主要集中在肉制品的营养分析方面，对冷鲜驴肉的腐败菌的检测以及对其复配天然保鲜剂的配方研究尚未见报道。本发明为冷鲜驴肉运输保存提供一定的理论依据。

生产实践表明，很多天然食品添加剂复配可以产生增效作用，不仅替代化学合成添加剂，而且可以进一步改善食品的品质，提高食品的食用安全性，其经济意义和社会意义是不言而喻的。

丁香醇提物，丁香提取物破坏细胞膜结构的完整性，使内部一些重要离子流失，从而导致相应重要的酶失去作用，影响到菌体的物质代谢，研究发现其抑菌效果明显优于其他香辛料。

生姜醇提物，生姜在中国有着悠久的药用历史，可用于恶心、呕吐、腹泻、消化不良、风湿病和感冒等疾病。一些挥发性化合物负责姜的抗菌活性，包括ɑ-蒎烯，冰片，茨烯和芳樟醇。生姜醇提物的抑菌效果优于其他溶剂提取物，对血清型大肠杆菌、血清型沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果好。

乳酸链球菌素(Nisin Z)，乳酸链球菌素生产商提出Nisin在乳制品、肉、即食蔬菜和水果等市场中是很有前景的生物防腐剂。乳酸链球菌通过短暂的孔来破坏细胞膜的完整性，导致细菌物质(氨基酸和三磷酸腺苷)从细菌中快速流出、质子动力势耗散，抑制细胞的生物合成途径，尤其是天然变种Z，在不同的食品系统中具有高溶解度、稳定性和广泛的抗菌谱。

白藜芦醇，白藜芦醇应用于肉制品上不影响肉色且能够显著抑制脂质氧化。

迷迭香醇提物，迷迭香有很好的抗氧化和抗菌潜力，能够稳定自由基，比BHT和BHA更有效，抗氧化活性主要和月桂烯有关，抗菌性能与1，8-桉叶素、ɑ-蒎烯有关。迷迭香醇提物抗氧化效果好，用于肉制品不仅可改善食品的感官特性，而且能延长保质期。

抗坏血酸，抗坏血酸又称为维生素C，为还原剂，其抗氧化作用表现在可以与O₂-·、HOO·及·OH迅速反应，生成半脱氢抗坏血酸、清除单线态氧、环烷巯自由基，其抗氧化作用依靠可逆的脱氢反应来完成。将抗坏血酸、迷迭香提取物组合喷洒在猪肉表面并真空包装贮藏，有效延缓猪肉脂质氧化，不影响猪肉的pH、色泽和含水量。

综上，本发明的目的在于克服化学合成保鲜剂存在的缺陷，采用天然抑菌剂和天然抗氧化，结合响应面优化得到最佳复配天然保鲜剂配比，该天然保鲜剂对冷鲜驴肉的优势腐败菌具有抑菌作用，对冷鲜驴肉进行低温贮藏保鲜无不良影响，且抑菌时效好，能有效延长冷鲜驴肉货架期。

附图说明

图1为冷鲜驴肉腐败菌相构成。

图2为菌株的16S rDNA PCR电泳图；

注：J1、J2分别为2种假单胞菌，R为乳酸菌，C1、C2、C3、C4分别为4种肠杆菌。

图3为不同浓度生姜醇提物对5种菌的影响；

注：a、b、c不同字母表示同一浓度5种菌的差异性显著(p＜0.05)。

图4为不同浓度丁香醇提物对5种菌影响；

注：a、b、c不同字母表示同一浓度5种菌的差异性显著(p＜0.05)。

图5为不同浓度Nisin Z对液化沙雷氏菌的影响；

注：a、b、c不同字母表示同一浓度5种菌的差异性显著(p＜0.05)。

图6为不同浓度生姜醇提物对驴肉的感官评分的影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图7为不同浓度丁香醇提物对驴肉的感官评分的影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图8为不同浓度Nisin Z对驴肉的感官评分的影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图9-1为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图9-2为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图9-3为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图9-4为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图9-5为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图9-6为天然抑菌剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图10为不同浓度抗坏血酸DPPH值变化趋势；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图11为不同浓度迷迭香醇提物DPPH值变化趋势；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图12为不同浓度白藜芦醇DPPH值变化趋势；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图13为不同浓度抗坏血酸对驴肉的感官评分影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图14为不同浓度迷迭香醇提物对驴肉的感官评分影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图15为不同浓度白藜芦醇对驴肉的感官评分影响；

注：a、b、c不同字母表示差异性显著(p＜0.05)。

图16-1为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图16-2为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图16-3为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图16-4为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图16-5为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图16-6为天然抗氧化剂冷鲜驴肉三维响应面图。

图17为保藏期间驴肉细菌总数对数值变化；

注：字母不同表示同处理不同时间之间的显著性差异(p＜0.05)；

*表示同时间下不同处理之间的显著性差异(p＜0.05)。

图18为保藏期间驴肉TVB-N值的变化；

注：字母不同表示同处理不同时间之间的显著性差异(p＜0.05)；

*表示同时间下不同处理之间的显著性差异(p＜0.05)；

**表示同时间下不同处理之间的极显著性差异(p＜0.01)。

图19为保藏期间驴肉的pH值变化；

注：字母不同表示同处理不同时间之间的显著性差异(p＜0.05)；

*表示同时间下不同处理之间的显著性差异(p＜0.05)。

图20为保藏期间驴肉蒸煮损失的变化；

注：字母不同表示同处理不同时间之间的显著性差异(p＜0.05)；

*表示同时间下不同处理之间的显著性差异(p＜0.05)。

图17-图20中，A₁添加复配天然保鲜剂的冷鲜驴肉，简称试验组；A₂未添加保鲜剂的冷鲜驴肉，简称对照组。

下面结合附图以及附图说明，对本发明做进一步说明。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步解释：

实施例1和实例2的原料均为三粉黑驴肉。

实施例1：添加天然复配天然保鲜剂的冷鲜驴肉

1.提取生姜醇提物、丁香醇提物和迷迭香醇提物：称取80目香辛料20.00g置于500mL圆底烧瓶内，按料液比1:10(g/mL)加入95％乙醇溶液，于85℃水浴锅中回流提取3h，抽滤，重复提取3次，合并滤液，再用旋转蒸发仪真空浓缩(50℃，-0.1MPa)，蒸发溶剂，用无菌蒸馏水溶解粗提物，-20℃冷冻保存12h，真空冷冻干燥48h得提取物。

2.配制好复合天然保鲜剂，配比：生姜醇提物40.00mg/mL、丁香醇提物5.50mg/mL、Nisin Z 55.00mg/mL、抗坏血酸30mg/mL、迷迭香醇提物0.65mg/mL和白藜芦醇30.00mg/mL。

①生姜醇提物：称取1.00g生姜醇提物溶于5mL无水乙醇中，用无菌蒸馏水定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

②丁香醇提物：称取0.1375g丁香醇提物溶于5mL无水乙醇中，用无菌蒸馏水定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

③Nisin Z：称取1.375g Nisin Z溶于0.02mol/L盐酸稀溶液，并定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

将生姜醇提物：丁香醇提物：Nisin Z＝1:1:1配制。

④抗坏血酸：称取0.75g抗坏血酸溶于无菌蒸馏水中，并定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

⑤迷迭香醇提物：称取0.01625g迷迭香醇提物溶于2mL无水乙醇中，用无菌蒸馏水定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

⑥白藜芦醇：称取0.75g白藜芦醇溶于无水乙醇中，并定容于25mL容量瓶中，充分混匀。

将抗坏血酸：迷迭香醇提物：白藜芦醇＝1:1:1配制。

3.将屠宰场宰割的驴肉真空包装后，冷链运输至实验室后于-30℃的超低温冰箱中放置1～2h，再置于4℃冰箱。在无菌操作室中去除筋膜和脂肪，用无菌喷壶将复合天然保鲜剂均匀喷洒于驴肉表面，在无菌操作台上晾干5min后封好，真空包装放置于4℃条件下贮藏。

实施例2：无添加保鲜剂冷鲜驴肉

1.将屠宰场宰割的驴肉真空包装后，冷链运输至实验室后于-30℃的超低温冰箱中放置1～2h，再置于4℃冰箱。在无菌操作室中去除筋膜和脂肪。

2.真空包装放置于4℃条件下贮藏。

表2各菌株测序的种属关系

Table 2 The relationship of species of strain sequence

结果分析

下表是对实施例1与实施例2的结果比较：

表3保藏期间驴肉表面的色泽变化

Table 3 Color change of the surface of donkey meat during storage

注：每行不同字母代表差异显著(p＜0.05)

A₁代表实施例1；A₂代表实施例2。

表4贮藏期内冷鲜驴肉脂肪酸的变化(％)

Table 4 Changes of fatty acids in cold fresh donkey meat duringstorage

注：同一行肩标不同字母表示同处理不同时间之间脂肪酸的显著性差异(p＜0.05)；*表示同时间下不同处理之间的显著性差异(p＜0.05)；**表示同时间下不同处理组之间的极显著差异(p＜0.01)；A₁代表实施例1，；A₂代表实施例2；—代表未检出；\代表未测定。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。