阅读说明：本技术 一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5i77-m和应用 (Method for improving cellulase activity, cellulase mutant 5I77-M and application ) 是由 罗会颖 郑洁 姚斌 王亚茹 柏映国 黄火清 苏小运 王苑 涂涛 张�杰 于 2020-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及农业生物技术领域,具体涉及一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5I77-M和应用。本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的T300/D307位点实施定点突变获得T300P/D307P突变体。结果表明,与野生型纤维素酶相比,突变体的最适pH值、最适温度并未发生变化,而以羧甲基纤维素钠为底物时,突变体的比活力比野生型提高了约60%。(The invention relates to the technical field of agricultural biology, in particular to a method for improving cellulase activity, a cellulase mutant 5I77-M and application. The invention relates to a polypeptide with an amino acid sequence shown as SEQ ID NO: site-directed mutagenesis is carried out on the T300/D307 sites of the wild-type cellulase shown in the 1 to obtain a T300P/D307P mutant. The results show that compared with the wild cellulase, the optimum pH value and the optimum temperature of the mutant are not changed, and when the sodium carboxymethyl cellulose is used as a substrate, the specific activity of the mutant is improved by about 60 percent compared with the wild cellulase.)

一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5I77-M和 应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5I77-M和应用。

背景技术

纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，是地球上最丰富的有机物，也是现今最大量的可再生性生物质资源。在现有的纤维素转化技术中，纤维素酶被认为是关键因素，也逐渐成为研究的热点之一。

纤维素酶是一类可以将纤维素降解成纤维寡糖或葡萄糖的水解酶，可以水解β-1,4-葡萄糖苷键，即纤维素分子中连接葡萄糖单位的化学键。根据现有研究，自然界中绝大部分纤维素的降解转化是由真菌和细菌完成的，这些微生物通过产生一系列的纤维素酶系统发展出了多种在胞外高效降解天然结晶纤维素的机制。

催化活性作为衡量酶工业化应用价值的重要指标，一直以来被广泛关注。虽然目前已经公开以下酶突变策略，但是由于对于酶的氨基酸序列与功能之间的研究还很有限，依据酶突变策略设计的突变方案难以获得预期的技术效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种催化活性提高的纤维素酶突变体，是纤维素酶定点突变后得到的突变体。

本发明的再一目的是提供编码上述催化活性提高的纤维素酶突变体的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述突变体基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供制备催化活性提高的纤维素酶的方法。

本发明对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶进行定点突变。该野生型纤维素酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示。本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的第300位点的氨基酸Thr定点突变为氨基酸Pro，对第307位点的Asp定点突变为氨基酸Pro，得到催化活性提高的纤维素酶突变体5I77-M。

因此，本发明的催化活性提高的纤维素酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

编码所述催化活性提高的纤维素酶突变体的基因的核酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还是提供一种制备催化活性提高的纤维素酶的方法，所述方法包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3）回收并纯化所表达的催化活性提高的纤维素酶5I77-M。

本发明还提供了上述催化活性提高的纤维素酶突变体的应用，例如，用于将纤维素降解成纤维寡糖或葡萄糖。

本发明通过对氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型纤维素酶的T300/D307位点实施定点突变获得T300P/D307P突变体。结果表明，与野生型纤维素酶相比，突变体的最适pH值、最适温度并未发生变化，而以羧甲基纤维素钠为底物时，突变体的比活力比野生型提高了约60%。

附图说明

图1显示纤维素酶突变体与野生型的最适pH。

图2显示纤维素酶突变体与野生型的最适温度。

图3显示纤维素酶突变体与野生型的比活比较图。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：表达宿主Pichiapastoris GS115，表达质粒载体pPIC9r。

2、生化试剂：限制性内切酶购自NEB公司，连接酶购自Promaga公司，点突变试剂盒购自全式金公司，羧甲基纤维素钠购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

LB培养基：0.5% 酵母提取物，1% 蛋白胨，1% NaCl， pH 7.0

YPD培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖

MD固体培养基：2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34% YNB，0.00004% Biotin

BMGY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1% 甘油(V/V)，1.34% YNB，0.00004%Biotin。

BMMY培养基：1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，0.5%甲醇(V/V)。

4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1催化活性提高的纤维素酶突变体重组载体pPIC9r-5I77-M的制备

将纤维素酶野生型（突变前）序列片段（去除信号肽）克隆到表达载体pPIC-9r上，重组载体命名pPIC9r-5I77。以重组载体pPIC9r-5I77为模板，通过携带突变位点的引物对其进行扩增，获得携带突变体序列的重组载体，命名为pPIC9r-5I77-M。

表1 催化活性提高的纤维素酶突变体5I77-M特异性引物

实施例2催化活性提高的纤维素酶突变体的制备。

（1）纤维素酶突变体5I77-M在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

将获得的含有突变体基因5I77-M的重组质粒pPIC9r-5I77-M转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/5I77-M。 取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300 mL BMGY培养基的1 L三角瓶中，置于30 ℃，220 rpm摇床培养48 h；培养液4000 g离心5 min，弃上清，沉淀用200 mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30 ℃，220 rpm条件下诱导培养。每隔12 h补加1 mL甲醇，同时取上清用于酶活性检测。

（2）重组蛋白酶的纯化

收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过10 kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，最后剩余约20 ml蛋白浓缩液。浓缩到一定倍数的重组纤维素酶5I77-M，利用离子交换层析法进行纯化。具体地，取纤维素酶5I77及突变体5I77-M浓缩液10.0 mL经预先用10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)平衡过的HiTrap Q HP阴离子柱，然后用含有1mol/L NaCl的10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)进行线性梯度洗脱，利用DNS法对梯度洗脱的蛋白液进行酶活性检测，同时利用SDS-PAGE凝胶电泳对梯度洗脱的蛋白液进行纯度的检测。

实施例3重组催化活性提高的纤维素酶突变体和野生型的活性分析

采用二硝基水杨酸(DNS) 法测定重组内切纤维素酶的基本酶学性质。具体方法如下：在pH 4.0，75 ℃条件下，1 mL的反应体系包括100 µL适当的稀释酶液，900 µL底物，反应10min，加入1.5 mL DNS终止反应；沸水浴煮5 min后冷却至室温，在540 nm波长下测定OD值。内切纤维素酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解底物生成1 μmoL 葡萄糖所需要的酶量为1个活性单位(U)。酶学性质研究所用酶液均需达到电泳纯。

（1）最适pH分析比较

经纯化的实施例2表达的纤维素酶5I77及突变体5I77-M在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.0-7.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲体系。纯化的纤维素酶5I77及突变体5I77-M在不同pH的缓冲体系、75 ℃下测定的最适pH，如图1所示，野生纤维素酶5I77和突变体5I77-M的最适pH均为4.0。

（2）最适温度分析比较

经纯化的实施例2表达的纤维素酶5I77及突变体5I77-M在pH 4.0条件下，以羧甲基纤维素钠为底物，测定30-80℃不同温度下的酶活性，以确定重组酶最适温度。如图2所示，野生纤维素酶5I77和突变体5I77-M的最适反应温度为75℃，在80℃时依然具有50%以上的酶活力。

（3）比活分析比较

实施例2纯化后的纤维素酶野生型5I77与突变体5I77-M在pH4.0，75℃件下进行酶促反应以测定其酶活性。

比活测定结果如图3所示，野生型5I77的比活为1464 U/mg，突变体5I77-M的比活为2313 U/mg，较野生型提高了约60%。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种提高纤维素酶活性的方法及纤维素酶突变体5I77-M和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Val Pro His Gly Ser Gly His Lys Lys Arg Ala Ser Val Phe Glu

1 5 10 15

Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Thr Asn Ile Pro

20 25 30

Gly Val Trp Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Pro Asp Pro Ser Thr Ile Ser

35 40 45

Thr Leu Ile Gly Lys Gly Met Asn Phe Phe Arg Val Gln Phe Met Met

50 55 60

Glu Arg Leu Leu Pro Asp Ser Met Thr Gly Ser Tyr Asp Glu Glu Tyr

65 70 75 80

Leu Ala Asn Leu Thr Thr Val Val Lys Ala Val Thr Asp Gly Gly Ala

85 90 95

His Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Glu Ile

100 105 110

Ile Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly

115 120 125

Gln Tyr Lys Asp Asn Asp Leu Val Met Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr

130 135 140

Tyr Asp Met Asp Gln Asp Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile

145 150 155 160

Asn Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Asp Val Asn Asp Asn Met

180 185 190

Lys Asn Leu Thr Asp Pro Glu Asp Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln

195 200 205

Tyr Leu Asp Ser Asp Gly Ser Gly Thr Ser Glu Thr Cys Val Ser Gly

210 215 220

Thr Ile Gly Lys Glu Arg Ile Thr Asp Ala Thr Gln Trp Leu Lys Asp

225 230 235 240

Asn Lys Lys Val Gly Phe Ile Gly Glu Tyr Ala Gly Gly Ser Asn Asp

245 250 255

Val Cys Arg Ser Ala Val Ser Gly Met Leu Glu Tyr Met Ala Asn Asn

260 265 270

Thr Asp Val Trp Lys Gly Ala Ser Trp Trp Ala Ala Gly Pro Trp Trp

275 280 285

Gly Asp Tyr Ile Phe Ser Leu Glu Pro Pro Asp Gly Thr Ala Tyr Thr

290 295 300

Gly Met Leu Asp Ile Leu Glu Thr Tyr Leu

305 310

<210> 2

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttccacatg gttccggtca taagaagagg gcttccgttt ttgaatggtt cggttctaac 60

gaatccggtg ccgagttcgg aactaacatt ccaggtgttt ggggtactga ctacatcttc 120

ccagatccat ccactatctc caccttgatc ggtaagggta tgaacttctt cagggtccag 180

ttcatgatgg aaagattgct gccagactcc atgactggtt cttacgacga agagtacttg 240

gccaacttga ccactgttgt taaggctgtt actgacggtg gtgctcacgc tttgattgat 300

ccacataact acggtagata caacggcgag attatctcct ccacttccga cttccaaacc 360

ttctggcaaa acttggctgg tcagtacaag gacaacgact tggttatgtt cgacaccaac 420

aacgagtact acgacatgga ccaggacttg gtcttgaact tgaaccaggc tgctatcaac 480

ggtatcagag ctgctggtgc ttcccagtac attttcgttg aaggtaactc ctggactggt 540

gcttggactt gggttgatgt taacgacaac atgaagaacc tgactgaccc agaggacaag 600

atcgtttacg agatgcacca atacttggac tctgacggtt ctggtacttc cgagacttgt 660

gtttccggta ctatcggtaa agagagaatc actgacgcta cccagtggct gaaggacaac 720

aagaaagttg gtttcatcgg tgagtacgcc ggtggatcta acgatgtctg tagatccgct 780

gtctctggta tgttggagta catggctaac aacaccgacg tttggaaggg tgcttcttgg 840

tgggctgctg gtccttggtg gggtgattac attttctcat tggaaccacc agacggtact 900

gcctacactg gtatgctgga cattttggag acttacctt 939

<210> 3

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

Trp Phe Gly Ser Asn Glu Ser Gly Ala Glu Phe Gly Thr Asn Ile Pro

20 25 30

Gly Val Trp Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Pro Asp Pro Ser Thr Ile Ser

35 40 45

Thr Leu Ile Gly Lys Gly Met Asn Phe Phe Arg Val Gln Phe Met Met

50 55 60

Glu Arg Leu Leu Pro Asp Ser Met Thr Gly Ser Tyr Asp Glu Glu Tyr

65 70 75 80

Leu Ala Asn Leu Thr Thr Val Val Lys Ala Val Thr Asp Gly Gly Ala

85 90 95

His Ala Leu Ile Asp Pro His Asn Tyr Gly Arg Tyr Asn Gly Glu Ile

100 105 110

Ile Ser Ser Thr Ser Asp Phe Gln Thr Phe Trp Gln Asn Leu Ala Gly

115 120 125

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130 135 140

Tyr Asp Met Asp Gln Asp Leu Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile

145 150 155 160

Asn Gly Ile Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gln Tyr Ile Phe Val Glu Gly

165 170 175

Asn Ser Trp Thr Gly Ala Trp Thr Trp Val Asp Val Asn Asp Asn Met

180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttccacatg gttccggtca taagaagagg gcttccgttt ttgaatggtt cggttctaac 60

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