通关藤苷g和氟尿嘧啶组合物及其应用
阅读说明：本技术 通关藤苷g和氟尿嘧啶组合物及其应用 (Marsdenia tenacissima glycoside G and fluorouracil composition and application thereof ) 是由 胡道德 王恺纯 于 2020-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗结直肠癌组合物,所述的组合物由通关藤苷G和5-FU组成。本发明还提供了结直肠癌组合物的用途。本发明优点在于：本发明采用通关藤苷G(50μM)与5-FU(5μM)联合用药,能有效抑制结直肠癌RKO细胞的增殖。与单独给药组比较,联合用药通过将细胞阻滞于G0/G1期,使癌细胞的敏感性增强,促进结直肠癌细胞凋亡。通过实验方案证实：通关藤苷G联合氟尿嘧啶对结直肠癌细胞增殖抑制作用；通关藤苷G联合氟尿嘧啶对结直肠癌细胞周期阻滞作用；通关藤苷G联合氟尿嘧啶诱导结直肠癌细胞凋亡作用。本发明具备开发成临床联合用药的前景。(The invention relates to a composition for treating colorectal cancer, which consists of marsdenia tenacissima G and 5-FU. The invention also provides the use of the colorectal cancer composition. The invention has the advantages that: the invention adopts the combined medication of marsdenia tenacissima G (50 mu M) and 5-FU (5 mu M), which can effectively inhibit the proliferation of RKO cells of colorectal cancer. Compared with a single administration group, the combined administration can block cells in the G0/G1 stage, enhance the sensitivity of cancer cells and promote the apoptosis of colorectal cancer cells. The experimental protocol confirms that: the combination of marsdenia tenacissima G and fluorouracil has the effect of inhibiting the proliferation of colorectal cancer cells; the blocking effect of the combination of marsdenia tenacissima G and fluorouracil on cell cycle of colorectal cancer; the marsdenia tenacissima G combined with fluorouracil induces the apoptosis of colorectal cancer cells. The invention has the prospect of developing clinical combined medicine.)
技术领域
本发明属于医药领域，涉及已知化合物的新用途，具体涉及通关藤苷G与氟尿嘧啶联合在结直肠癌治疗中的应用。
背景技术
肿瘤细胞发生与发展的重要标志之一是细胞周期的调控紊乱。抑制周期蛋白依赖性激酶的活化可将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期，从而发挥抗癌作用。细胞凋亡是指体内外因素触发细胞内预存的死亡程序，在基因的调控下自主地启动细胞的死亡程序，有序地结束生命的过程，即程序性细胞死亡。正常机体利用细胞凋亡清除多余、衰老和受损伤的细胞，以保持机体的内环境平衡，维持正常生理活动。一旦凋亡发生失衡就可能引起癌症、自身免疫性疾病等多种疾病的发生。肿瘤细胞对氟尿嘧啶的敏感度降低使得化疗难以取得良好进展进而导致化疗失败,因此提高肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶敏感度的机制研究和应用迫在眉睫。通关藤苷G是一种天然的苷类化合物，目前尚无通关藤苷G增强氟尿嘧啶抗癌效果的报道。
中国专利文献CN：109692181A公开了一种通关藤苷I或通关藤苷G在制备抗炎的药物中的应用。中国专利文献CN：101657203A公开了抗癌药的组合物及递送方法。该发明涉及包含5-氟尿嘧啶或其药学上可接受的盐或类似物、亚叶酸或其药学上可接受的盐和环糊精或其药学上可接受的盐或衍生物的组合物。本发明还涉及使用这种组合物治疗癌症的方法。但是关于通关藤苷G和氟尿嘧啶组合物，以及在结直肠癌治疗中的应用，目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供一种治疗结直肠癌组合物。
本发明的第二个目的是，提供治疗结直肠癌组合物的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种治疗结直肠癌组合物，所述的组合物由通关藤苷G和5-FU组成，所述的通关藤苷G和5-FU药物浓度比为(2-10)：1。
进一步优先方案：所述的通关藤苷G和5-FU药物浓度比为10：1。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：组合物在预防和治疗结直肠癌药物中的应用。所述的组合物由通关藤苷G和5-FU组成。所述的通关藤苷G和5-FU药物浓度比为(2-10)：1。所述的通关藤苷G和5-FU药物浓度比为10：1。
本发明优点在于：5-FU是临床常用结直肠癌化疗药物之一，肿瘤细胞对其敏感度的降低使治疗效果变差。临床数据表明，与传统单用5-FU相比，联合用药可以提高疗效。因此，寻找可与5-FU协同增效的化合物对于结直肠癌治疗具有重要临床意义。本发明中,采用通关藤苷G(50μM)与5-FU(5μM)联合用药,能有效抑制结直肠癌RKO细胞的增殖。与单独给药组比较,联合用药通过将细胞阻滞于G0/G1期，使癌细胞的敏感性增强，促进结直肠癌细胞凋亡
附图说明
图1通关藤苷G与5-FU联合用药对结直肠癌细胞增殖抑制的协同作用。
图2通关藤苷G、5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞周期的影响。
图3通关藤苷G、5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞周期相关蛋白的影响。
图4通关藤苷G、5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞凋亡程度的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
具体实施方案
一、实验材料
通关藤苷G购自宝鸡市辰光生物科技有限公司；二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)购自MCE公司；DMEM高糖培养基，胎牛血清，双抗，PBS均购自Gibco公司；RIPA，PMSF，BCA试剂盒均购自索莱宝公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；周期检测试剂盒，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒均购自美国BD公司；p53，p21，CDK2，CDK4，CDK6，CyclinD1，β-actin均购自CST公司。
二、实验方法
1.细胞培养
从液氮罐中取出装有细胞的冻存管，快速放入事先准备好的37℃水浴锅中，轻轻摇晃，使其快速溶解。随后，用酒精棉球擦拭后，移入超净工作台。用移液枪将吸出的细胞混合液置入离心管中，离心后，去上清，培养基重悬，将细胞团块吹散、吹匀，并将其移至培养皿中，培养基为含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基。在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
2.通关藤苷G联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对结直肠癌细胞株活性的影响
取对数期细胞RKO、HCT116、HCT8、LoVo和HT-29，用新鲜的培养液重悬，调整细胞浓度为8×104个/mL，按每孔100μL接种于96孔板，在孵育箱中孵育12h，等待贴壁。贴壁后，弃去细胞培养液，设置对照组(不加药)、通关藤苷G组(通关藤苷浓度为10,25,50μM)、5-FU组(5-FU浓度为5μM)和联合用药组(两种药物浓度2：1、5：1和10：1配比)。每组均设6复孔，对每孔进行不同处理以保证最终液体体积为100μL，培养48h。于结束前，吸去药液，每孔加入10μL CCK-8和90μL DMEM，混匀，分别培养2h后置于酶标仪上，于450nm波长处检测吸光度。计算通关藤苷G与5-FU分别及联合对结直肠癌细胞的抑制率。
3.通关藤苷G、5-FU单独及联合使用对细胞周期的影响
取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种1mL于6孔板中，每孔再加入新鲜培养液1mL，放入孵育箱中培养。12h后，弃去培养基，设置对照组(不加药)、通关藤苷G组(通关藤苷浓度为50μM)、5-FU组(5-FU浓度为5μM)和联合用药组。各孔液体均为2mL，继续培养48h，弃去药液，PBS冲洗2遍，胰酶消化，收集细胞悬液，弃去药液，胰酶消化、离心后收集细胞，400μL预冷的70％乙醇重悬，4℃条件下放置2h后用PBS清洗2遍，加入100μLRNase 37℃水浴30min，再加入400μL PI染色混匀，4℃避光30min。上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。
4.通关藤苷G、5-FU单独及联合使用对细胞周期调控蛋白的影响
将药物处理过后的细胞取出，弃去培养液，PBS洗3遍。每孔加入200μL含PMSF的RIPA(RIPA:PMSF＝100:1)，于冰上裂解30min后，收集细胞，离心操作(4℃，12000rpm，10min)，取上清为所需。根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。加适当体积样品到96孔板中，用裂解液补足至20μL。各孔加入BCA工作液200μL，37℃放置30分钟。测定A562 nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。电泳，转膜，周期相关蛋白一抗及一抗对应的二抗孵育，显影。
5.通关藤苷G、5-FU单独及联合使用诱导结直肠癌细胞凋亡作用
取对数生长期细胞，接种于6孔板中，每孔加入新鲜培养液2mL，放入孵育箱中培养。12h后，弃去培养基，进行药物处理。继续培养48h，弃去药液，PBS冲洗2遍，胰酶消化，收集细胞悬液，离心操作(4℃，1000rpm，3min),100μL 1×Binding Buffer重悬于1.5mL EP管，加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染液，室温放置15min，半小时内流式仪上机检测。
6.数据处理及分析
使用SPSS21.0进行数据分析，计量资料以表示，多组间均数比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐采用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1.通关藤苷G、5-FU单独及联合使用对结直肠癌RKO细胞的增殖抑制作用
各组药物对RKO细胞进行处理48h后，与空白对照组相比，各组均可抑制RKO细胞的增殖(**P<0.01)，抑制率呈浓度依赖性。10,25,50μM通关藤苷G对RKO细胞48h抑制率分别为0.98±1.07％,2.89±1.13％,4.62±0.17％；5μM 5-FU 48h抑制率分别为19.64±0.53％；三组联合用药48h抑制率分别为21.70±2.05％,30.20±3.11％,50.88±1.22％。结果见表1。
表1通关藤苷G与5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞的增殖抑制作用(
2.通关藤苷G、5-FU联合用药的协同作用研究
为了验证通关藤苷G与5-FU对结直肠癌细胞RKO增殖抑制存在协同作用，我们利用CompuSyn软件计算3组联合用药的Combination Index(CI)值,结果见表2、图1。CI值作用判断协同作用存在与否的量化指标,CI值<1代表具有协同效应,数值越小协同效应越强。计算结果表明，三组药物联合均存在协同效应，当药物浓度为通关藤苷G:5-FU＝10:1时,协同作用最强。故在后续实验中选择联合用药浓度为10:1进行机制研究。
表2通关藤苷G与5-FU联合使用对结直肠癌细胞增殖抑制的联合指数( n＝3)
3.通关藤苷G、5-FU单独及联合使用对结直肠癌RKO细胞周期的影响
与对照组相比，50μM通关藤苷G可使RKO细胞G0/G1期比例显著增加，S期细胞显著减少(**P<0.01)。5-FU单用对细胞G0/G1期无明显影响。通关藤苷G与5-FU联合用药组G0/G1期比例显著增加，S期细胞显著减少(**P<0.01)，G2/M期细胞显著减少(**P<0.01)。结果见表3、图2。
表3通关藤苷G、5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞周期的影响(
4.通关藤苷G、5-氟尿嘧啶单独及联合使用对细胞周期调控蛋白的影响
与对照组相比，通关藤苷G组细胞周期G1/S期调控相关蛋白CDK2、4、6以及CyclinD1的表达水平显著下降(**P<0.01)；与5-FU组相比，联合用药组细胞周期G1/S期调控相关蛋白CDK2、4、6以及Cyclin D1的表达水平显著下降(**P<0.01)。结果见图3。
5.通关藤苷G、5-氟尿嘧啶单独及联合使用诱导结直肠癌细胞凋亡作用
给药后48h，通关藤苷组，5-FU组以及联合用药组凋亡水平均显著上升(**P<0.01)，分别为(10.7±0.89)％、(30.3±1.22)％和(52.6±1.54)％。与单药给药组相比，联合用药组可显著升高细胞的凋亡水平(**P<0.01)。结果见表4、图4。
表4通关藤苷G、5-FU单用及联合使用对结直肠癌细胞凋亡程度的影响(n＝3)
5-FU是临床常用结直肠癌化疗药物之一，肿瘤细胞对其敏感度的降低使治疗效果变差。临床数据表明，与传统单用5-FU相比，联合用药可以提高疗效。因此，寻找可与5-FU协同增效的化合物对于结直肠癌治疗具有重要临床意义。
本发明中,采用通关藤苷G(50μM)与5-FU(5μM)联合用药,能有效抑制结直肠癌RKO细胞的增殖。与单独给药组比较,联合用药通过将细胞阻滞于G0/G1期，使癌细胞的敏感性增强，促进结直肠癌细胞凋亡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。