一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法
阅读说明：本技术 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法 (Preparation method of small and dense low-density lipoprotein cholesterol detection kit ) 是由 王保全 高洪元 方洪帅 崔学儒 邢瑞 王艳丽 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医学检测技术领域,且公开了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤：S1、获取试剂R1所需要的成分,MES缓冲液一100mmol/L胆固醇酯酶1.6KU/L胆固醇氧化酶0.6KU/L磷脂酶2.7KU/L过氧化氢酶一1.2KU/L Toos 2mmol/L 0.3g/L的琼脂胶；浓度为1g/L的聚乙二醇(PEG)磷钨酸的浓度为4.5g/L；S2、获取试剂R2所需要的成分,MES缓冲液二100mmol/L过氧化物酶二5KU/L 4-氨基安替比林4mmol/L叠氮钠0.05％。本发明用于体外定量测定人血清中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量。本申请的试剂盒中使用的过氧化物酶,提高了检测的灵敏度和特异性。(The invention relates to the technical field of medical detection, and discloses a preparation method of a small and dense low-density lipoprotein cholesterol detection kit, which comprises the following steps: s1, obtaining components required by a reagent R1, MES buffer solution I100 mmol/L cholesterol esterase 1.6KU/L cholesterol oxidase 0.6KU/L phospholipase 2.7KU/L catalase, 1.2KU/L Toos 2mmol/L agar gel 0.3 g/L; the concentration of 1g/L polyethylene glycol (PEG) phosphotungstic acid is 4.5 g/L; s2, obtaining components required by the reagent R2, and adding 0.05% of MES buffer solution of two 100mmol/L peroxidase of two 5 KU/L4-aminoantipyrine of 4mmol/L sodium azide. The invention is used for in vitro quantitative determination of the content of small and dense low-density lipoprotein cholesterol in human serum. The peroxidase used in the kit of the application improves the sensitivity and specificity of detection.)
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体为一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法。
背景技术
低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高是独立的致动脉粥样硬化危险因素〔1〕,而sdLDL-C作为LDL的主要组分，相对与大而轻低密度脂蛋白(L LDL)而言，由于其对血管壁的高侵入性，与LDL受体的低亲和性、更长的血浆半衰期且对于氧化应激的低耐受性，导致sdLDL-C更容易致动脉粥样硬化。
最近有研究表明，sdLDL-C是心血管病的一个重要标志物，可以预测冠心病的风险。相关的临床或实验室检测方法有：酶法。
第一步：在胆固醇脂酶(CHE)、胆固醇氧化酶(CO)、磷脂酶和过氧化氢酶(catalase)的作用下，先清除非sdLDL-C成份，即：乳糜微粒 (Chylomicron,CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL), L LDL和高密度脂蛋白(HDL)中包含的胆固醇。
第二步：在试剂二中叠氮钠的作用下，过氧化氢酶被抑制，而在特殊表面活性剂的作用下，sd LDL-C被释放出来，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶作用下，生成过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与色原生成***的醌类物质，进而检测sdLDL-C的浓度。
然而现有小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒在使用的过程中存在操作繁琐、耗时长、过度浪费资源、检测灵敏度特异性不理想的问题，不方便人们使用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取试剂R1所需要的成分，MES缓冲液一100mmol/L胆固醇酯酶1.6KU/L胆固醇氧化酶0.6KU/L磷脂酶2.7KU/L过氧化氢酶一 1.2KU/L Toos 2mmol/L 0.3g/L的琼脂胶；浓度为1g/L的聚乙二醇 (PEG)磷钨酸的浓度为4.5g/L；
S2、获取试剂R2所需要的成分，MES缓冲液二100mmol/L过氧化物酶二5KU/L 4-氨基安替比林4mmol/L叠氮钠0.05％；
S3、制备试剂R1，将R1的原料溶解在蒸馏水中，混合均匀定容；
S4、制备试剂R2、将R2中的4-氨基安替比林溶解于MES缓冲液二中，混合均匀，后向溶液中加过氧化物酶二和叠氮钠，充分搅拌，混合均匀，定容。
优选的，试剂R1盒试剂R2体积比为3：1。
优选的，S3中蒸馏水可用双蒸水替代。
优选的，试剂R1和试剂R2中的PH均为7。
优选的，所述过氧化物酶一和过氧化物酶二的酶活性均为128KU/g。
本发明提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法。具备以下有益效果：
(1)、小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒用于体外定量测定人血清中小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量。本申请的试剂盒中使用的过氧化物酶，提高了检测的灵敏度和特异性。
(2)、从而在测定快速灵敏、特异性高的前提下，整个体系稳定性好 (可稳定12个月)，操作简便，可适于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。
具体实施方式
实施例一：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取试剂R1所需要的成分，MES缓冲液一100mmol/L胆固醇酯酶1.6KU/L胆固醇氧化酶0.6KU/L磷脂酶2.7KU/L过氧化氢酶一 1.2KU/L Toos 2mmol/L 0.3g/L的琼脂胶；浓度为1g/L的聚乙二醇 (PEG)磷钨酸的浓度为4.5g/L；
S2、获取试剂R2所需要的成分，MES缓冲液二100mmol/L过氧化物酶二5KU/L 4-氨基安替比林4mmol/L叠氮钠0.05％；
S3、制备试剂R1，将R1的原料溶解在蒸馏水或双蒸水中，混合均匀定容；
S4、制备试剂R2、将R2中的4-氨基安替比林溶解于MES缓冲液二中，混合均匀，后向溶液中加过氧化物酶二和叠氮钠，充分搅拌，混合均匀，定容，试剂R1和试剂R2中的PH均为7，试剂R1盒试剂R2体积比为3：1，过氧化物酶一和过氧化物酶一的酶活性均为128KU/g。
对比例一：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取试剂R1所需要的成分，MES缓冲液一100mmol/L胆固醇酯酶1.6KU/L胆固醇氧化酶0.6KU/L磷脂酶2.7KU/L过氧化氢酶一 1.2KU/L Toos 2mmol/L 0.3g/L的琼脂胶；浓度为1g/L的聚乙二醇 (PEG)磷钨酸的浓度为4.5g/L；
S2、获取试剂R2所需要的成分，MES缓冲液二100mmol/L过氧化物酶二5KU/L 4-氨基安替比林4mmol/L叠氮钠0.05％；
S3、制备试剂R1，将R1的原料溶解在蒸馏水或双蒸水中，混合均匀定容；
S4、制备试剂R2、将R2中的4-氨基安替比林溶解于MES缓冲液二中，混合均匀，后向溶液中加过氧化物酶二和叠氮钠，充分搅拌，混合均匀，定容，试剂R1和试剂R2中的PH均为7，试剂R1盒试剂R2体积比为3：1，过氧化物酶一和过氧化物酶一的酶活性均为88KU/g。
对比例二：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、获取试剂R1所需要的成分，MES缓冲液一100mmol/L胆固醇酯酶1.6KU/L胆固醇氧化酶0.6KU/L磷脂酶2.7KU/L过氧化氢酶一 1.2KU/L Toos 2mmol/L 0.3g/L的琼脂胶；浓度为1g/L的聚乙二醇 (PEG)磷钨酸的浓度为4.5g/L；
S2、获取试剂R2所需要的成分，TRIS缓冲液100mmol/L过氧化物酶二5KU/L 4-氨基安替比林4mmol/L叠氮钠0.05％；
S3、制备试剂R1，将R1的原料溶解在蒸馏水或双蒸水中，混合均匀定容；
S4、制备试剂R2、将R2中的4-氨基安替比林溶解于MES缓冲液二中，混合均匀，后向溶液中加过氧化物酶二和叠氮钠，充分搅拌，混合均匀，定容，试剂R1和试剂R2中的PH均为7，试剂R1盒试剂R2体积比为3：1，过氧化物酶一和过氧化物酶一的酶活性均为128KU/g。
空白吸光度评价(37℃、700nm、光径1.0cm)，见表1。
表1空白吸光度
准确度
在检测浓度范围内不同浓度的样品，以市面上公认测试结果最准备的试剂作为参比试剂的测定值为X，本公司试剂的测定值为Y，均为6次测定结果的平均值，计算a、b，得到回归方程Y＝aX+b，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算每个浓度点的偏差，结果如下表 2。
表2准确度的测定
组别
比对试剂
测试试剂
绝对偏差
相对偏差％
实施例1
12.37
12.47
0.10
0.79
对比例1
7.04
7.48
0.44
6.22
对比例2
7.18
7.52
0.45
7.21
从以上实施例1及对比实施例1，2的测试结果相对偏差值可以看出，实施例1的相对偏差数值比对比例1，2的相对偏差数值小，测试结果更准确。
灵敏度
用已知浓度的样本测试试剂(盒)，记录在试剂(盒)规定参数下产生的吸光度改变即为吸光度差值(△A)，换算为浓度5ng/mL的吸光度差值，结果如下表3：
表3灵敏度的测定
从表3内容可以看出，实施例1灵敏度较好，对比例1灵敏度较差，说明过氧化物酶的酶活性对灵敏度影响较大，而实施例1和对比例2中比较中，实施例1选择的缓冲体系，使试剂盒具有更高的灵敏度。
精密度
重复性CV值的测定：在重复性条件下，用控制物质(朗道质控品，靶值：31.3ng/mL)测试试剂(盒)，重复测试10次,分别计算测量值的平均值 (X)和标准差(S)，结果如下表4。
表4重复性CV值的测定
上述结果表明，本发明试剂的重复性均符合规定的要求(变异系数CV≤ 5.0％)。
线性评价
用接近线性范围上限的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成6个稀释浓度(xi)。分别测试试剂(盒)，每个稀释浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)，结果如下表5、6、7。
表5实施例1试剂盒线性试验
表5：
表6对比实施例1试剂盒线性试验
表6：
表7对比实施例2试剂盒线性试验
表7：
以上结果表明实施例1、对比例1、2试剂在线性范围内均相关性良好
实验结果：
表8：
表8对比实施例1的实验结果；
表9：
表9对比例1的实验结果。
表10：
表10对比例2的实验结果。
从试验结果来看，实施例1试剂的外观、试剂空白吸光度、分析灵敏度、准确度均是最好的，对比例1、2随着时间延长，试剂空白吸光度上升明显、分析灵敏度、准确度下降明显，所以本申请技术方案中过氧化物酶酶活性与缓冲液的组合，是相辅相成、缺一不可的。
抗干扰性：
取健康人的血清样本，每份标本单独做一种干扰物质(血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯、总胆红素)的试验，将每份标本再分作十份，分别添加不同浓度(如下表所示)的干扰成份，然后使用实施例1、对比例1、2的试剂 (盒)在规定参数下对含有不同浓度梯度的常见干扰物质的标本进行测定，测定结果与未加干扰物质的标本比较，干扰率≤±5％则可判断被评价干扰物对被评价方法无干扰。反之则认为被评价干扰物对被评价方法有明显干扰作用。结果应符合本产品技术要求和说明书的要求。
干扰率(％)判断计算公式如下：
干扰值＝干扰样品测定值-基础样品测定值
干扰率(％)＝干扰样品测定值/基础样品测定值×100
由表可得出，小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂在血红蛋白≤ 5.0g/L、甘油三酯≤18.2mmol/L、抗坏血酸≤55mg/dL、总胆红素≤250μ mol/L。