阅读说明：本技术 定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒 (Method and kit for quantitative determination of small dense low density lipoprotein cholesterol ) 是由 崔贤艳 许国和 范翠翠 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法,首先在优先保护LDL-C的情况下,消除其它脂蛋白胆固醇,然后加入表面活性剂选择性的测定sd LDL-C。在该方法中,使用的试剂盒包括R1和R2两种独立液体试剂。试剂R1中含有缓冲液、表面活性剂、保护剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、显色底物、防腐剂、抗干扰成分；试剂R2中含有缓冲液、表面活性剂、过氧化物酶、显色剂、防腐剂。优点是：性能更为优良,准确性和特异性高、能有效抗干扰、线性范围广、性价比更高,为临床需要提供了一个很好的选择。(A method for quantitatively measuring small, dense and low-density lipoprotein cholesterol is disclosed, which comprises eliminating other lipoprotein cholesterol under the condition of preferential protection of LDL-C, and then adding surfactant to selectively measure sd LDL-C. In this method, a kit is used comprising two separate liquid reagents R1 and R2. The reagent R1 contains buffer solution, surfactant, protectant, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, catalase, chromogenic substrate, preservative and anti-interference components; the reagent R2 contains buffer solution, surfactant, peroxidase, color developing agent and preservative. The advantages are that: the method has the advantages of more excellent performance, high accuracy and specificity, effective anti-interference, wide linear range and higher cost performance, and provides a good choice for clinical needs.)

定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法。本发明还涉及一种定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。

背景技术

按照比重，脂蛋白可大致分为乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。目前LDL已经广泛应用于临床，以评价动脉硬化的危险程度。但近年来新的研究发现，LDL具有异质性，分为：(1)密度低、颗粒较大的低密度脂蛋白(large and buoyant,lb LDL)；(2)密度高、颗粒较小的低密度脂蛋白(small low-densitylipoprotein cholesterol,sd LDL)，简称为小而密低密度脂蛋白。已知，LDL是公认的动脉硬化的危险因素之一，然而sd LDL比lb LDL更具有致动脉粥样硬化的能力，因此临床开展sd LDL的检测有着非常重要的意义。

用于测定小而密低密度脂蛋白的方法包括超速离心、梯度凝胶电泳法、化学沉淀、高效液相色谱法等。这些方法普遍操作复杂，对实验室条件和操作人员要求较高，临床适用性不强。化学沉淀法虽然相对比较简便，但不容易沉淀完全，导致测定结果不够准确，也不适合临床广泛推广。

此外，PCT专利WO2004053500A1公开了一种通过使用分离剂(含二价阳离子和聚阴离子)与适合于全自动生化分析仪的试剂的组合来定量测定sd LDL-C中的胆固醇或者三酰甘油的方法。此方法虽然能够比电泳或者超速离心法更方便的测定sd LDL-C,但免不了需要预处理样本，并且需要LDL分离成sd LDL和除sd LDL外的LDL。

近来，公开号为CN101512012B(以下称文件1)和CN 101896620 B(以下称文件2)的中国授权发明专利，分别公开了利用表面活性剂与脂蛋白的特异性反应开发出直接定量检测sd LDL-C的方法。此类方法的出现，为直接测定样本中sd LDL-C开拓了新的思路。在该方法中，使用特殊的表面活性剂选择性地将非sd LDL-C脂蛋白胆固醇解离，其解离释放出的胆固醇酯被分解，使其不参与显色反应；然后清除剩余的sd LDL-C，并对其定量。这种直接测定sd LDL-C的方法可以称为匀相法，适合通过全自动生化分析仪器对临床大样本进行快速测定。目前，基于此方法的市售试剂正在各级医院临床实验室推广使用，且亦有一些国内的相关商品化试剂盒供应。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，它具有能有效抗干扰、排除非特异性的特点。本发明还公开了一种定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。

本发明所采用的第一个技术方案是：

定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，

所述方法首先在优先保护LDL-C的情况下，消除其它脂蛋白胆固醇，然后加入表面活性剂选择性的定量测定sd LDL-C。

本发明方法的创新点在于：

1、在测定的第一步，并非消除除小而密外的脂蛋白胆固醇，而是在优先保护LDL-C的情况下，消除其它脂蛋白胆固醇；在测定的第二步，并非加入强表面活性剂消除所有脂蛋白胆固醇，而是选择性的测定sd LDL-C。即，通过长期的研究发现，表面活性剂对脂蛋白胆固醇的解离并非绝对，在本发明的原理指导下，在对sd LDL-C定量的过程中，选择性的测定sd LDL-C可以尽可能保证除sd LDL-C之外的脂蛋白胆固醇不被反应，从而提高了sd LDL-C检测的特异性和准确度。

2、试剂R1中，重点关注了表面活性剂和保护剂的选择，且重点关注优选后的表面活性剂和保护剂的种类、浓度、比例的选择。即，发现表面活性剂和保护剂的选择以及他们的浓度、比例，对保护LDL-C，并消除除LDL-C之外的脂蛋白胆固醇起着重要作用，是提升本方法测定sd LDL-C的方法的效果的技术关键。这种选择在之前并未得到高度关注。即，表面活性剂和保护剂的选择高度契合测定原理，首先保护LDL-C，并消除除LDL-C外的脂蛋白胆固醇，然后选择性的测定sd LDL-C。如此，达到了特异性和准确度高，尽量避免临床数据出现假阳性的效果。

3、重点关注试剂中胆固醇测定用酶的来源、试剂中的浓度与比例的选择。即，试剂中胆固醇测定用酶的相关情况是本发明所述的方法准确定量测定人血清样本中sd LDL-C的关键因素。发现，不同来源的胆固醇测定用酶的稳定性、效价、作用效果等会存在极大的差别。

4、试剂R1中加入的防腐剂采用Proclin系列。该类防腐剂是一种新型的生物防腐剂，发现其与多种酶具有良好的相容性，且具有较好的低毒性和稳定性，极大维持了试剂的稳定性。

5、试剂R1的主要作用在于保护LDL-C，并消除除LDL-C之外的脂蛋白胆固醇，使其不被反应体系中的酶水解。即，试剂R1中的表面活性剂和保护剂，二者合适的添加比例及浓度能够有效地保护LDL-C，并且消除VLDL-C、HDL-C、CM等。同时，试剂R2的作用在于选择性解离sd LDL-C，同时确保非sd LDL-C类物质不参与或极少参与反应。前期，发明人在研究阳离子、阴离子、非离子型等数十种表面活性剂对脂蛋白选择性地解离作用中，主要考虑亲水亲油值和临界胶束浓度，步骤一中优先选择对LDL组分反应率低，而对CM和VLDL组分反应率高的表面活性剂作为试剂R1中的表面活性剂，可以是一种也可以是两种的复配。步骤二中优先选择对sd LDL反应高，lb LDL及其它组分反应率低的表面活性剂。即，达到了特异性和准确性高的效果。此外，该发明方法和技术可很好的提高试剂盒测定的线性范围，与市场上同类产品相比，现有试剂盒具有更高的线性测定范围。

本发明所采用的第二个技术方案是：

定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，

所述试剂盒包括R1和R2两种独立液体试剂，由试剂R1和试剂R2按体积比3:1组成。

所述试剂R1中含有缓冲液、表面活性剂、保护剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、显色底物、防腐剂、抗干扰成分；

所述试剂R2中含有缓冲液、表面活性剂、过氧化物酶、显色剂、防腐剂。

所述试剂R1中：表面活性剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂，保护剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂，防腐剂为山梨酸钾、庆大霉素、Proclin系列中的一种或多种，缓冲液为GOOD’S buffer、磷酸盐buffer中的一种或多种，显色底物为TOOS或DAOS，抗干扰成分为抗坏血酸氧化酶。

所述试剂R2中：表面活性剂为烷基苯磺酸盐类表面活性剂和聚丙烯酰胺类表面活性剂，防腐剂为叠氮化钠，缓冲液为GOOD’S buffer、磷酸盐buffer中的一种或多种，显色剂为4-氨基安替比林。

所述试剂R1中的表面活性剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂，HLB优选的具体实例包括但不限于HLB为11-14的化合物，例如烷基酚聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚等，以上表面活性剂的具体实例包括聚乙二醇烷基苯基醚JK-14、壬基酚聚氧乙烯醚NP-7。

所述试剂R1中的表面活性剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂，所述试剂R1中的保护剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂，HLB优选的具体实例包括但不限于HLB为12-13.5的化合物，例如聚氧乙烯烷基醚EM-701，壬基酚聚氧乙烯醚NP-10。

所述试剂R2中的表面活性剂，HLB优选的具体实例包括但不限于HLB为11.5-13.5的化合物，包括烷基苯磺酸盐和聚丙烯酰胺中的至少一种，例如HNL006和HEAL-06。

所述试剂R1中，缓冲液在溶液中的浓度为10-200mmol/L，优选20-100mmol/L；缓冲液的PH范围为6.0-8.0，优选6.0-7.0；表面活性剂在溶液中的浓度为0.01％-2％，优选0.03％-0.5％；保护剂在溶液中的浓度为0.01％-1％；胆固醇酯酶在试剂中浓度为0.5-5KU/L，优选2-5KU/L；胆固醇氧化酶在试剂中浓度为0.2-1KU/L，优选0.3-0.6KU/L；过氧化氢酶在试剂中浓度为300-1500KU/L，优选500-1200KU/L；显色底物在溶液中的浓度为0.5-6mmol/L，优选1-4mmol/L；防腐剂在溶液中的浓度为0.05％-0.2％；抗干扰成分在溶液中的浓度为0.5-8KU/L，优选2-5KU/L。

所述试剂R2中，缓冲液在试剂中浓度为10-200mmol/L，优选20-50mmol/L；缓冲液的PH范围为6.0-8.0，优选6.0-7.0；表面活性剂在溶液中的浓度为0.01％-2％，优选0.05％-1％；过氧化物酶在试剂中浓度为1-20KU/L，优选4-15KU/L；显色剂在溶液中的浓度为1-8mmol/L，优选2-5mmol/L；防腐剂在溶液中的浓度为0.05％-0.2％。

综上所述，本发明的定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒具有相对独特的原理和特点，试剂性能更为优良，准确性高、能有效抗干扰、排除非特异性、性价比更高，为临床需要提供了一个很好的选择。同时，所用试剂配方成分易于获得，成本低，能够满足大规模的产业化配制，并且能够便捷、可靠性高、效率高地满足临床实验室对sd LDL-C含量测定的需要。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是采用日立7180全自动生化分析仪，对11个梯度浓度混合的血清样本进行测定，并对测定值进行相关性分析的形成图。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值的均值。相关性系数R²＝0.999；线性方程：y＝1.0173x-0.0693。

图2是分别采用本发明试剂盒市售试剂A，采用日立7180全自动生化分析仪，对104个新鲜血清样本(覆盖线性范围，含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定数值进行相关性分析。其中X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是市售试剂A的测定值，具体实施例五中，相关性系数：R²＝0.9647,线性方程：y＝0.8809x+0.0969。

图3是本发明的实施例的具体检测程序的示意图。

具体实施方式

实施例1

定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法，首先在优先保护LDL-C的情况下，消除其它脂蛋白胆固醇，然后加入表面活性剂选择性的定量测定sd LDL-C。具体检测程序见图3所示。

该方法中需要使用试剂盒，而所用的试剂盒包括试剂R1和试剂R2两种独立液体试剂，且试剂R1和试剂R2体积比为3:1。

试剂R1中含有缓冲液、表面活性剂、保护剂、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、显色底物、防腐剂和抗干扰成分。

试剂R2中含有缓冲液、表面活性剂、过氧化物酶、显色剂、防腐剂。

其中，

缓冲液为GOOD’S buffer。

试剂R1中的表面活性剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂聚乙二醇烷基苯基醚JK-14；保护剂为聚乙二醇类非离子表面活性剂聚氧乙烯烷基醚EM-701；防腐剂为Proclin系列中的一种，本实施例1中为来源于Sigma公司的Proclin 300。

试剂R2中的表面活性剂为烷基苯磺酸盐HNL006；防腐剂为叠氮化钠。

抗干扰成分为抗坏血酸氧化酶。

显色剂为4-氨基安替比林。

更具体的，

试剂R1中：

缓冲液在溶液中的浓度为10mmol/L、缓冲液的PH＝8.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为0.01％；

保护剂在溶液中的浓度为0.01％；

胆固醇酯酶在试剂中浓度为0.5KU/L；

胆固醇氧化酶在试剂中浓度为0.2KU/L；

过氧化氢酶在试剂中浓度为300KU/L；

显色底物TOOS在溶液中的浓度为0.5mmol/L；

防腐剂Proclin300在溶液中的浓度为0.05％；

抗干扰成分在溶液中的浓度为0.5KU/L。

试剂R2中：

缓冲液在试剂中浓度为10mmol/L、缓冲液的PH＝8.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为0.05％；

过氧化物酶在试剂中浓度为1KU/L；

显色剂在溶液中的浓度为1mmol/L；

防腐剂在溶液中的浓度为0.05％。

在具体检测时：

1)检测仪器采用具有600nm主波长、700nm副波长，37℃恒温装置的生化仪；

2)待测样本选用新鲜不溶血血清。

3)操作步骤参见图3。

检测效果见表1。

实施例2

和实施例1的区别仅在于：

试剂R1中防腐剂为为Proclin系列中的一种，本实施例1中为来源于Sigma公司的Proclin 950；表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚NP-7；

试剂R2中的表面活性剂为聚丙烯酰胺HEAL-06。

试剂R1中：

缓冲液在溶液中的浓度为200mmol/L、缓冲液的PH为6.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为2％；

保护剂在溶液中的浓度为0.05％；

胆固醇酯酶在试剂中浓度为5kU/L；

胆固醇氧化酶在试剂中浓度为1KU/L；

过氧化氢酶在试剂中浓度为1500KU/L；

显色底物TOOS在溶液中的浓度为6mmol/L；

防腐剂Proclin950在溶液中的浓度为0.1％；

抗干扰成分在溶液中的浓度为8kU/L。

试剂R2中：

缓冲液在试剂中浓度为200mmol/L、缓冲液的PH为6.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为3％；

过氧化物酶在试剂中浓度为20KU/L；

显色剂在溶液中的浓度为8mmol/L；

防腐剂叠氮化钠在溶液中的浓度为0.2％。

检测方法同于实施例1。

检测效果见表1。

实施例3

和实施例1的区别仅在于：

显色底物为DAOS。

试剂R2中的表面活性剂为质量比为1:1的烷基苯磺酸盐HNL006和聚丙烯酰胺HEAL-06的混合物。

更具体的，

试剂R1中：

缓冲液在溶液中的浓度为10mmol/L、缓冲液的PH为8.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为0.3％；

保护剂在溶液中的浓度为0.1％；

胆固醇酯酶在试剂中浓度为4KU/L；

胆固醇氧化酶在试剂中浓度为0.6KU/L；

过氧化氢酶在试剂中浓度为1200KU/L；

显色底物在溶液中的浓度为2mmol/L；

防腐剂在溶液中的浓度为0.2％；

抗干扰成分在溶液中的浓度为3kU/L。

试剂R2中：

缓冲液在试剂中浓度为10mmol/L、缓冲液的PH为8.0；

表面活性剂聚丙烯酰胺HEAL-06和烷基苯磺酸盐HNL006在溶液中的浓度为0.5％；

过氧化物酶在试剂中浓度为5KU/L；

显色剂在溶液中的浓度为4mmol/L；

防腐剂叠氮化钠在溶液中的浓度为0.1％。

检测方法同于实施例1。

检测效果见表1。

实施例4

和实施例1的区别仅在于：

缓冲液为磷酸盐buffer。

试剂R1中的防腐剂为Proclin系列中的一种，本实施例4中为来源于Sigma公司的Proclin 150。

更具体的，

试剂R1中：

缓冲液在溶液中的浓度为200mmol/L、缓冲液的PH为6.0；

表面活性剂在溶液中的浓度为0.6％；

保护剂在溶液中的浓度为1％；

胆固醇酯酶在试剂中浓度为4KU/L；

胆固醇氧化酶在试剂中浓度为0.6KU/L；

过氧化氢酶在试剂中浓度为1200KU/L；

显色底物在溶液中的浓度为2mmol/L；

防腐剂在溶液中的浓度为0.2％；

抗干扰成分在溶液中的浓度为4kU/L。

试剂R2中：

缓冲液在试剂中浓度为50mmol/L、缓冲液的PH为6.5；

表面活性剂在溶液中的浓度为1％；

过氧化物酶在试剂中浓度为5KU/L；

显色剂在溶液中的浓度为4mmol/L；

防腐剂叠氮化钠在溶液中的浓度为0.1％。

检测方法同于实施例1。

检测效果见表1。

实施例5

和实施例1的区别仅在于：

试剂R1中的防腐剂为防腐剂为Proclin系列中的一种，本实施例5中为来源于Sigma公司的Proclin 150。

更具体的，

试剂R1中：

缓冲液在溶液中的浓度为50mmol/L、缓冲液的PH为6.5；

表面活性剂在溶液中的浓度为0.3％；

保护剂在溶液中的浓度为0.08％；

胆固醇酯酶在试剂中浓度为4KU/L；

胆固醇氧化酶在试剂中浓度为0.6KU/L；

过氧化氢酶在试剂中浓度为1200KU/L；

显色底物在溶液中的浓度为2mmol/L；

抗干扰成分在溶液中的浓度为4KU/L；

防腐剂在溶液中的浓度为0.2％；

试剂R2中：

缓冲液在试剂中浓度为50mmol/L、缓冲液的PH为6.5；

表面活性剂在溶液中的浓度为1％；

过氧化物酶在试剂中浓度为5KU/L；

显色剂在溶液中的浓度为4mmol/L；

防腐剂叠氮化钠在溶液中的浓度为0.1％。

检测方法同于实施例1。

检测效果见表1。

效果例

(1)相关性实验

将本发明的实施例1—5的试剂盒与市售某试剂(命名为市售试剂A)，采用日立7180全自动生化分析仪，对104例样本(覆盖线性范围)测定，并对测定结果进行相关性分析。实例1—5与市售试剂A相关性系数为：R²＝0.9647,线性方程：y＝0.9787x+0.1076。实验结果见表1。

表1

由表1且参见图1可知，本发明的试剂(实例五)与市售试剂A的相关性较好。

(2)线性范围

用接近线性区间下限的低浓度样品(命名为L)稀释接近线性区间上限的高浓度样品(命名为H)，按表1混合成11个稀释浓度(xi)。分别测试试剂盒，每个稀释浓度测试3次，分别求出测定结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)。

用稀释浓度(xi)代入线性回归方程，计算yi的估计值yc及yi与估计值yc的线性偏差,计算相对偏差B％。结果见表2及图2。

表2

通过表2的结果得到，本发明试剂检测结果的线性相关系数r²＝0.999，线性方程为：y＝1.10173x-0.0693；R²＝0.999，说明本发明试剂的线性情况较好；且线性相对偏差应未超过±3.0％，说明可测量范围是可接受的。

(3)抗干扰实验

在实施例3的基础上实施例5的R1中添加4KU/L的抗坏血酸氧化酶，对104例临床样本检测的相关性明显提高。此外，对实施例5的试剂进行胆红素、抗坏血酸、脂肪乳和血红蛋白抗干扰实验，检测其抗干扰能力。结果见表3。

表3

从表3可以看出，表明本发明的sd LDL-C检测试剂盒的抗干扰性能较好，胆红素≤60mg/dL；抗坏血酸≤50mg/dL；脂肪乳≤300mg/dL；血红蛋白≤800mg/dL对检测结果没有影响。

综上所述，本发明的定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的方法和试剂盒具有相对独特的原理和特点，试剂性能更为优良，能有效抗干扰、排除非特异性、性价比更高，为临床需要提供了一个很好的选择。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。