一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法
阅读说明：本技术 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法 (Small and dense low-density lipoprotein cholesterol detection kit and detection method thereof ) 是由 谢蒙 张闻 陈媛 周海滨 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括试剂1和试剂2,试剂1含GOOD’s缓冲液、保护剂环糊精、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化物酶、稳定剂prionex、防腐剂pc300和色原TOOS；试剂2包括GOOD’s缓冲液、曲拉通X-405和4AAP。试剂盒的检测方法：试剂1和样本按照一定的比例在特定条件下处理一定时间,之后按照一定的比例加入试剂2,同样在特定条件下处理一定时间,根据吸光度值的变化定量测定小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量。本发明所述的一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒,含有环糊精类保护剂以及特殊的稳定剂,尤其对于低密度脂蛋白胆固醇和小而密低密度脂蛋白胆固醇浓度都比较高的高值样本,检测准确度高,稳定性好,能满足临床检验需要。(The invention discloses a small and dense low-density lipoprotein cholesterol detection kit and a detection method thereof. The kit comprises a reagent 1 and a reagent 2, wherein the reagent 1 contains GOOD's buffer solution, protective agent cyclodextrin, cholesterol esterase, cholesterol oxidase, phospholipase, peroxidase, stabilizer prionex, preservative pc300 and chromogen TOOS; reagent 2 included GOOD's buffer, Triton X-405 and 4 AAP. The detection method of the kit comprises the following steps: treating the reagent 1 and the sample according to a certain proportion for a certain time under a specific condition, then adding the reagent 2 according to a certain proportion, treating for a certain time under the same specific condition, and quantitatively determining the content of the small and dense low-density lipoprotein cholesterol according to the change of the absorbance value. The small and dense low-density lipoprotein cholesterol detection kit contains the cyclodextrin protective agent and the special stabilizer, and particularly has high detection accuracy and good stability for high-value samples with high low-density lipoprotein cholesterol and small and dense low-density lipoprotein cholesterol concentrations, and can meet the requirements of clinical examination.)
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体是一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
临床上血脂异常波动常会导致冠心病(CAD)的发生。低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，LDL)是公认的致动脉粥样硬化的脂蛋白的代表；国内外各大血脂管理指南均强调，LDL胆固醇(LDL cholesterol，LDL-C)是降低CAD风险的重点干预靶标。近年研究表明，LDL亚型中，密度高而颗粒小的小而密LDL(small dense LDL，sd LDL)与动脉粥样硬化的关系更为密切；sd LDL或sd LDL胆固醇(sd LDL cholesterol，sd LDL-C)水平作为评估和预测CAD风险的指标比LDL或LDL-C更为敏感。
目前国内有关sd LDL-C检测试剂盒中的保护剂，基本上是非离子型表面活性剂，这些非离子表面活性剂保护小而密低密度脂蛋白胆固醇的原理是降低酶对其的反应性，但不能完全抑制，上述这种情况，相对应的酶不能加太多，太多的话，低值样本中的小而密低密度脂蛋白胆固醇有可能被消耗完，从而导致结果偏低，若酶量不足，一般正常样本没有影响，但是在检测普通低密度脂蛋白胆固醇高值样本时，非小而密低密度脂蛋白胆固醇无法完全消耗完，会导致结果偏高的问题。同样，目前测定低密度脂蛋白胆固醇的稳定剂多种多样，稳定性效果不一，会出现因为试剂不稳定而出现假阳性的情况。
因此，提供一种高检测值范围且稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，是满足临床开展小而密低密度脂蛋白胆固醇检测的迫切需求，同时也为动脉硬化性心血管疾病(ASCVD)的防控和危险评估领域的发展提供支持。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种高检测范围、稳定性好的小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂盒，并说明检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂1和试剂2，其中所述试剂1包括：
100～5000U/L胆固醇脂酶、
10～2000U/L胆固醇氧化酶、
5～500U/L磷脂酶、
0.1～10kU/L过氧化物酶、
体积百分比0.1％～5％稳定剂Prionex、
0.1～10mM/L色原TOOS和质量百分比0.1％～5％保护剂环糊精或环糊精衍生物；所述试剂2包括：体积百分比0.1％～5％曲拉通和0.1～10mM/L 4AAP。
进一步地，其中所述试剂2中的曲拉通包括曲拉通X-100、X-114、X-200或X-405。
进一步地，所述试剂1还包括缓冲液10～200mM/L GOOD’s，所述试剂2还包括缓冲液10～100mM/L GOOD’s，其中所述的GOOD’s缓冲液为TRIS、MOPS、POPOS、HEPES或PIPES中的一种。
进一步地，其中GOOD’s缓冲液较优的为HEPES缓冲液。
进一步地，其中所述试剂1还包括0.1～1ml/L防腐剂ProClin。
进一步地，其中所述试剂1中的防腐剂ProClin包括ProClin150、200、300或5000。进一步地，所述试剂盒，较优的试剂1包括：
500～5000U/L胆固醇脂酶、
100～1000U/L胆固醇氧化酶、
20～200U/L磷脂酶、1～8kU/L过氧化物酶、
体积百分比0.2％～3％稳定剂Prionex、
0.5～8mM/L色原TOOS、
和质量百分比0.5％～3％保护剂环糊精或环糊精衍生物；
所述试剂2包括：
体积百分比0.5％～3％曲拉通X-405和0.1～10mM/L 4AAP。
进一步地，其中试剂1中的保护剂环糊精或环糊精衍生物包括α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇的检测方法，包括以下步骤：
S1：样本和标准品中分别添加上述任意一项试剂1，保温反应一段时间后，测定样本和标准品吸光度；
S2：完成操作S1后，继续添加上述任意一项所述的试剂2，保温反应一段时间后，测定样本和标准品的吸光度。
进一步地，其中，S1步骤中，样品与试剂1、标准品与试剂1的体积比均为1∶50；S2步骤中，试剂1与试剂2的体积比为3∶1。
本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原理：首先本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒加入的保护剂环糊精或者各种环糊精衍生物，在反应第一步可以起到保护sdLDL-C的作用，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、磷脂酶、过氧化氢酶将未被环糊精或环糊精衍生物保护起来的非小而密低密度脂蛋白胆固醇作为底物清除。
试剂2中加入样本中，被保护的sd LDL-C解除保护，进而在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶作用下，生成过氧化氢，然后过氧化氢在过氧化物酶的作用下，与TOOS偶联发生显色反应，然后通过比色法进行测定。
用吸光度差值进行计算，根据式1计算低密度脂蛋白胆固醇浓度；
校准程序：
使用配套的校准品作校准曲线，建议更换试剂批号后请重新校准。
质量控制程序：
使用配套的质控品，控制相对偏差在质控品允许范围内。
小而密低密度脂蛋白胆固醇的计算方法，式1：
ΔA测定：检测样本加入试剂1和加入试剂2的吸光度之差；
ΔA标准：标准品加入试剂1和加入试剂2的吸光度之差。
综上所述，本发明的有益效果：
本发明小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中加入的保护剂环糊精或者环糊精衍生物，能够很好的抑制小而密低密度脂蛋白胆固醇与试剂1中的胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶以及过氧化物酶作用，对于检测样本中低密度脂蛋白和小而密低密度脂蛋白同样较高浓度情况下，能够提供高准确性的检测结果。
本发明小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中加入的稳定剂prionex，是一种猪胶原蛋白片段，能提高胆固醇酶的稳定性，避免因为试剂不稳定或者试剂盒储存时间久而出现假阳性的情况。
附图说明
图1为本发明实施例6与市售试剂盒进行相关性验证的线性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
(1)试剂的制备：
配制试剂1∶1％(质量百分比)环糊精、1000U/L胆固醇脂酶(CHER)、500U/L胆固醇氧化酶(CHOD)、50U/L磷脂酶、1％(体积百分比)稳定剂Prionex、0.5ml/L防腐剂ProClin300、5kU/L过氧化物酶、5mM/L色原TOOS和GOOD’s缓冲液HEPES 50mM/L。
配制试剂2：其中包括5mM/L4AAP、曲拉通X-405 1％(体积百分比)和GOOD’s缓冲液HEPES 50mM/L。
(2)检测方法
采用该试剂盒进行检测，检测仪器可根据不同检测仪器获得不同的上机参数，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，37℃恒温检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sd LDL-C的浓度。
实施例2：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原料，包括：试剂1∶50mM/L HEPES缓冲液、1％(质量百分比)d环糊精、1000U/L胆固醇脂酶、500U/L胆固醇氧化酶、50U/L磷脂酶、1％(体积百分比)Prionex、0.5ml/L ProClin300、5kU/L过氧化物酶和5mM/L TOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、1％(体积百分比)曲拉通X-405和5mM/L 4AAP。
采用该试剂盒进行检测，检测仪器为日立全自动生化分析仪7180，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，37℃恒温检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sdLDL-C的浓度。
检测结果如下表1。
实施例3：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原料，包括：试剂1∶50mM/L HEPES、1％(质量百分比)β环糊精、1000U/L胆固醇脂酶、500U/L胆固醇氧化酶、50U/L磷脂酶、1％(体积百分比)Prionex、0.5ml/L ProClin300、5kU/L过氧化物酶和5mM/L TOOS，试剂2∶50mM/LHEPES、1％(体积百分比)曲拉通X-405和5mM/L 4AAP。
采用该试剂盒进行检测，检测仪器为日立全自动生化分析仪7180，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，反应温度为37℃，检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sd LDL-C的浓度。
检测结果如下表1。
实施例4：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原料，包括：试剂1∶50mM/L HEPES、1％(质量百分比)α环糊精、2000U/L胆固醇脂酶、1000U/L胆固醇氧化酶、50U/L磷脂酶、0.5％(体积百分比)Prionex、0.5ml/L ProClin300、5kU/L过氧化物酶和5mM/L TOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、1％(体积百分比)曲拉通X-405和5mM/L 4AAP。
采用该试剂盒进行检测，检测仪器为日立全自动生化分析仪7180，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，37℃恒温检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sdLDL-C的浓度。
检测结果如下表1。
实施例4：
验证试验，对上述实施例2～4中的产品进行测试，并与其他公司同类型产品进行对比。
对照例(1)：
试剂1∶50mM/L HEPES、0.3g/L EMULGEN A-90、0.3g/L EMULGEN B-66、1000U/L胆固醇脂酶、500U/L胆固醇氧化酶、50U/L磷脂酶、1％(体积百分比)Prionex、0.5ml/LProClin300、5kU/L过氧化物酶和5mM/L TOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、1％(体积百分比)曲拉通X-405和5mM/L 4AAP。
对照例(2)：
试剂1∶50mM/LHEPES、1％(质量百分比)d环糊精、1000U/L胆固醇脂酶、500U/L胆固醇氧化酶、50U/L磷脂酶、1％(质量百分比)BSA、0.5ml/L ProClin300、5kU/L过氧化物酶和5mM/LTOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、1％(体积百分比)曲拉通X-405和5mM/L 4AAP。
市售试剂(3)：
市售试剂盒为一国内市售的试剂盒，名称为：小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(过氧化物酶法)。
标准样品(4)：
配制低密度脂蛋白胆固醇不同浓度的标准样本，分别为0、0.25、0.5、0.75、1mM/L，分别用本发明试剂盒和对照试剂盒测定其浓度。测定结果如表1。
实施例5：
对上述实施例2～4中的样品与对照例(2)同类型产品进行对比，检测37℃条件下的试剂盒的稳定性。
先用冷藏的试剂分别在全自动生化分析仪上定标，测2遍质控，取平均值作0天结果。
然后将各试剂分装成8套，放入37℃水浴锅中。每天取一套出来检测质控。结果见表3。
实施例6：
相关性实验：与实施例2配方配制试剂相同，对比市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)试剂盒进行对照检测，同时检测了40个临床血清样本，检测结果如表4所示。并获得了两种试剂的相关性曲线(如图1所示)，通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.971，说明了两者有很好的相关性。
实施例7：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原料，包括：试剂1∶50Mm/L HEPES、0.1％(质量百分比)β环糊精、5000U/L胆固醇脂酶、10U/L胆固醇氧化酶、5U/L磷脂酶、0.5％(体积百分比)Prionex、0.1ml/L ProClin300、10kU/L过氧化物酶和0.1mM/L TOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、5％(体积百分比)曲拉通X-405和0.1mM/L 4AAP。
采用该试剂盒进行检测，检测仪器为日立全自动生化分析仪7180，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，反应温度为37℃，检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sd LDL-C的浓度。
实施例8：
一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的原料，包括：试剂1∶50Mm/L HEPES、5％(质量百分比)β环糊精、100U/L胆固醇脂酶、1000U/L胆固醇氧化酶、500U/L磷脂酶、0.1％(体积百分比)Prionex、0.5ml/L ProClin300、0.1kU/L过氧化物酶和10mM/L TOOS，试剂2∶50mM/L HEPES、0.1％％(体积百分比)曲拉通X-405和10mM/L 4AAP。
采用该试剂盒进行检测，检测仪器为日立全自动生化分析仪7180，反应温度为37℃，样本体积为3μl，试剂1体积为150μl，反应时间5min，测定样本吸光度，之后加入试剂2体积为50μl，反应温度为37℃，检测时间5min，测定样本吸光度，以上测定吸光度时选定的主/副波长为600/700nm，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标，根据式1计算样本中sd LDL-C的浓度。
表1：低密度脂蛋白胆固醇一般的小而密低密度脂蛋白胆固醇高值样本：实施例、对照例以及市售试剂对比实验数据
上述表1实验数据可以看出，基于低密度脂蛋白胆固醇含量一般的小而密低密度脂蛋白胆固醇的高值样本，本发明公开的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒与对照例相比，具有更好的相关性，对照例1使用的保护剂是市面上其他试剂盒所使用的保护剂，这进一步说明环糊精类保护剂在试剂盒的实用中更够更好的保护sd LDL-C，提高检测的准确度，与市售试剂盒相比，本发明提供的实施例2～4所制备的试剂盒具有更高的相关性。
表2：低密度脂蛋白胆固醇较高的小而密低密度脂蛋白胆固醇高值样本：实施例与对照试剂对比实验数据
浓度梯度
实施例2
实施例3
实施例4
对照例1
市售试剂
0
0.00
0.00
0
0
0
0.25
0.80
0.78
0.77
0.75
0.76
0.5
1.54
1.55
1.56
1.58
1.54
0.75
2.25
2.19
2.26
2.67
2.59
1
2.93
2.91
2.97
4.12
3.97
R2
0.999
0.999
0.999
0.98
0.982
上述表2实验数据可以看出，基于低密度脂蛋白胆固醇含量较高的小而密低密度脂蛋白胆固醇的高值样本，本发明公开的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒与对照例和市售试剂盒相比，R2值均在0.999以上，而对照例和市售试剂盒上R2优均为0.98，本发明的试剂盒检测结果优势凸显，准确度明显较高。结合上表1和2和实验数据，本发明公开的sd LDL-C试剂盒，更够在临床检测上对于低密度脂蛋白胆固醇较高的小而密低密度脂蛋白胆固醇高值样本提供更准确的检测结果。
表3：实施例5稳定性实验数据
37℃
实施例2
实施例3
实施例4
对照例2
0天
1.21
1.21
1.2
1.2
1天
1.21
1.2
1.2
1.21
2天
1.21
1.19
1.2
1.22
3天
1.22
1.21
1.23
1.22
4天
1.21
1.2
1.22
1.24
5天
1.23
1.23
1.25
1.32
6天
1.22
1.23
1.24
1.35
7天
1.31
1.25
1.26
1.44
8天
1.33
1.27
1.26
1.56
CV(％)
3.91％
2.26％
1.98％
9.56％
变异系数(CV)，能够更加直观的体现多组数据的变异程度，一般公认的CV＜5％是比较稳定数据。从上述表3的实验数据可以看出，本发明公开的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒3组实施例的CV值均小于5％，对sd LDL-C具有较好的检测效果，与对照例2相比，CV值为9.56％。本发明中实施例2～4所提供的试剂盒中添加了稳定剂Prionex，对照例(2)中的试剂盒配方中没有添加稳定剂，Prionex能够很大程度上提高试剂盒中各种酶的稳定性，延长试剂盒的使用期限。
表4：市售试剂盒和实施例相关性实验数据
样本编号
市售试剂
实施例
1
1.11
1.11
2
0.57
0.51
3
0.47
0.41
4
0.63
0.62
5
0.59
0.55
6
0.59
0.57
7
1.23
1.13
8
0.56
0.59
9
0.44
0.48
10
0.24
0.25
11
1.76
2.02
12
0.56
0.57
13
0.82
0.88
14
0.47
0.45
15
0.64
0.68
16
1.29
1.4
17
0.37
0.39
18
1.57
1.55
19
1.17
1.46
20
0.95
0.87
21
0.83
0.78
22
0.57
0.43
23
0.55
0.56
24
0.74
0.75
25
1.22
1.21
26
1.47
1.51
27
1.22
1.25
28
0.45
0.49
29
0.5
0.54
30
0.86
0.82
31
0.47
0.45
32
0.68
0.67
33
1.22
1.15
34
1.12
1.12
35
0.41
0.42
36
0.82
0.81
37
0.65
0.66
38
2.67
2.71
39
1.67
1.44
40
0.73
0.77
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。