一种血清高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及使用方法
阅读说明：本技术 一种血清高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及使用方法 (Serum high-density lipoprotein cholesterol detection kit and use method thereof ) 是由 华权高 沈鹤霄 于 2019-03-31 设计创作，主要内容包括：一种均相法检测血清高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及使用方法,包括如下步骤：该方法利用大环主体化合物及其衍生物在表面活性剂的作用下对脂蛋白进行选择性遮蔽,仅使高密度脂蛋白中的胆固醇参与胆固醇反应。从而特定测定血清中高密度脂蛋白胆固醇的浓度。(A kit for detecting serum high-density lipoprotein cholesterol by a homogeneous phase method and a using method thereof comprise the following steps: the method selectively shields the lipoprotein by using a macrocyclic main compound and a derivative thereof under the action of a surfactant, and only cholesterol in high-density lipoprotein participates in cholesterol reaction. Thereby specifically determining the concentration of high density lipoprotein cholesterol in serum.)
技术领域
本发明涉及医学诊断领域，具体涉及一种血清高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及使用方法。
背景技术
血清高密度脂蛋白胆固醇的测定是临床常规检验项目,目前其测定方法主要为磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg)和基于选择性抑制原理的匀相抑制法(SI)。PTA-Mg法测定时需沉淀、离心等步骤,无法应用于自动生化分析仪;SI法无需对标本进行特殊处理,操作简便,适合自动分析〔1, 2〕,但测定试剂依赖进口,价格昂贵、检测成本高。实现HDL-C的匀相直接测定,必须预先将血清中的游离胆固醇清除,否则该部分胆固醇将参与HDL-C的显色反应,使测定结果偏高。
高密度脂蛋白胆固醇均相法(HDL-C homogeneous methods)测定通称直接法(Direct Method)测定。由于标本不需预处理, 可用自动分析仪检测, 适合于大规模流行病学调查及工作量大的实验室使用, 且具有标本用量少、快速、简便、精密度高等优点, 因而日益为临床实验室采用。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题而提供。
本发明通过以下技术方案实现：该试剂的测定原理是:第一试剂(RⅠ)中大环主体化合物如葫芦脲、环蕃或二者的衍生物等在表面活性剂的作用下,与CM 、VLDL、LDL 形成可溶性复合物。这些复合物能抵抗变构酶的作用;PEG6000或葡聚糖右旋糖苷与ChER和ChOD共价结合, 引起酶的变构, 变构酶对脂蛋白的大小和/或电荷具有选择性, 其顺序依次为LDL<VLDL<CM<HDL。而大环主体化合物能限制CM 、VLDL颗粒进入环状的大环结构, 从而避免酶的催化作用, 这种作用还与表面活性剂浓度有关；第二试剂(RⅡ)中的表面活性剂、酶及色原则可使HDL释放出胆固醇(CHO), 可测出高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量。
一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包含试剂Ⅰ和试剂Ⅱ以及高密度脂蛋白胆固醇标准品，试剂Ⅰ包含大环主体化合物、和分散型两性表面活性剂，试剂Ⅱ含有表面活性剂和稳定剂。
进一步的，试剂Ⅰ中的大环化合物优选为为葫芦脲、环蕃的或者其衍生物的至少一种或其混合。
进一步的，试剂Ⅰ中MOPSO缓冲液80mmol/L，2.5KU/L胆固醇氧化酶，5KU/L过氧化物酶，240mmol/L偶联剂，葫芦脲5g/L，表面活性剂10g/L，稳定剂；试剂Ⅱ，含有MOPSO缓冲液80mmol/L，显色剂80mg/L，表面活性剂10g/L，2KU/L胆固醇酯酶，稳定剂适量。
进一步的，试剂Ⅰ中MOPSO缓冲液80mmol/L，2.5KU/L胆固醇氧化酶，5KU/L过氧化物酶，240mmol/L 4-氨基安替比林，环蕃5g/L，表面活性剂10g/L，稳定剂；试剂Ⅱ，含有MOPSO缓冲液80mmol/L，显色剂80mg/L，表面活性剂10g/L，2KU/L胆固醇酯酶，稳定剂适量。
进一步的，显色剂优选为N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)或其衍生物；试剂盒所用的胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶位PEG6000修饰过的变构酶。
进一步的，一种检测血清高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，组分为试剂Ⅰ(R1)含MOPSO缓冲液(pH6.5) 80mmol/L、胆固醇氧化酶2.5KU/L、过氧化物酶5KU/L、4-氨基安替比林240mmol/L、大环主体化合物5g/L、多聚半乳糖醛酸钠盐6g/L、8g/L丙氨酰谷氨酰胺4g/L、BSA 1g/L;试剂Ⅱ(R2)含MOPSO缓冲液(pH6.5)、决明胶羟丙基三甲基氯化铵、2KU/L胆固醇酯酶、显色剂、BSA 1g/L。
进一步的，一种检测血清高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒，组分为试剂Ⅰ(R1)含MOPSO缓冲液(pH6.5)、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、4-氨基安替比林、大环主体化合物、多聚半乳糖醛酸钠盐、8g/L丙氨酰谷氨酰胺、稳定剂适量;试剂Ⅱ(R2)含MOPSO缓冲液(pH6.5)、决明胶羟丙基三甲基氯化铵、2KU/L胆固醇酯酶、显色剂、BSA 1g/L。
附图说明
图1 本发明实施例1与标准方法相关性。
图2 本发明实施例2与标准方法相关性。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。
注：以下所用的胆固醇氧化酶，过氧化物酶为PEG修饰过的酶。
实施例1 R1含有葫芦脲
按照以下组分配置高密度脂蛋白胆固醇试剂盒的两种试剂
试剂Ⅰ（R1）：
MOPSONa缓冲液(pH6.5) 80mmol/L
胆固醇氧化酶 2.5KU/L
过氧化物酶 5KU/L
4-氨基安替比林 240mmol/L
Cucurbit[6]uril hydrate 葫芦[6]脲5g/L
多聚半乳糖醛酸钠盐 6g/L
丙氨酰谷氨酰胺 8g/L
BSA 1g/L
试剂Ⅱ(R2)：80mmol/LMOPS缓冲液(pH6.5)
10g/L决明胶羟丙基三甲基氯化铵
2KU/L胆固醇酯酶
80mg/L N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)
BSA 1g/L
实施例2 R1含有环蕃
按照以下组分配置高密度脂蛋白胆固醇试剂盒的两种试剂
试剂Ⅰ（R1）：
MOPSONa缓冲液(pH6.5) 80mmol/L
胆固醇氧化酶 2.5KU/L
过氧化物酶 5KU/L
4-氨基安替比林 240mmol/L
1,6,20,25-四氮杂[6.1.6.1]对环芳烷 5g/L
多聚半乳糖醛酸钠盐 6g/L
丙氨酰谷氨酰胺 8g/L
BSA 1g/L
试剂Ⅱ(R2)：80mmol/LMOPS缓冲液(pH6.5)
10g/L决明胶羟丙基三甲基氯化铵
2KU/L胆固醇酯酶
80mg/L N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)
BSA 1g/L
对比实施例1
试剂Ⅰ(R1)：
MOPSO缓冲液(pH6.5) 80mmol/L
胆固醇氧化酶 2.5KU/L
过氧化物酶 5KU/L
4-氨基安替比林 240mmol/L
三甲基-β-环糊精 5g/L
聚氧乙烯-聚氧丙烯缩合物F88 10g/L
聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚 8g/L
BSA 1g/L
试剂Ⅱ(R2)：
MOPSO-MOPSONa缓冲液(pH6.5) 80mmol/L
环氧乙烷十八烷胺 10g/L
胆固醇酯酶 2KU/L
N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS) 80mg/L
BSA 1g/L
制备的三种HDL-C 试剂于Olympus 自动分析仪操作如下:血清3 μl ,RⅠ试剂225μL 37℃反应3 分钟(其它自动分析仪或分光光度计5 分钟, 余均同),RⅡ试剂75μL 37℃反应5分钟, 主波长600 nm , 副波长700 nm,用吸光度差进行计算。反应类型:两点法;反应温度:37℃;样品:3.L,加R1 225μL反应5min后读取空白读数(A1),然后加入R2 75μL反应5min,读取测定读数(A2)。计算血清HDL-C含量(mmol/L)=〔(∆A)测定管/(∆A)标准管〕×标准液浓度
实验例：1.特异性
在一份混合血清(HDL-C为0.97mmol/L)中加入不同量的经超离心提纯的HDL组份,加入量分别为1.4,2.8,4.2,5.6,7.0和8.4mmol/L,然后分别用本发明制备的两种试剂盒测定。结果表明,8.4mmol/L的LDL-C仅使测定结果偏高3.4%和3.2%;另取一份HDL-C为1.24mmol/L的混合血清,分别加入脂肪乳剂(TG)、胆红素、血红蛋白,观察HDL-C含量影响。结果表明:TG<10mmol/L、胆红素<280mg/L、血红蛋白<12g/L时对两种试剂盒的测定结果无影响,提示本法具有良好特异性。
2. 线性关系
制备HDL-C含量分别为0.81,1.59,2.36,3.13和3.90mmol/L标本,5个不同值标本分别用了两种试剂盒各测定10次。结果表明,本发明制备的两种试剂盒在0~3.90mmol/L范围内线性良好,回归方程为Y=0.985X-0.039和Y=0.991X-0.012,相关系数(r)=0.9987和0.9991。
3.精密度
取高、中、低3份血清样品,每份均分为9份,按本发明制备试剂盒的两种方法以及对比实施例1的方法测定。测得血清HDL-C平均值,批内变异系数和批间变异系数。
5.不同方法测定结果比较
取HDL-C含量在0.36~3.47mmol/L的血清标本81份,使用本发明制备的两种试剂盒与PTA-Mg法比较, 偏差分别为-0.45 %、0.55%和+0.41%、0.49%, 总误差<5 %, 完全达到NCEP提出总误差<13 %的目标。测定线性范围能达到临床要求, 不受胆红素(<200 mg/L)、血红蛋白(<7.5 g/L)的影响。显示本法与PTA-Mg法相关性良好。