阅读说明：本技术 一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 (High-accuracy high-density lipoprotein cholesterol detection kit ) 是由 王莉 侯军霞 刘振国 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明适用于高密度脂蛋白胆固醇检测技术领域,提供了一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒,包括包括第一试剂和第二试剂；第一试剂包括缓冲液I、凝集剂、显色剂、第一防腐剂、表面活性剂I、表面活性剂II、保护剂和酶I；第二试剂包括缓冲液、助色剂、第二防腐剂、保护剂、表面活性剂II和酶II；酶I包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶,其中胆固醇氧化酶来源于假单胞菌属；酶II为胆固醇酯酶,来源于裂殖菌或假单胞菌属；第一试剂中,表面活性剂I和表面活性剂II的浓度比为：1:3～4。借此,本发明能够提高HDL-C检测的准确度,解决现有技术中HDL-C检测试剂检测准确度低的问题,为相关疾病的诊断及预防提供了可靠依据。(The invention is suitable for the technical field of high-density lipoprotein cholesterol detection, and provides a high-accuracy high-density lipoprotein cholesterol detection kit, which comprises a first reagent and a second reagent; the first reagent comprises a buffer solution I, a agglutinant, a color developing agent, a first preservative, a surfactant I, a surfactant II, a protective agent and an enzyme I; the second reagent comprises a buffer solution, a color assisting agent, a second preservative, a protective agent, a surfactant II and an enzyme II; enzyme I comprises cholesterol oxidase and peroxidase, wherein the cholesterol oxidase is derived from Pseudomonas; enzyme II is cholesterol esterase derived from schizomycete or Pseudomonas; in the first reagent, the concentration ratio of the surfactant I to the surfactant II is as follows: 1: 3-4. Therefore, the invention can improve the detection accuracy of HDL-C, solve the problem of low detection accuracy of HDL-C detection reagents in the prior art, and provide reliable basis for diagnosis and prevention of related diseases.)

一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

技术领域

本发明涉及高密度脂蛋白胆固醇检测技术领域，尤其涉及一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。

背景技术

胆固醇在血液中存在于脂蛋白中，其存在形式包括高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇几种。在血液中存在的胆固醇绝大多数都是和脂肪酸结合的胆固醇酯，仅有10％不到的胆固醇是以游离态存在的。胆固醇在体内有着广泛的生理作用，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与胆石症与高胆固醇血症有密切的相关性。高密度脂蛋白有助于清除细胞中的胆固醇。因此，测定HDL-C在临床上有重要意义。

目前HDL-C含量测定在临床实验中已经常规化。美国胆固醇教育计划对HDL-C测定的建议中指出：HDL-C在一个很窄的浓度范围内与冠心病呈负相关，冠心病危险增高的界限是在HDL-C浓度范围的低端，测定的细小误差会产生相对大的影响，因此，HDL-C测定的准确性非常重要。

现有的测定方法中，包括第一代直接测定法、第二代磁性硫酸葡聚糖法和第三代匀相测定法；现有技术中经常使用的方法是匀相测定法，包括PEG修饰酶法、选择性抑制法、抗体法和过氧化氢酶法。PEG修饰法需要对酶进行修饰，很大程度上降低了酶的活性，造成成本增加；抗体法中特异性抗体价格昂贵且反应步骤多，实用性差；选择抑制法的关键是表面活性剂的选择，但表面活性剂的使用比较困难，对非高密度脂蛋白的掩蔽抑制不完全，同时对高密度脂蛋白的释放不彻底。上述几种方法对HDL-C检测的准确度都有保留。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其能够提高HDL-C检测的准确度，解决现有技术中HDL-C检测试剂检测准确度低的问题，为相关疾病的诊断及预防提供了可靠依据。

为了实现上述目的，本发明提供一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。

所述第一试剂包括如下组分：缓冲液I 0.02-0.8mol/L、凝集剂2～18g/L、显色剂0.5-5.0mmol/L、第一防腐剂0.5-2.0g/L、表面活性剂I1.0-12.0ml/L、表面活性剂II 8.0-25.0ml/L、保护剂22～160g/L和酶I 2～100Ku/L。

所述第二试剂包括如下组分：缓冲液II0.02-0.8mol/L、助色剂1.0-10.0mmol/L、第二防腐剂0.5-2.0g/L、保护剂22～160g/L、表面活性剂II8.0-25.0ml/L和酶II 1.0-50.0Ku/L。

所述酶I包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，其中胆固醇氧化酶来源于假单胞菌属；所述酶II为胆固醇酯酶，来源于裂殖菌或假单胞菌属。

所述第一试剂中，表面活性剂I和表面活性剂II的浓度比为：1:3～4。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述缓冲液I和所述缓冲液II均为3-吗啉丙磺酸、1,4-哌嗪二乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、一水吗啉乙磺酸中的任意一种或几种。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述缓冲液I和缓冲液II的pH均为6.5～7.5。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述凝集剂包括二价金属离子、α-环糊精硫酸盐和硫酸葡聚糖钠盐。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述二价金属离子的质量浓度为1.0～10.0g/L，所述二价金属离子为硫酸镁、硫酸锌或者氯化镁中的任意一种；所述α-环糊精硫酸盐的质量浓度为0.4～4.0g/L；所述硫酸葡聚糖钠盐的质量浓度为0.5～5.0g/L。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠盐中的任意一种。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述第一防腐剂和第二防腐剂均为叠氮钠、庆大霉素、Proclin300中的任意一种或几种。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述表面活性剂I为PluronicL127、Emuleng220、EmulengA90、EmulengLS114、NP-7、PluronicF-88中的任意一种或者几种。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述表面活性剂II为EmulgenB66、EmulengLS110、Emuleng709、PioninD6512、PioninYE309、NoigenEA-157、NoigenEA-167、NoigenEA-177中的任意一种或者几种。

根据本发明的高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述酶I中，所述胆固醇氧化酶和过氧化物酶的活性浓度均为1～50Ku/L。

本发明的目的在于提供一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，通过筛选来源于假单胞菌属的胆固醇氧化酶，以及来源于裂殖菌或者假单胞菌属的胆固醇酯酶，做为检测HDL-C含量的酶，使HDL-C的反应更准确、更彻底，能有效的选择并检测高密度脂蛋白中的胆固醇含量，在选定酶的基础上对表面活性剂I和表面活性剂II的浓度比进行限定，有效的降低低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒对HDL-C检测的干扰，进一步提高测定HDL-C含量的准确性。综上所述，本发明的有益效果是：提高HDL-C检测的准确度，解决现有技术中HDL-C检测试剂检测准确度低的问题，为相关疾病的诊断及预防提供了可靠依据。

附图说明

图1是本发明实施例1检测过程中的反应曲线；

图2是本发明对比例1检测过程中的反应曲线；

图3是本发明对比例2检测过程中的反应曲线；

图4是本发明对比例3检测过程中的反应曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中，将高密度脂蛋白胆固醇简称为HDL-C。

本发明提供了一种高准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。

第一试剂包括如下组分：缓冲液I 0.02-0.8mol/L、凝集剂2～18g/L、显色剂0.5-5.0mmol/L、第一防腐剂0.5-2.0g/L、表面活性剂I1.0-12.0ml/L、表面活性剂II 8.0-25.0ml/L、保护剂22～160g/L和酶I 2～100Ku/L；

第二试剂包括如下组分：缓冲液II0.02-0.8mol/L、助色剂1.0-10.0mmol/L、第二防腐剂0.5-2.0g/L、保护剂22～160g/L、表面活性剂II 8.0-25.0ml/L和酶II1.0-50.0Ku/L。

缓冲液I和缓冲液II均为3-吗啉丙磺酸、1,4-哌嗪二乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、一水吗啉乙磺酸中的任意一种或几种；缓冲液I和缓冲液II的pH均为6.5～7.5。

凝集剂包括二价金属离子、α-环糊精硫酸盐和硫酸葡聚糖钠盐。二价金属离子的质量浓度为1.0～10.0g/L，二价金属离子包括硫酸镁、硫酸锌和氯化镁；α-环糊精硫酸盐的质量浓度为0.4～4.0g/L；硫酸葡聚糖钠盐的质量浓度为0.5～5.0g/L。

显色剂为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3'5-二甲氧基苯胺钠盐中的任意一种。

第一防腐剂和第二防腐剂均为叠氮钠、庆大霉素、Proclin300中的任意一种或几种。

表面活性剂I为PluronicL127、Emuleng220、EmulengA90、EmulengLS114、NP-7、PluronicF-88中的任意一种或者几种。表面活性剂I能够优先溶解高密度脂蛋白，本发明中，表面活性剂I优选为Emuleng系列或Pluronic系列。

表面活性剂II为EmulgenB66、EmulengLS110、Emuleng709、PioninD6512、PioninYE309、NoigenEA-157、NoigenEA-167、NoigenEA-177中的任意一种或者几种。表面活性剂II能够抑制除高密度脂蛋白以外的其他的脂蛋白溶解，表面活性剂II优选为Emulgen系列或Pionin系列。

由于上述中的几种表面活性剂I和表面活性剂II的商品名均为英文，且无中文商品名，因此，本发明中直接使用英文商品名。

酶I包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，其中胆固醇氧化酶来源于假单胞菌属，过氧化物酶来源于辣根；胆固醇氧化酶和过氧化物酶的活性浓度均为1～50Ku/L。酶II为胆固醇酯酶，来源于裂殖菌或假单胞菌属。

保护剂包括质量浓度为2.0～15.0g/L的牛血清白蛋白和质量浓度为20.0～150.0g/L蔗糖。

了验证本发明检测试剂盒的准确度，本发明进行高密度脂蛋白的检测实验，实验过程中，样品处理方法为：取纯品高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物(CM+VLDL)，用磷酸盐缓冲液分别处理上述三种样品，使上述三种样品中的胆固醇体积浓度均为100mg/dL；其中高密度脂蛋白为待测物，低密度脂蛋白、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物为检测HDL-C时的干扰物。标准品选用市场普遍认可的合格朗道脂类定标液。磷酸盐缓冲液的pH为6～7，摩尔浓度为0.05mol/L。本发明还需要设置空白对照实验。

用AU400全自动生化分析仪分别检测上述几种样品以及标准品、空白，具体检测方法为：

先向测定管中加入第一试剂和样品，将第一试剂和样品混匀后，在34～40℃条件下孵育3～7min，读取吸光值A1；然后向测定管中加入第二试剂，将第二试剂与第一试剂以及样品混匀，在34～40℃条件下保温3～7min，然后读取吸光值A2，计算ΔA＝A2-A1。

计算HDL-C的含量：

检测采用两点终点法，检测使用的波长为546nm，反应方向为正方向，样品的添加量为2～4μl，第一试剂的添加量为220～260μl，第二试剂的添加量为70～90μl。

为了验证本发明检测试剂盒的准确度，本发明按照上述组分制备检测试剂盒，设置如下实施例。同时，更换本发明检测试剂盒中的酶的来源，设置如下若干对比例。再按照本发明中的检测方法，使用上述实施例和对比例中的检测试剂盒，检测样品中的HDL-C的浓度。

实施例1

第一试剂包括如下组分：缓冲液I 0.5mol/L、凝集剂11g/L、显色剂1.0mmol/L、第一防腐剂1.5g/L、表面活性剂I 4.0ml/L、表面活性剂II 16.0ml/L、保护剂110g/L和酶I6Ku/L。

第二试剂包括如下组分：缓冲液II 0.5mol/L、助色剂4.0mmol/L、第二防腐剂1.5g/L、保护剂110g/L、表面活性剂II 16.0ml/L和酶II 3Ku/L。

所述酶I包括胆固醇氧化酶和过氧化物酶，其中胆固醇氧化酶来源于假单胞菌属；所述酶II为胆固醇酯酶，来源于裂殖菌或假单胞菌属。

所述第一试剂中，表面活性剂I和表面活性剂II的浓度比为：1:3～4。

检测过程中的反应曲线见图1。检测结果为：高密度脂蛋白中HDL-C的含量为2.65mmol/L、低密度脂蛋白中HDL-C的含量为0.02mmol/L、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物中HDL-C的含量为0.22mmol/L。

对比例1

更换酶I中胆固醇氧化酶的来源，胆固醇氧化酶来源于链霉菌属，其他组分以及各组分的含量与实施例1保持一致。

检测过程中的反应曲线见图2。检测结果为：高密度脂蛋白中HDL-C的含量为1.75mmol/L、低密度脂蛋白中HDL-C的含量为0.51mmol/L、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物中HDL-C的含量为1.32mmol/L。

对比例2

更换酶II的来源，酶II来源于色杆菌，其他组分以及各组分的含量与实施例1保持一致。

检测过程中的反应曲线见图3。检测结果为：高密度脂蛋白中HDL-C的含量为2.43mmol/L、低密度脂蛋白中HDL-C的含量为0.35mmol/L、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物中HDL-C的含量为1.44mmol/L。

对比例3

更换酶I中胆固醇氧化酶的来源以及酶II的来源，胆固醇氧化酶的来源于链霉菌属，酶II来源于色杆菌，其他组分以及各组分的含量与实施例1保持一致。

检测过程中的反应曲线见图4。检测结果为：高密度脂蛋白中HDL-C的含量为2.55mmol/L、低密度脂蛋白中HDL-C的含量为0.51mmol/L、乳糜微粒和极低密度脂蛋白的混合物中HDL-C的含量为1.52mmol/L。

从图1的反应曲线看出，实施例1中HDL-C反应到达终点，反应完全，其他干扰成分的分离也较彻底。从图2、图3、图4反应曲线看出，对比例1、对比例2、对比例3中HDL-C的反应不完全，对其他干扰物质的分离不明确。说明本发明中的检测试剂盒的准确度较高。

为了得到检测准确度更高的试剂盒，本发明按照实施例1中的各组分浓度制备检测试剂盒，但是改变检测试剂盒中第一试剂中的表面活性剂I与表面活性剂II的浓度比例，继续设置如下若干实施例。表面活性剂I与表面活性剂II的浓度比见表1。

采用本发明中的具体检测方法，对各实施例的检测试剂盒进行准确度实验。实验用品的选择：质控品选用市场普遍认可的合格朗道和伯乐两个品牌，朗道质控选择低(LPD1)、中(LPD2)、高(LPD3)三个浓度，伯乐质控也选择低(L1)、中(L2)、高(L3)三个浓度。校准品选用市场普遍认可的合格的朗道脂类定标液。不同浓度比条件下准确度的实验结果见表2。

表1表面活性剂I与表面活性剂II的浓度比

表2不同浓度比条件下准确度的实验结果

1SD指一个标准差。从表2可见，实施例2和实施例3的准确度、线性相关系数都优于其他实施例。因此，本发明中，表面活性剂I与表面活性剂II的浓度比为1:3～4。

综上所述，本发明通过筛选来源于假单胞菌属的胆固醇氧化酶，以及来源于裂殖菌或者假单胞菌属的胆固醇酯酶，做为检测HDL-C含量的酶，使HDL-C的反应更准确、更彻底，能有效的选择并检测高密度脂蛋白中的胆固醇含量，在选定酶的基础上对表面活性剂I和表面活性剂II的浓度比进行限定，有效的降低低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜微粒对HDL-C检测的干扰，进一步提高测定HDL-C含量的准确性。综上所述，本发明的有益效果是：提高HDL-C检测的准确度，解决现有技术中HDL-C检测试剂检测准确度低的问题，为相关疾病的诊断及预防提供了可靠依据。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。