一种光致电化学生物传感器及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种光致电化学生物传感器及其制备方法和应用 (Photo-induced electrochemical biosensor and preparation method and application thereof ) 是由 接贵霞 接贵芬 于 2020-06-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于DNA纳米树枝放大信号的光致电化学生物传感器及其制法和应用；本发明的技术方案是利用痕量DNA引发外切酶III辅助循环放大反应,从而产生大量产物链,将DNA滚环放大与链式杂交相结合形成纳米树枝,利用大量卟啉锰嵌入纳米树枝从而淬灭硫化铋光电信号,制备了一种简便、实用的光致电化学(PEC)传感器,实现了对痕量DNA的超灵敏检测,该研究在临床诊断、基因治疗、环境监测、食品安全等领域具有很好的应用潜力。(The invention discloses a photoinduced electrochemical biosensor based on DNA nanometer branch amplification signals and a preparation method and application thereof; the technical scheme of the invention is that trace DNA is utilized to initiate exonuclease III to assist in cyclic amplification reaction, so that a large number of product chains are generated, DNA rolling ring amplification and chain hybridization are combined to form a nano branch, a large number of manganese porphyrins are embedded into the nano branch to quench bismuth sulfide photoelectric signals, a simple, convenient and practical Photoelectrochemical (PEC) sensor is prepared, ultra-sensitive detection of the trace DNA is realized, and the research has good application potential in the fields of clinical diagnosis, gene therapy, environmental monitoring, food safety and the like.)
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，更具体的说是涉及一种光致电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
目前，对检测和量化化学、生物化学和生物物质的快速、高度专一的方法存在着越来越多的需求。最迫切需要的是测量少量药物、代谢物、微生物和其它具有诊断价值的物质的方法。比如***、毒药、用于治疗目的的药物、激素、致病微生物、病毒、抗体、代谢物、酶和核酸等，检测特定痕量DNA序列在临床诊断、基因治疗、环境监测、食品安全等领域非常关键。
光电化学(Photoelectrochemical，PEC)生物传感，是一种结合了光电化学分析技术及生物传感技术而发展的新型检测方法。其检测原理是基于光电活性物质的光电转换特性来确定检测物的浓度。在光电化学检测过程中，光被用作激发信号激发光敏物质，而电信号作为检测信号。激发信号与检测信号形式的不同，使得背景信号降低，因此，PEC分析技术具有更高的灵敏性。
但是，目前光电传感器的光电信号和灵敏度有限，经大量研究发现，卟啉锰是一种将锰整合成卟啉的金属配合物，具有生产成本低、化学性能稳定、催化性能高效和优越的生物相容性等优点，因此，可以用于光电化学分析当中。
本发明采用DNA滚环放大与链式杂交相结合形成纳米树枝，通过嵌入树枝卟啉锰淬灭硫化铋光电信号，制备了一种灵敏、简单、实用的光电化学平台，用于检测痕量目标DNA。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于新型光电材料和DNA纳米树枝放大信号的光致电化学生物传感器；以及所述光致电化学生物传感器的制备方法及其检测痕量目标DNA的分析应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种光致电化学生物传感器的制备方法，包括：
通过滚环放大技术、链式杂交形成DNA纳米树枝，利用此纳米树枝嵌入卟啉锰实现对硫化铋(Bi2S3)光电信号的淬灭，制备了一种简便、实用的光致电化学传感器，实现了对目标DNA的超灵敏双信号检测。
优选的，上述的光致电化学生物传感器的制备方法，包括：
(1)准备DNA滚环模板，将环模版序列DNA、连接DNA、二次水和的10×T4DNA连接酶的缓冲溶液混合，经退火，然后自然冷却到室温，得到混合溶液，再将T4DNA连接酶加入到混合溶液中连接，然后对混合溶液中的T4DNA连接酶进行第一次灭活处理，再加入外切酶体系，进行切割处理，然后对混合溶液中的外切酶I和外切酶III进行第二次灭活处理，得到DNA滚环模板，备用
(2)外切酶III辅助循环放大过程：先对HP进行退火处理，然后自然冷却到室温，得到发卡结构，然后和目标DNA、外切酶III及外切酶缓冲溶液进行混合反应，得到产物链；
(3)卟啉锰淬灭硫化铋的PEC平台制备过程：首先，将Bi2S3悬浮液滴在ITO电极表面，待电极干燥后滴入AuNPs，待电极干燥后再加入H1溶液，加入MCH封板，然后将产物链滴在电极表面上进行第一次孵育处理，再在电极表面加入phi29DNA聚合酶、10×phi29DNA聚合酶缓冲溶液、dNTPs和DNA滚环模板进行第二次孵育处理，然后加入H2溶液、H3溶液进行第三次孵育处理，再加入卟啉锰进行第四次孵育处理，最后将修饰好的电极用TE缓冲液洗涤，然后在空气中干燥，即得所述传感器。
优选的，上述的制备方法，具体包括：
(1)准备DNA滚环模板：将1μL的环模版序列DNA、3μL的连接DNA、4μL二次水和3μL的10×T4DNA连接酶的缓冲溶液混合，经退火，然后自然冷却到室温，得到混合溶液，再将110-130U的T4DNA连接酶加入到混合溶液中连接，然后对混合溶液中的T4DNA连接酶进行第一次灭活处理，再加入4μL外切酶缓冲溶液、10-30U的外切酶I和90-110U的外切酶III，进行切割处理，然后对混合溶液中的外切酶I和外切酶III进行第二次灭活处理，得到DNA滚环模板，将得到的DNA滚环模板放在2-6℃下保存，备用；
(2)外切酶III辅助循环放大过程：先对18μL的HP进行退火处理，然后自然冷却到室温，得到发卡结构，然后和18μL的目标DNA、20-40U的外切酶III及4μL外切酶缓冲溶液进行混合反应，得到产物链(PC)；
(3)卟啉锰淬灭硫化铋的PEC平台制备过程：首先，将15μL的Bi2S3悬浮液滴在ITO电极表面，待电极干燥后滴入15μL的AuNPs，待电极干燥后再加入15μL的H1溶液，在4-25℃下反应11-13h，加入MCH封板，用TE缓冲液洗涤除去未连接上的H1，然后将10μL产物链滴在电极的表面上进行第一次孵育处理，用TE缓冲液洗涤除去多余的PC，再在电极表面加入0.4μL的phi29DNA聚合酶、1μL的phi29DNA聚合酶缓冲溶液、2μL的dNTPs和6.6μL的DNA滚环模板进行第二次孵育处理，用TE缓冲液洗涤，然后加入5μL的H2溶液、5μL的H3溶液进行第三次孵育处理，再加入10μL卟啉锰进行第四次孵育处理，最后将修饰好的电极用TE缓冲液洗涤，然后在空气中干燥，即得所述传感器。
优选的，上述环模版序列DNA序列为：
TCGATCTCAGATCCTAAGCCGCACCCAAAGACTG；
上述连接DNA序列为：
GATCGACAGTCT；
上述HP序列为：
TCTCAGATGGATTCGGCGTGAAT*T*T*T*TTCACGCCGAATCCATCTGAGAGGCCGTCTATGCGTGAACTG
上述H1序列为：
TCTGACAGCTAGAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTTTTCACGCCGAA TCCATCTGAGATTTTTTT-SH；
上述H2序列为：
AACCCACGCCGAATGGGGGGATTCGGCG；
上述H3序列为ATTCGGCGTGGGTTCGCCGAATCCCCCC。
优选的，上述步骤(1)中，所述环模版序列DNA的浓度为1μM；所述连接DNA的浓度为100μM。
优选的，上述步骤(1)中，所述退火的温度为93-97℃，时间为4-6min；
所述连接的温度为35-37℃，时间为1-2h；
所述第一次灭活处理的温度为62-68℃，时间为8-12min；
所述切割的温度为35-37℃，时间为1-2h；
所述第二次灭活处理的温度为77-83℃，时间为12-18min。
优选的，上述步骤(2)中，所述HP的浓度为1μM；
所述退火处理的温度为93-97℃，时间为4-6min；
所述混合反应的温度为35-37℃，时间为1-3h。
优选的，上述步骤(3)中，所述Bi2S3悬浮液的浓度为2mg/mL；所述H1溶液的浓度为1μM；所述H2溶液的浓度为1μM；所述H3溶液的浓度为1μM；所述卟啉锰的浓度为100μM，其中，所述H1、H2、H3均需要退火成为发夹结构，经还原打开二硫键，退火处理的温度为93-97℃，时间为4-6min。
优选的，上述步骤(3)中，所述第一次孵育处理的温度为35-37℃，孵育为1.5-2.5h；
所述第二次孵育处理的温度为35-37℃，时间为2.5-3.5h；
所述第三次孵育处理的温度为35-37℃，时间为1.5-2.5h；
所述第四次孵育处理的温度为35-37℃，时间为1.5-2.5h。
进一步的，一种光致电化学生物传感器，通过上述制备方法制得。
进一步的，利用上述的光致电化学生物传感器，实现对痕量目标DNA的灵敏检测。
在本发明中，利用硫化铋纳米棒作为信号探针，超灵敏检测痕量DNA。硫化铋作为基底结合金纳米粒子产生高强的光电信号。目标循环放大过程是利用外切酶III产生大量的产物链，用于打开固定在基底的DNA发卡，结合滚环放大、链式杂交形成富含双链的DNA纳米树枝，负载大量的淬灭分子卟啉锰，对硫化铋信号有效淬灭，根据淬灭后光电信号的变化实现目标痕量DNA的超灵敏光电检测。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明设计了一种新型的树枝状DNA纳米结构，嵌入大量卟啉锰，显著淬灭了Bi2S3光敏材料的光电信号，实现了目标DNA的高灵敏检测，对光电传感发展有很大创新。RCA与HCR结合双重放大技术可以形成大量DNA双链的树突状结构，极大地放大了PEC信号，提高了检测灵敏度。本工作为利用DNA纳米结构放大信号的PEC检测开辟了新的方向，有望作为一种简单、实用的PEC生物传感技术用于基因治疗和疾病诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1基于DNA纳米树枝放大信号的光致电化学生物传感器的原理图。
图2实施例1制备过程中的电泳表征：(A)ExoIII协助循环放大过程，(B)DNA链式杂交过程，(C)DNA滚换放大过程。
图3在实施例1制备过程中的TEM图：(A)DNA滚换放大产物的TEM图，(B)DNA链式杂交产物的TEM图，(C)DNA树枝(滚换放大与链式杂交结合的产物)的TEM图。
图4(A)利用实施例1制备出的光致电信号传感器在不同目标浓度DNA下的光电流信号响应曲线:100nM、10nM、1.0nM、100pM、10pM、1.0pM、100fM、10fM(从a到h)，(B)光电流变化与目标的浓度之间的线性关系。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将1μL浓度为100μM的padlockDNA、3μL浓度为100μM的assistantDNA、4μL二次水和3μL的10×T4DNA连接酶的缓冲溶液混合，并在95℃下退火5min，然后自然冷却到室温，再将120U的T4DNA连接酶加入到混合溶液中并在37℃下连接1h,然后将该混合溶液在65℃下反应10min灭活T4DNA连接酶，待冷却到室温后加入4μL外切酶缓冲溶液、20U外切酶I和100U外切酶III，在37℃下切割2h，然后将混合溶液在80℃下反应15min用于灭活外切酶I与外切酶III，冷却到室温后即可得到DNA滚环模板，将得到的DNA滚环模板放在4℃下保存，备用。
将18μL浓度为1μM的HP在95℃下退火5min，然后自然冷却到室温得到发卡结构，然后将18μL浓度为1μM的HP、18μL不同浓度的目标DNA、20U的外切酶III及4μL外切酶缓冲溶液混合，并在37℃下反应2h，从而得到大量产物链(PC)。
将Bi2S3悬浮液(15μL，2mg/mL)滴在ITO电极表面(控制电极面积为0.16cm2)，在空气中干燥后，将AuNPs溶液(15μL)滴在电极的表面上，电极干燥后再将H1溶液(15μL，1μM)滴在电极的表面上，在4℃下反应12小时，然后用TE缓冲溶液洗涤除去未连接上的H1，加入MCH封板，接着将循环放大产物PC(10μL)滴在上面在37℃下孵育2小时，用TE缓冲溶液洗涤除去多余的PC,往电极表面加入0.4μL的phi29DNA聚合酶、1μL的phi29DNA聚合酶缓冲溶液、2μL的dNTPs和6.6μL的DNA滚环模板在37℃下孵育3小时，用TE缓冲溶液洗涤，然后加入H2溶液(5μL，1μM)、H3溶液(5μL，1μM)在37℃下孵育2小时，加入卟啉锰(10μL，100μM)在37℃下孵育2小时，最后将修饰好的电极用TE缓冲液洗涤，然后在空气中干燥，用于PEC检测。
实施例2
将1μL浓度为100μM的padlockDNA、3μL浓度为100μM的assistantDNA、4μL二次水和3μL的10×T4DNA连接酶的缓冲溶液混合，并在97℃下退火4min，然后自然冷却到室温，再将130U的T4DNA连接酶加入到混合溶液中并在37℃下连接2h,然后将该混合溶液在68℃下反应8min灭活T4DNA连接酶，待冷却到室温后加入4μL外切酶缓冲溶液、30U外切酶I和110U外切酶III，在37℃下切割2h，然后将混合溶液在83℃下反应12min用于灭活外切酶I与外切酶III，冷却到室温后即可得到DNA滚环模板，将得到的DNA滚环模板放在6℃下保存，备用。
将18μL浓度为1μM的HP在97℃下退火4min，然后自然冷却到室温得到发卡结构，然后将18μL浓度为1μM的HP、18μL不同浓度的目标DNA、40U的外切酶III及4μL外切酶缓冲溶液混合，并在37℃下反应1h，从而得到大量产物链(PC)。
将Bi2S3悬浮液(15μL，2mg/mL)滴在ITO电极表面(控制电极面积为0.16cm2)，在空气中干燥后，将AuNPs溶液(15μL)滴在电极的表面上，电极干燥后再将H1溶液(15μL，1μM)滴在电极的表面上，在25℃下反应11小时，然后用TE缓冲溶液洗涤除去未连接上的H1，加入MCH封板，接着将循环放大产物PC(10μL)滴在上面在37℃下孵育1.5小时，用TE缓冲溶液洗涤除去多余的PC,往电极表面加入0.4μL的phi29DNA聚合酶、1μL的phi29DNA聚合酶缓冲溶液、2μL的dNTPs和6.6μL的DNA滚环模板在37℃下孵育2.5小时，用TE缓冲溶液洗涤，然后加入H2溶液(5μL，1μM)、H3溶液(5μL，1μM)在37℃下孵育1.5小时，加入卟啉锰(10μL，100μM)在37℃下孵育1.5小时，最后将修饰好的电极用TE缓冲液洗涤，然后在空气中干燥，用于PEC检测。
实施例3
将1μL浓度为100μM的padlockDNA、3μL浓度为100μM的assistantDNA、4μL二次水和3μL的10×T4DNA连接酶的缓冲溶液混合，并在93℃下退火6min，然后自然冷却到室温，再将1110U的T4DNA连接酶加入到混合溶液中并在35℃下连接1h,然后将该混合溶液在62℃下反应12min灭活T4DNA连接酶，待冷却到室温后加入4μL外切酶缓冲溶液、10U外切酶I和90U外切酶III，在35℃下切割1h，然后将混合溶液在77℃下反应18min用于灭活外切酶I与外切酶III，冷却到室温后即可得到DNA滚环模板，将得到的DNA滚环模板放在2℃下保存，备用。
将18μL浓度为1μM的HP在93℃下退火6min，然后自然冷却到室温得到发卡结构，然后将18μL浓度为1μM的HP、18μL不同浓度的目标DNA、20U的外切酶III及4μL外切酶缓冲溶液混合，并在35℃下反应3h，从而得到大量产物链(PC)。
将Bi2S3悬浮液(15μL，2mg/mL)滴在ITO电极表面(控制电极面积为0.16cm2)，在空气中干燥后，将AuNPs溶液(15μL)滴在电极的表面上，电极干燥后再将H1溶液(15μL，1μM)滴在电极的表面上，在4℃下反应13小时，然后用TE缓冲溶液洗涤除去未连接上的H1，加入MCH封板，接着将循环放大产物PC(10μL)滴在上面在35℃下孵育2.5小时，用TE缓冲溶液洗涤除去多余的PC,往电极表面加入0.4μL的phi29DNA聚合酶、1μL的phi29DNA聚合酶缓冲溶液、2μL的dNTPs和6.6μL的DNA滚环模板在35℃下孵育3.5小时，用TE缓冲溶液洗涤，然后加入H2溶液(5μL，1μM)、H3溶液(5μL，1μM)在35℃下孵育2.5小时，加入卟啉锰(10μL，100μM)在35℃下孵育2.5小时，最后将修饰好的电极用TE缓冲液洗涤，然后在空气中干燥，用于PEC检测。
在实施例1-3中用到的目标DNA序列为：
CAGTTC ACGCATAGACGG*C*C*
用到的H1、H2、H3均需要退火成为发夹结构，经还原打开二硫键，退火处理的参数与HP退火处理参数一致。
光电化学灵敏检测
在最佳反应条件下，研究了该生物传感器对目标DNA浓度的PEC检测响应。如图4A所示，PEC信号随目标DNA浓度从10fM到100nM逐渐减小(曲线a-h)。从图4B中可以看出，PEC信号的变化与目标DNA浓度呈良好的线性关系。插图为检测目标DNA的矫正曲线图，说明传感器制备成功。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。