用于生物或化学因子样本阻抗测量的传感器及使用传感器检测样本中生物或化学因子的方法
阅读说明：本技术 用于生物或化学因子样本阻抗测量的传感器及使用传感器检测样本中生物或化学因子的方法 (Sensor for measuring impedance of sample of biological or chemical factor and method for detecting biological or chemical factor in sample by using sensor ) 是由 A·库普祖纳斯 D·尼兹沃斯基 K·厄班斯基 J·姆尼西 K·帕拉 T·贡德克 E·柯泽 于 2019-02-06 设计创作，主要内容包括：本发明的主题是用于恒电位仪系统中的生物或化学因子样本的阻抗测量的传感器,其包括参考电极RE和计数电极CE,其中电触头以边缘连接器的形式通向传感器的边缘,其特征在于,该传感器包含n个工作电极WEn,其中n>2,优选地n在2-256的范围内,并且参考电极RE对所有工作电极WEn都是共用的,并且由工作电极WEn呈现的其片段形成测量段RE-CE-WEn。本发明的主题也是使用这种传感器检测样本中化学或生物因子的方法。(The subject of the invention is a sensor for the impedance measurement of samples of biological or chemical factors in potentiostat systems, comprising a reference electrode RE and a counter electrode CE, wherein electrical contacts lead to the edge of the sensor in the form of edge connectors, characterized in that the sensor comprises n working electrodes WEn, wherein n >2, preferably n is in the range of 2 to 256, and the reference electrode RE is common to all working electrodes WEn and its segments represented by the working electrodes WEn form a measurement segment RE-CE-WEn. The subject of the invention is also a method for detecting a chemical or biological agent in a sample using such a sensor.)
技术领域
本发明的主题是用于在恒电位仪系统中的生物或化学因子样本的阻抗测量的传感器，该传感器包括参考电极(RE)和计数电极(CE)，其中电触头以边缘连接器的形式通向传感器的边缘。
背景技术
在现有技术中，有许多发明解决了生物样本中试剂的灵敏测量问题。申请US2014273549A1提出了一种解决方案，该解决方案涉及一种条带形式的多电极单通道生物传感器(例如用于测量血液中的葡萄糖)，该传感器使用槽与测量装置连接。该条带包含由导体形成的许多区域，且条带的边缘以适合于传感器槽的形式形成且配备有许多触头。所述装置包含一个测量段，该测量段包括若干电极。申请WO2013114291A1涉及板形式的多通道温度传感器，其中所形成的轨道通向边缘连接器以与感测装置的槽连接。该板包含由导体形成的许多区域，且边缘被形成为适合于传感器槽且该板配备有许多触头区域(边缘连接器)。测量同时且并行地进行。在所述方案中，每个测量区域是独立的测量系统，且通过增加测量系统来实现多通道特性，且电路线的数目也增加。这些测量系统中的每个都独立操作，因此样本测量在每个通道中不是在同样条件下进行的。另外，这样的电极分布增加了测量时间，且不提供消除测量误差的可能性。
US6391558B1专利提出一种基于电化学方法的核酸检测系统。该系统利用PCB表面上的电极，包括工作电极和参考电极的阵列。施加到工作电极的电势是复合的，从而可以检测一个样本中的各种配体。传感器电极与分析仪连接，分析仪检测电脉冲和电极上的交互导致的信号变化。
专利申请US20030042150A1描述一种用于检测血液参数例如葡萄糖浓度、胆固醇水平等的电化学传感器。该系统由许多电极组成，这使得能够同时测量多个参数。
另一方面，US6391558B1专利描述一种使用印刷板上的电极检测核酸的方法。该电极可以由碳或包括铜、镍、金、铂、钯等的金属制成。使用丝网印刷来制造印刷版，然后对其进行光刻。该描述不涵盖如下可能性：在不进行复用的情况下在多个电极上同时测量。
基于电化学测量的生物传感器经常用在护理点(PoC)设备中。Ward等在出版物PLOS ONE 2014 9 3 e91732“Detecting P.aeruginosa with a Novel Biosensor(用新型生物传感器检测铜绿假单胞菌)”中描述一种使用电化学阻抗谱(EIS)测定铜绿假单胞菌的方法。测量和结果分析是基于微生物通过菌毛、鞭毛或细胞外蛋白与电极表面生物膜的连接后阻抗的变化，这导致电荷转移，或者通过检测由微生物产生的代谢产物来进行。
国际专利申请WO2001083674A1描述一种使用电化学生物传感器检测试剂的方法，该电化学生物传感器由覆有单层生物分子的电极制成，优选地生物素与链霉亲和素选择性地相互作用。另一方面，Moreira等(Sensors and Actuators(传感器与致动器)B 223(2016)927-935)描述一种利用丝网印刷技术来制造基于银电极的传感器。该传感器包括识别癌症生物标志物的人工抗体。使用多种方法比如循环伏安法(CV)、电化学阻抗谱(ESI)、方波伏安法(SWV)来测量抗体检测信号。
在现有技术中描述的这些发明的缺点是缺乏所有测量段进行并行多通道测量的可能性，这负面地影响了测量速度及其准确性。为了使用现有技术中描述的解决方案进行多通道测量，使用一个具有信号倍增的传感器系统，其中在给定的时段内仅对一个测量段供电和登记，随后系统将电力和测量切换到下一个测量段。最终没有进行同时测量的可能性。每个测量段都有其单独的一组电极，在参考电极上检测到的所产生的恒定和随机的测量误差无法以任何方式进行补偿，因为每个参考电极都是独立的电路(每个电极的恒定误差)，并且由于在不同时间对测量段进行测量，随机误差无法定义。
出乎意料的是，发现本发明解决了这个问题。
发明内容
本发明的主题是一种用于恒电位仪系统中的生物或化学因子样本的阻抗测量的传感器，其包括参考电极RE和计数电极CE，其中电触头以边缘连接器的形式通向所述传感器的边缘，优选地，所述传感器包含n个工作电极WEn，其中n>2，优选地n在2-256的范围内，并且参考电极RE对于所有工作电极WEn是共用的，并且由所述工作电极WEn呈现的其片段形成测量段RE-CE-WEn。
优选地，至少两个并且更优选地所有WEn电极在外表面上覆有传感材料层，该材料仅与样本中的一种类型的生物或化学因子起反应。
优选地，至少两个WEn电极覆有不同的传感材料。
优选地，所述传感材料是生物或合成类型的材料，并且特别地，这些是用于检测样本中生物或化学因子的抗体、抗体片段、肽、核酸序列。
优选地，所述工作电极Wen的形状是相同的圆形并且相对于所述计数电极CE对称地定位，其中所述计数电极CE的边缘具有与这些圆形同心的圆周的片段的形状，其中所述参考电极RE位于所述计数电极CE与所述工作电极WEn之间，所述参考电极RE的形状与所述计数电极CE的轮廓相同。
优选地，所述传感器包含附加的连接和/或非连接电极，以对所述工作电极WEn的编号进行编码，其中n＞2，优选地，n在2-256的范围内。
优选地，所述工作电极WEn、所述计数电极CE和所述参考电极RE的布置构成形状相同的、重复的测量段，并且所述工作电极WEn、所述计数电极CE和所述参考电极RE之间的距离在每个测量段中都相同，此外，所述工作电极WEn、所述计数电极CE片段和所述参考电极RE片段的面积在每个段中分别相同。所述参考电极RE的形状包括极化传感器中电场梯度的分布，实质上反应了极化电解质中相同的电势值。
优选地，所述工作电极WEn、所述参考电极RE和所述计数电极CE的布置和形状具有其对称轴。
优选地，所述边缘连接器具有接触场，其构成独立于所述WEn电极、所述参考电极RE和所述计数电极CE的电路，用于通过在将传感器***测量系统的槽中期间连接测量槽触点来识别传感器在该槽中的正确定位。
优选地，所述传感器包含9个用于编码传感器编号的接触点。
优选地，所述边缘连接器是HDMI插头(高清多媒体接口)或DisplayPort插头(通用数字接口)。
本发明的主题是一种检测样本中生物或化学因子的方法，其特征在于，将电解质或溶液形式的生物或化学因子的样本置于根据前述权利要求1至11中任一项所述的装置中，使得所有工作电极WEn、计数电极CE和参考电极RE都覆有溶液形式的所述样本，随后同时进行2-256个样本测量，尤其是使用阻抗谱技术或伏安法，并根据这些测量的结果确定样本中存在所述生物或化学因子。
优选地，以相反的配置进行所述测量，其中所述参考电极RE用作所述计数电极CE，而所述计数电极CE用作所述参考电极RE。
优选地，以相反的配置进行所述测量，其中激励信号被施加在WEn电极上而不是CE电极上。与标准配置相比，电极配置反转使得能够获得电极阻抗的各种结果特性。所呈现的差别是在传感器-生物敏感层-测试样本系统中出现的效果非线性的结果。在这里，反转电极极化(由此反转电荷移动的方向，包括溶液中的离子)的可能性以及测量系统配置的变化(各个电极的电流的测量方法)都是关键的。特别是，通过这种方式，可以测量阻抗特性的非线性，这是由于被测系统中存在p-n结而导致的。
优选地，所述生物或化学因子是病原体，尤其是病毒、细菌、真菌、蛋白质及其片段，包括酶、抗体、结构蛋白、抗体片段、肽、亲和体、核酸和核苷酸序列，包括单链和双链DNA、RNA、适体、短核苷酸序列、脂肪酸、碳水化合物、糖脂、糖肽和其他有机化合物，如农药、抗生素、非有机化合物，包括重金属。
附图说明
将参照附图以优选实施例更详细地解释本发明，其中：
图1示出用于恒电位仪系统中阻抗测量的传感器1，其包括参考电极RE 3和计数电极CE 4，其中电触头5以边缘连接器的形式通向传感器1的边缘6。所提出的传感器1配备有工作电极WEn 7，其中n＝8，并且参考电极RE 3对于所有工作电极WEn 7是共用的，并且其位于工作电极WEn 7附近的片段形成RE-CE-WEn类型的感测段8。
图2示出呈边缘连接器形式的传感器1的边缘6，其中接触点11形成与电极WEn7、RE3和CE 4分离的电路，旨在于识别传感器在测量槽中的正确放置，以及另外的连接和/或非连接电极13，用于对工作电极Wen 7的编号进行编码。
图3示出编码为“11001”的传感器的识别系统的表意图。可能的组合数量为32(对于M＝4，为2^M)。
图4示出简化版本的系统的表意图，3个电触头5的子集用于识别，因此组合数目是2^M＝8。
图5示出传感器与阳性样本(乳糖产品)相互作用的测量结果。
图6示出传感器与阴性样本(无乳糖产品)相互作用的测量结果。
图7示出ssDNA修饰的传感器与互补序列的相互作用。
图8示出对覆有生物层的铜电极的电化学阻抗谱测量结果，生物层连续用以下处理：0.5M NaCl，具有Triton X缓冲液(1％)的人工唾液，具有0.5M NaCl添加剂的Triton X缓冲液中的H1N1病毒。
图9是传感器1的俯视图和截面图，传感器1覆有传感材料9(生物层)，以及生物或合成因子的所施加样本2。
具体实施方式
在优选实施例中，工作电极WEn 7覆有传感材料9，因此是负责检测样本2中特定的生物和化学物质和颗粒的物质，优选为溶液或悬浮液的形式。
工作电极RE 3和计数电极CE 4是在测量期间由所有电极WEn 7共享的辅助电极，用于进行由于放置在电极WEn7上的传感材料9中发生的化学过程而导致的电量变化的测量，上述化学过程是样本2中用于检测的生物或化学因子导致的。
传感器边缘连接器1与标准H DMI端口或DisplayPort(显示端口)机械兼容且部分电气兼容。在典型的使用中，HDMI和DisplayPort类型的端口用于传输数字数据，并且在外壳中包含两排触点，这些触点保持端口和***的插头之间的电连接。H DMI/DP端口和插头的机械结构可防止它们反向连接。
然而，在所提出的解决方案中，传感器1没有配备H DMI/DP端口，以及提供防止传感器反向***传感器槽中的类似功能性的任何机械元件。因此，在没有任何附加机械保护的情况下，传感器1是有可能被反向***测量槽中的，这会阻止测量。在这种情况下，另一个问题是标准HDMI/DP端口-触点的结构以交替的方式而不是相对的方式放置，这实际上使得不可能在边缘连接器的边缘6上使用电触头5来明确地检测传感器1被反向***到传感器槽中。这是由于以下事实：如果反向***，则传感器槽的连接点和电触头5的中心不重叠，连接点移至电触头5之间的隔离区域。结果，可能通过槽触点获得相邻电触头5的短路，以及与这些电触头5中任一电触头的电连接。这种现象实际上是无法预测的，并且所获得的结果可能与接下来以相反朝向将传感器1***传感器槽中的尝试完全不同。这是由于插座壳体与边缘连接器之间的间隙不匹配以及边缘连接器的边缘6偏离与插座对称轴成直角的方向导致的。
出乎意料的是，发现即使不能排除这种情况，也可仅基于电气测量在将传感器1***传感器槽中时检测传感器1的正确朝向或错误朝向。需要以如下方式设计连接点11：将边缘连接器的更靠近传感器1的边缘6的部分用作连接点11，用于检测传感器在插座中的朝向，而边缘连接器的其他区域保持插座连接与电触头5的电接触，电触头5是与各个传感器电极连接的。该实施例在图2中示出。在将传感器1***插座期间，发生连接插座的触点1-2-3-4和6-7-8-9通过连接点的临时连接而没有与触点5的连接。本发明用于检测传感器1相对于槽的朝向的方法完全基于通过在将传感器1***传感器插座期间监控电连接器组之间的短路进行的电测量，且在完全***之后其不在功能上限制或影响传感器1的操作。
所述解决方案的变型在传感器槽的电路连接的各种构造中覆盖了边缘连接器的上侧、下侧或上侧和下侧二者的连接点11的隔离。
仅在检测到传感器1在传感器槽中的正确朝向后，才激活用于识别传感器1和正确测量所需的电信号。
实施例1
传感器类型的识别
传感器的多功能性包括其用于检测各种生物或化学物质的用途。传感器1可以制成多种版本，这些版本在对特定选择的病原体或其他物质敏感的工作电极WEn 7的传感材料的类型方面不同。因此，需要使得能够明确识别位于传感器中的传感器1的类型，并基于此选择会根据各个传感器1类型而变化的测量条件，如激励信号值和测量时间。常见的解决方案是基于比色识别，对基于光学图像分析的代码的利用(例如，条形码、QR码)或用于有线或无线识别的专用电子系统(例如RFID)。
可以使用用于测量工作电极WEn 7的相同电触头5来识别传感器1的类型。通过从可用的M个电触头5中选择N个电触头5的子集来进行传感器1类型的编码，其中N＜M。所选的N个电触头5的组合还与参考电极RE 3或计数电极CE 4或屏蔽电极GE 14连接。传感器电路检测连接了哪些电触头5，且以这种方式连接的电触头5在适当测量的进一步步骤中不被使用。
根据图3，通向工作电极WE1和WE2 7的1、2号电触头5和5号电触头5未与电极CE 4、电极RE3、GE 14的电触头5的任何线电连接，因此这些电极用于进行生物或化学因子含量的测量。3号和4号电触头5与位于中心的电极GE 14连接。所有电触头5相对于GE14或RE、CE的初始电压极化VPOL在500mV至5V的范围给出了与仅电触头5、3和4的VGE相似的测量结果，且电压测量结果与1、2和5号电触头5的VPOL相似。在对类似于VGE的电势分配符号“0”且对类似于VPOL的电势分配符号“1”时获得代码“11001”。
所提出的解决方案能够对2^N个各种组合进行编码，在该方案中，以任何组合设置的边缘连接器的电触头5的所选子集与电极GE14、电极RE3或计数电极CE4连接或不连接。对于该示例性解决方案，用N＝3的电触头5进行识别的电触头5的子集能够明确识别8个不同类型的传感器1。类似地，对于N＝8，可以识别256个类型的传感器1。
该方案能够利用所有用于识别传感器1类型的电触头5，提供了更高数目的组合，即32个组合(对于M＝4，为2^M)。
图4是简化版的布局图，其中该子集包含3个电触头5，因此组合的数目为2^M＝8。
传感器操作
在所提出的解决方案的情况下，由工作电极WEn 7以及参考电极RE 3和计数电极CE 4的相应片段组成的每个单独的测量段8都是相同的，即这些元件之间的距离保持相同，且面积值保持恒定。参考电极RE 3的电势在整个系统中是恒定的，从而为整个系统提供理想的测量条件。所有其他电极对均以相同的方式工作，并且参考电极RE 3使其他电极周围的电势均等。
工作电极WEn 7、参考电极RE3、计数电极CE4由低电阻率的材料制成，例如铜，其电阻率与样本2或传感材料9的电阻率相比可忽略不计，样本2或传感材料9与特定化学和生物物质反应，如被检测的病原体。
该多通道系统对从各个通道获得的结果显示出电势梯度的负影响。
在所提出的多通道传感器1的解决方案中，测量传感器8用来形成工作电极WEn 7、工作电极3和计数电极4的系统，使得每个测量段8保持相同的几何形状，特别是各个电极的面积相同，电极之间的距离、电极的形状被分配成使得RE电极的路径对应于极化传感器1中电场线分布中的某个固定电势。
出乎意料的是，在进行测试期间，发现以这种方式设计的电极系统与所分析的WEn电极7无关地提供了非常好的结果可重复性，还能够利用新型阻抗测量方法。
N1测量方法
与利用恒电位仪系统的经典阻抗谱相比，参考电极RE 7的目的是测量电解质形式的样本2溶液中的电势，以便从最终结果中补偿(消除)电解质阻抗，该最终结果是CE-WEn电极系统内的阻抗值，而不是由于计数电极CE 4电势的变化而达到设定电势。
N2方法
与利用恒电位仪的阻抗谱中使用的经典测量方法相比，工作电极WEn 7和计数电极CE 4的作用有所变化，在该系统中激励由工作电极WEn 7而不是由计数电极CE 4生成。与方法N1类似地，工作电极RE7的作用是测量电解质中的电势分布。出乎意料的是，发现使用方法N2测量的阻抗值不同于使用传统方法或N1方法获得的值，同时在N1和N2之间循环切换测量系统的操作模式可提供有关所测量样本的进一步信息。
N1和N2方法的特征在于，典型地对于通常利用恒电位仪系统进行的阻抗测量没有限制，特别是，可以同时执行所有工作电极WEn 7的测量。
结果表明，除了在改变N1和N2方法的同时获得的有关给定样本2的数据量的有益增加之外，另外一个优点是：基于针对各个电极进行分离的测量，与关于时间复用的测量相比，测量时间显著减少。使用N1和N2方法减少测量时间的收益直接与通道数成正比，并且对于同时测量的8个通道，比使用传统方法(即时间复用)的类似测量短8倍。
与传统的电化学测量情况不同，该电解质只是用于导电的润湿助剂，且电极的几何形状消除了电解质本身对阻抗的影响。
电极的构造和相互布置还使得能够使用反向检测模式。在经典系统中，激励发生在计数电极CE 4处，并且用工作电极WEn 7记录信号。在该给定解决方案的情况下，可以以如下方式执行测量：在工作电极WEn 7和计数电极CE 4处的激励用作整个测量系统的参考。通过电解质使离子电流方向反向产生的结果在某些频率范围上与使用传统方法获得的结果不同，其改进了设备灵敏度并提高了其对于传感器1或各个电极的自动故障检测的能力。
实施例2
乳糖-电极相互作用的分析
用β-半乳糖苷酶修饰工作电极WEn 7的表面。随后，用缓冲物调零工作电极WEn 7(准备用于工作，因此利用用于电极活化的调零溶液润湿)，然后作为含乳糖的溶液施加样本2。图5示出在乳糖存在的情况下阻抗的明显变化。
不含乳糖的样本用作对照实验。如图6所示，在存在对照样本期间，传感器1不呈现变化。
实施例3
电极上DNA相互作用的分析
在测量之前，用H2SO4清洗1号至8号的工作电极WEn 7。首先，用干净的工作电极WEn7进行测量，然后在其上制备传感材料9。传感材料9通过以下方式制备：
·沉积修饰用SH-DNA形态(ssDNA)，并在室温培养2-24小时。
·随后，施加10μl的MCH溶液(互补DNA，CssDNA)并用PBS缓冲物清洗，进行pH 7.4以去除游离分子。
以这种方式用传感材料9制备的传感器1使得能够例如用电化学阻抗谱进行测量，其显示出修饰用SH-DNA(附着在电极表面)与被测样本中存在的互补DNA的相互作用。
结果以图(图7)示出，其中阻抗的增加是由互补DNA与修饰用的DNA的相互作用引起的。
实施例4
铜表面传感器相互作用的分析-病毒H1N1 560：
·用生物层(具有抗MI抗体)修饰传感器表面
·对用该抗体修饰的传感器进行所谓的“调零”-正确测量传感器生物活性的步骤一，由此制备用于测试的干燥肽层，
·分析传感器与阴性样本之间的相互作用，该阴性样本是添加了1％Triton X的人工唾液的形式
·分析传感器与含有H1N1病毒的样本之间的相互作用
结果在图8中示出。
结果：在铜基上用抗体修饰的传感器：
·显示出在与阴性样本，即添加有1％Triton X的人工唾液，相互作用期间，阻抗略有变化；
·显示出在肽与含病毒的样本相互作用期间，阻抗明显变化(增加)。