阅读说明：本技术 被测试样的评价方法 (Method for evaluating test sample ) 是由 斋藤香织 藤田郁尚 冈田文裕 石井健 于 2019-03-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种被测试样的评价方法,其是能够容易地评价被测试样是否具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的被测试样的评价方法,该评价方法基于由被测试样通过TRPM4表达细胞的TRPM4所引起的生理学现象,对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价。(The present invention provides a method for evaluating a test sample, which is capable of easily evaluating whether the test sample has an effect of inhibiting cytokine production in skin cells, and which evaluates the cytokine production-inhibiting effect of the test sample on the basis of a physiological phenomenon caused by TRPM4 in cells in which the test sample is expressed by TRPM 4.)

被测试样的评价方法

技术领域

本发明涉及被测试样的评价方法。更详细而言，本发明涉及用于评价被测物质是否具有细胞因子产生抑制作用的被测试样的评价方法和细胞因子产生抑制剂。

背景技术

皮肤产生的炎症成为痤疮疤痕、斑点、皱纹等产生的原因。因此，提出了包含抑制皮肤产生的炎症的抗炎剂的化妆料等(例如参见专利文献1)。但是，上述抗炎剂是使皮肤已经产生的炎症镇静的药剂，因此希望开发出能够通过抑制作为炎症致病因子之一的细胞因子的产生而抑制炎症发病的炎症预防用化妆料、炎症预防剂等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2016-196418号公报

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术而进行的，其目的在于提供一种能够容易地评价被测试样是否具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的被测试样的评价方法、以及能够有效抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的细胞因子产生抑制剂。

用于解决课题的手段

本发明涉及：

(1)一种被测试样的评价方法，其是对被测试样所具有的、皮肤细胞中的细胞因子产生抑制作用进行评价的被测试样的评价方法，其特征在于，使TRPM4表达细胞与被测试样接触，测定由被测试样通过TRPM4表达细胞中的TRPM4所引起的生理学现象，基于该生理学现象对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价。

(2)如上述(1)所述的被测试样的评价方法，其中，上述生理学现象为细胞因子产生，使用具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞作为上述TRPM4表达细胞，测定上述生理学现象，基于该生理学现象对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价，此时的操作包括以下步骤：

(A1)使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定上述TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A2)使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定上述TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A3)使上述TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定上述TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A4)使上述TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定上述TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；和

(A5)基于步骤(A1)～(A4)中测定的表达量，对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的步骤。

(3)如上述(1)所述的被测试样的评价方法，其中，测定上述生理学现象，基于该生理学现象对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价，此时的操作包括以下步骤：

(B1)使上述TRPM4表达细胞与被测试样接触，测定被测试样的接触前后的TRPM4表达细胞中的TRPM4活性的变化的步骤；和

(B2)基于步骤(B1)中测定的TRPM4活性的变化，对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的步骤。以及

(4)一种细胞因子产生抑制剂，其是在活化TRPM4而抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的用途中使用的细胞因子产生抑制剂，其特征在于，含有铝化合物作为用于活化TRPM4的有效成分。

发明的效果

根据本发明，提供一种能够容易地评价被测试样是否具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的被测试样的评价方法、以及能够有效抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的细胞因子产生抑制剂。

附图说明

图1是示出参考例1中的蛋白免疫印迹分析的结果的附图替代照片。

图2是示出在试验例1中对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的IL-1α基因的表达量进行调查的结果的图。

图3是示出在试验例1中对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的IL-8基因的表达量进行调查的结果的图。

图4是示出在试验例1中对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的TNF基因的表达量进行调查的结果的图。

图5是示出在试验例2中对比较例3～6中得到的各细胞中的IL-8基因的表达量进行调查的结果的图。

图6是示出在参考例2中对TRPM4激动剂的有无与相对荧光强度的关系进行调查的结果的图。

图7是示出在实施例3中对被测试样的种类与相对荧光强度的关系进行调查的结果的图。

图8是示出在试验例3中对实施例4和比较例7中得到的各表皮角化细胞中的IL-1α表达量进行调查的结果的图。

图9是示出在试验例3中对实施例4和比较例7中得到的各表皮角化细胞中的IL-6表达量进行调查的结果的图。

具体实施方式

1.被测试样的评价方法

本发明的被测试样的评价方法是对被测试样所具有的皮肤细胞中的细胞因子产生抑制作用进行评价的被测试样的评价方法，其特征在于，使TRPM4表达细胞与被测试样接触，测定由被测试样通过TRPM4表达细胞中的TRPM4所引起的生理学现象，基于该生理学现象对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价。

根据本发明的被测试样的评价方法，由于采用了测定由被测试样通过TRPM4表达细胞中的TRPM4所引起的生理学现象、基于该生理学现象对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的操作，因此能够准确地评价被测试样是否抑制皮肤细胞中的TRPM4的活化引起的细胞因子产生。因此，根据本发明的被测试样的评价方法，能够容易地评价被测试样是否具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用。另外，根据本发明的被测试样的评价方法，由于使用了TRPM4表达细胞，因此能够以良好的再现性进行被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用的评价，并且能够在同一条件下同时进行多次。

被测试样是作为是否具有细胞因子产生抑制作用的评价对象的试样。作为被测试样，可以举出例如无机化合物、有机化合物、植物提取物、细胞培养物、细胞提取物等，但本发明并不仅限于上述例示。在被测试样为液体的情况下，可以直接使用，也可以根据需要用溶剂稀释后使用。另外，在被测试样为固体的情况下，可以溶解于溶剂中而使用。

溶剂根据被测试样的种类、测定对象的生理学现象的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据被测试样的种类、测定对象的生理学现象的种类等来决定。作为溶剂，可以举出例如乙醇、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水、纯净水、培养基、含钙溶液[组成：140mM氯化钠、5mM氯化钾、2mM氯化镁、2mM氯化钙、10mM葡萄糖和10mM 2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)盐酸缓冲液(pH7.4)]、不含钙的溶液[组成：140mM氯化钠、5mM氯化钾、2mM氯化镁、5mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、10mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)]等，但本发明并不仅限于上述例示。培养基含有适合于TRPM4表达细胞生长的培养基成分。作为培养基成分，可以举出例如葡萄糖、氨基酸、蛋白胨、维生素、细胞生长促进因子、血清、氯化钙、氯化镁等，但本发明并不仅限于上述例示。培养基可以为通过向基本培养基中补充培养基成分而制造的培养基，也可以为商业上可获得的培养基。作为基本培养基，没有特别限定，可以举出Eagle’s基础培养基(下文中称为“MEM”)、Dulbecco改良Eagle培养基(下文中称为“DMEM”)、RPMI-1640培养基等，但本发明并不仅限于上述例示。培养基根据TRPM4表达细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类等来决定。

TRPM4表达细胞是表现出与表达野生型TRPM4的细胞同等的生理学功能的细胞。作为与表达野生型TRPM4的细胞同等的生理学功能，例如，可以举出由TRPM4激动剂引起的化学刺激等刺激导致的钾离子和钠离子从细胞外向细胞内的透过等，但本发明并不仅限于上述例示。TRPM4表达细胞可以为表达内源性TRPM4的内源性TRPM4表达细胞，也可以为外源性TRPM4表达细胞。

作为内源性TRPM4表达细胞，可以举出例如正常人表皮角化细胞、HaCaT细胞、NCTC2544等角化细胞；人心肌细胞、人T细胞、Jurkat细胞、MOLT-4细胞、U-937细胞等T细胞；人肥大细胞、HMC-1等肥大细胞；人单核细胞、THP-1等单核细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。

外源性TRPM4表达细胞只要是过表达外源性TRPM4的细胞即可。外源性TRPM4细胞可以是导入至宿主细胞中的核酸作为染色体外要素存在而瞬时表达TRPM4的细胞，也可以是导入至宿主细胞中的核酸被整合到该宿主细胞的染色体中的细胞。需要说明的是，外源性TRPM4表达细胞可以在不妨碍本发明目的的范围内表达内源性TRPM4。外源性TRPM4表达细胞例如可以通过将保有编码TRPM4的核酸的TRPM4表达载体导入宿主细胞等中来获得。

作为编码TRPM4的核酸，可以举出例如GenBank登录号：NM_017636所示的mRNA、由该mRNA得到的cDNA等，但本发明并不仅限于上述例示。作为编码TRPM4的核酸的具体例，可以举出例如编码由序列号：1所示的氨基酸序列构成的多肽的核酸；编码由与序列号：1所示的序列具有80％以上的序列一致性的氨基酸序列构成且显示出TRPM4活性的突变型多肽的核酸等，但本发明并不仅限于上述例示。需要说明的是，“序列一致性”是指以默认值使用基于BLAST算法的PROTEINBLAST，将评价对象的氨基酸序列(查询序列)与序列号：1所示的氨基酸序列(参照序列)进行比对而算出的值。从表现出TRPM4活性的方面考虑，序列一致性为85％以上、优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为98％以上，其上限值为100％。

作为TRPM4活性，可以举出例如细胞中的钾离子通量和钠离子通量的调节活性、细胞中的膜电位的调节活性等，但本发明并不仅限于上述例示。这些TRPM4活性例如通过TRPM4被TRPM4激动剂活化来表现。

宿主细胞可以是表达内源性TRPM4的细胞，也可以是不表达内源性TRPM4的细胞。作为宿主细胞，可以举出例如人细胞、猴细胞、小鼠细胞、中国仓鼠细胞等哺乳动物细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为人细胞，可以举出例如HEK293细胞等人肾细胞；Hela细胞等人癌细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为猴细胞，可以举出例如COS-7细胞等猴肾细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为小鼠细胞，可以举出例如NIH3T3细胞等胎鼠皮肤成纤维细胞等小鼠细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为中国仓鼠细胞，可以举出例如CHO细胞等中国仓鼠卵巢细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。在这些宿主细胞中，从确保优异的处理性，确保与培养皿、培养板等培养容器、观察用盖玻片等的贴附性，提高外源性TRPM4基因的表达效率的方面考虑，优选HEK293细胞、CHO细胞、COS-7细胞和NIN3T3细胞，更优选HEK293细胞。TRPM4表达载体通过将编码TRPM4的核酸与载体连接等而得到。载体根据宿主细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据宿主细胞的种类等来决定。作为所得到的细胞为外源性TRPM4表达细胞的确认方法，可以举出例如下述方法：使细胞与TRPM4激动剂接触，以细胞内钙离子浓度为指标，测定从细胞外被引入细胞内的钠离子的流入所导致的钙离子浓度的减少量；等，但本发明并不仅限于上述例示。在TRPM4激动剂接触后的细胞的细胞内钙离子浓度小于未与TRPM4激动剂接触的细胞的细胞内钙离子浓度的情况下，可以判断所得到的细胞为外源性TRPM4表达细胞。作为已知的TRPM4激动剂，可以举出例如N-[4-[3,5-双(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基]苯基]-4-甲基-1,2,3-噻二唑-5-甲酰胺)(下文中称为“BTP2”)、1-(6-[(17β-3-甲氧基雌甾-1,3,5(10)-三烯-17-基)氨基]己基)-1H-吡咯-2,5-二酮(下文中称为“U-73122”)、十钒酸盐等，但本发明没有特别限定。

从以高精度评价被测试样是否具有细胞因子产生抑制作用的方面考虑，TRPM4表达细胞优选为具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞。作为具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞，可以举出例如HaCaT细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。

作为通过TRPM4所引起的生理学现象，可以举出例如因TRPM4的活化引起的细胞因子基因的表达量的减少、因TRPM4的活化引起的细胞因子的表达量的减少、TRPM4本身的活性的表达等，但本发明并不仅限于上述例示。

在使用因TRPM4的活化引起的细胞因子基因的表达量的减少作为通过TRPM4所引起的生理学现象的情况下，作为本发明的被测试样的评价方法的具体例，可以举出以下的评价法1等，但本发明并不仅限于上述例示。

<评价法1>

一种方法，其中，生理学现象为细胞因子产生，使用具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞作为TRPM4表达细胞，测定上述生理学现象，基于该生理学现象对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价，此时的操作包括以下步骤：

(A1)使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A2)使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A3)使上述TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；

(A4)使上述TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量的步骤；和

(A5)基于步骤(A1)～(A4)中测定的表达量，对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的步骤。

在评价法1中，由于在步骤(A3)和(A4)中使用了TRPM4缺陷细胞，因此能够确认由被测试样在TRPM4表达细胞中所引起的生理学现象是否为通过TRPM4所引起的生理学现象。因此，关于评价法1中使用的TRPM4表达细胞，从除了表达TRPM4这一点以外在与使用TRPM4缺陷细胞时相同的条件下进行该确认的方面考虑，优选内源性TRPM4表达细胞。另外，从以高精度评价被测试样是否具有细胞因子产生抑制作用的方面考虑，TRPM4表达细胞优选为具有细胞因子表达能力的TRPM4细胞。作为具有细胞因子表达能力的内源性TRPM4表达细胞，可以举出例如HaCaT细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。

在步骤(A1)中，使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量。

作为细胞因子，可以举出例如白细胞介素-1α(下文中称为“IL-1α”)、白细胞介素1β(下文中称为“IL-1β”)、白细胞介素-2(下文中称为“IL-2”)、白细胞介素-6(下文中称为“IL-6”)、白细胞介素-8(下文中称为“IL-8”)、肿瘤坏死因子(下文中称为“TNF”)等，但本发明并不仅限于上述例示。在这些细胞因子中，从准确地评价抑制皮肤中的炎症发病的作用的方面考虑，优选IL-1α和IL-8。作为细胞因子基因，可以举出例如IL-1α基因、IL-1β基因、IL-2基因、IL-6基因、IL-8基因、TNF基因等，但本发明并不仅限于上述例示。在这些细胞因子基因中，从准确地评价抑制皮肤中的炎症发病的作用的方面考虑，优选IL-1α基因和IL-8基因。

作为细胞因子产生促进物质，可以举出例如肿瘤坏死因子α(下文中称为“TNFα”)、脂多糖、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(下文中称为“PMA”)、干扰素γ(下文中称为“IFNγ”)、IL-17、IL-22、IL-33、组胺等，但本发明并不仅限于上述例示。

作为使TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触的顺序，可以举出例如：(a1)在使TRPM4表达细胞与被测试样接触后，使该TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质接触的顺序；(a2)使被测试样和细胞因子产生促进物质同时接触TRPM4表达细胞的顺序；(a3)在使TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质接触后，使该TRPM4表达细胞与被测试样接触的顺序；等，但本发明并不仅限于上述例示。

在步骤(A1)中，在采用(a1)的顺序的情况下，作为TRPM4表达细胞与被测试样的接触方法，可以举出例如在被测试样中孵育TRPM4表达细胞的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。另外，作为TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触方法，可以举出向孵育后的被测试样与TRPM4表达细胞的混合物中添加细胞因子产生促进物质并对所得到的混合物进行孵育的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。在TRPM4表达细胞与被测试样的接触时和TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触时，可以使用测定对象的生理学现象的测定中使用的试剂。

TRPM4表达细胞与被测试样的接触温度和TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触温度根据TRPM4表达细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类等而决定。从确保适合于TRPM4表达细胞中的TRPM4活性的表达的温度条件的方面考虑，TRPM4表达细胞与被测试样的接触温度和TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触温度通常优选为35～40℃。另外，TRPM4表达细胞与被测试样的接触时间根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类等而决定。从准确地评价被测试样对TRPM4活性的影响的方面考虑，TRPM4表达细胞与被测试样的接触时间通常优选为1分钟～24小时。TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触时间根据TRPM4表达细胞的种类、细胞因子产生促进物质的种类、表达量的测定对象物质的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类、细胞因子产生促进物质的种类、表达量的测定对象物质的种类等而决定。关于TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触时间，从准确地评价被测试样对TRPM4活性的影响的方面考虑，在评价细胞因子的表达量的情况下，通常优选为6～72小时，在评价细胞因子基因的表达量的情况下，通常优选为1～12小时。

在TRPM4表达细胞与被测试样的接触时，每1mL被测试样的TRPM4表达细胞的个数根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类等而决定。从提高通过TRPM4所引起的生理学现象的测定精度的方面考虑，每1mL被测试样的TRPM4表达细胞的个数通常优选为1×10³个以上、更优选为1×10⁴个以上，从准确地产生通过TRPM4细胞中的TRPM4所引起的生理学现象的方面考虑，优选为1×10⁹个以下、更优选为1×10⁸个以下。

在TRPM4表达细胞与被测试样的接触时，每1mL被测试样的细胞因子产生促进物质的量根据细胞因子产生促进物质的种类、TRPM4表达细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据细胞因子产生促进物质的种类、TRPM4表达细胞的种类等而决定。从准确地评价被测试样对TRPM4活性的影响的方面考虑，每1mL被测试样的细胞因子产生促进物质的量通常优选为5～500ng。

在步骤(A1)中，在采用(a2)或(a3)的顺序的情况下，每1mL被测试样的TRPM4表达细胞的个数和每1mL被测试样的细胞因子产生促进物质的量与采用(a1)的顺序时的每1mL被测试样的TRPM4表达细胞的个数和每1mL被测试样的细胞因子产生促进物质的量相同。

TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质的接触温度根据TRPM4表达细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类等而决定。从确保适合于TRPM4表达细胞中的TRPM4活性的表达的温度条件的方面考虑，TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质的接触温度通常优选为35～40℃。

TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质的接触时间根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类、细胞因子产生促进物质的种类、表达量的测定对象物质的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类、被测试样的种类、细胞因子产生促进物质的种类、表达量的测定对象物质的种类等而决定。关于TRPM4表达细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质的接触时间，从准确地评价被测试样对TRPM4活性的影响的方面考虑，通常，在评价细胞因子的表达量的情况下，通常优选为6～72小时，在评价细胞因子基因的表达量的情况下，通常优选为1～12小时。

作为细胞因子的表达量的测定方法，可以举出蛋白免疫印迹法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等，但本发明并不仅限于上述例示。作为细胞因子基因的表达量的测定方法，可以举出例如RNA印迹法、定量RT-PCR法等，但本发明并不仅限于上述例示。

作为蛋白免疫印迹法和ELISA中使用的抗体，可以举出例如抗细胞因子抗体或其抗体片段等，但本发明并不仅限于上述例示。抗细胞因子抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。从提高细胞因子的表达量的定量性的方面考虑，优选单克隆抗体。单克隆抗体例如如下获得：对产生与细胞因子或其一部分具有反应性的单克隆抗体的杂交瘤进行培养，得到培养上清，对于所得到的培养上清，根据需要利用硫酸铵分级法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行纯化，由此获得。杂交瘤例如如下获得：通过将细胞因子或其一部分给药至动物的静脉内、皮下或腹腔内来免疫该动物，得到抗体产生细胞，使该抗体产生细胞与骨髓瘤细胞发生细胞融合，利用HAT培养基对所得到的融合细胞进行培养等，由此获得。另外，多克隆抗体如下获得：通过将细胞因子或其一部分给药至动物的静脉内、皮下或腹腔内来免疫该动物，得到抗血清，对于所得到的抗血清，根据需要利用硫酸铵分级法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行纯化，由此获得。抗体片段例如如下获得：用消化酶分解抗细胞因子抗体，根据需要对所得到的分解产物进行纯化等，由此获得。另外，作为抗细胞因子抗体及其抗体片段，可以使用商业上可获得的抗细胞因子抗体及其抗体片段。

作为RNA印迹法中使用的探针，可以举出例如由编码细胞因子基因的核酸的全部或一部分构成的核酸、由编码细胞因子基因的核酸的反义链的全部或一部分构成的核酸等，但本发明并不仅限于上述例示。在由编码细胞因子基因的核酸的一部分构成的核酸或由该核酸的反义链的一部分构成的核酸的情况下，探针的长度根据细胞因子基因的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据细胞因子基因的种类等而决定。从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，探针的长度通常优选为20～500核苷酸长。

作为定量RT-PCR法中使用的引物对，可以举出例如由编码细胞因子基因的核酸的碱基序列的一部分构成的引物和由该核酸的反义链的碱基序列的一部分构成的引物所组成的引物等，但本发明并不仅限于上述例示。构成引物对的各引物的长度、GC含量和Tm值以及编码细胞因子基因的核酸上的引物间的距离根据细胞因子基因的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据细胞因子基因的种类等而决定。从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，引物的长度通常优选为12～30核苷酸长。从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，引物的GC含量通常优选为40～60％。从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，引物的Tm值优选为55～80℃。从迅速地测定细胞因子基因的表达量的方面考虑，编码细胞因子基因的核酸上的引物间的距离通常优选为100～800核苷酸长。另外，从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，构成引物对的各引物优选具有不包含胸腺嘧啶残基或胞嘧啶残基连续而成的序列(聚嘧啶序列)和腺嘌呤残基或鸟嘌呤残基连续而成的序列(聚嘌呤序列)这两者的序列。从提高细胞因子基因的表达量的测定精度的方面考虑，构成引物对的各引物优选由编码细胞因子基因的核酸或其反义链的碱基序列的一部分构成、且由不包含在其他基因等的序列中的序列构成。引物中使用的序列例如可以通过使用Primer BLAST等引物设计程序来求出。引物对也可以为商业上可获得的引物对。

在步骤(A2)中，使具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定TRPM4表达细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量。

步骤(A2)中使用的TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触方法、TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触温度、TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触时间以及细胞因子基因和细胞因子的各表达量的测定方法与步骤(A1)中使用的TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触方法、TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触温度、TRPM4表达细胞与细胞因子产生促进物质的接触时间以及细胞因子及其基因的各表达量的测定方法相同。与TRPM4表达细胞接触的细胞因子产生促进物质的量与步骤(A1)中的TRPM4表达细胞与被测物质和细胞因子产生促进物质的接触时使用的细胞因子产生促进物质的量相同。

在步骤(A3)中，使TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与被测试样和细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量。

TRPM4缺陷细胞除了TRPM4的功能缺陷以外，与步骤(A1)和步骤(A2)中使用的TRPM4表达细胞相同。TRPM4缺陷细胞可以通过利用基因敲除法破坏TRPM4表达细胞中的TRPM4基因；使TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷；等来制造。作为基因敲除法，可以举出例如通过同源重组法破坏TRPM4基因的方法、通过基因组编辑技术破坏TRPM4基因的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。另外，作为使TRPM4的功能缺陷的方法，可以举出通过使用siRNA或shRNA的RNA沉默法抑制TRPM4基因的表达的方法、通过在TRPM4表达细胞中表达显性负突变体来抑制正常的TRPM4的功能的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。

在步骤(A3)中，代替在步骤(A1)中使用具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞而使用TRPM4缺陷细胞，除此以外，在与步骤(A1)相同的条件下进行相同的操作，由此测定细胞因子和/或其基因的表达量。

在步骤(A4)中，使TRPM4表达细胞中的TRPM4的功能缺陷的TRPM4缺陷细胞与细胞因子产生促进物质接触，测定该TRPM4缺陷细胞中的细胞因子和/或其基因的表达量。

在步骤(A4)中，代替在步骤(A2)中使用具有细胞因子表达能力的TRPM4表达细胞而使用TRPM4缺陷细胞，除此以外，在与步骤(A2)相同的条件下进行相同的操作，由此测定细胞因子和/或其基因的表达量。

需要说明的是，在本发明的被测试样的评价方法中，从提高评价精度的方面考虑，优选使用对照试样对使用被测试样时的表达量进行校正。作为对照试样，只要是不包含被测试样的液体即可，可以举出例如被测试样的稀释中使用的溶剂、被测试样的溶解中使用的溶剂等，但本发明并不仅限于上述例示。在使用对照试样的情况下，在步骤(A1)～(A4)中，除了代替使用被测试样而使用对照试样以外，进行与步骤(A1)～(A4)同样的操作，测定细胞因子和/或其基因的表达量。

在步骤(A5)中，基于步骤(A1)～(A4)中测定的表达量，对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价。

在步骤(A1)中测定的表达量少于步骤(A2)中测定的表达量、步骤(A3)中测定的表达量与步骤(A4)中测定的表达量同等的情况下，可以评价为被测试样是具有活化TRPM4、抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的物质。

在使用TRPM4本身的活性的表达作为通过TRPM4所引起的生理学现象的情况下，作为本发明的被测试样的评价方法的具体例，可以举出例如以下的评价法2等，但本发明并不仅限于上述例示。

<评价法2>

一种方法，其中，测定上述生理学现象，基于该生理学现象对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价，此时的操作包括以下步骤：

(B1)使上述TRPM4表达细胞与被测试样接触，测定被测试样的接触前后的TRPM4表达细胞中的TRPM4活性的变化的步骤；和

(B2)基于步骤(B1)中测定的TRPM4活性的变化，对上述被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的步骤。

评价法2中使用的TRPM4表达细胞优选为外源性TRPM4表达细胞，从容易进行TRPM4活性的变化的观察的方面考虑，更优选过表达外源性TRPM4的细胞。

作为TRPM4活性的变化，可以举出例如被测试样接触前后的TRPM4表达细胞中的由TRPM4导致的钠离子向细胞内的引入量的变化、被测试样接触前后的TRPM4表达细胞中的因TRPM4的活化引起的电流的增加等，但本发明并不仅限于上述例示。

在使用被测试样接触前后的TRPM4表达细胞中的由TRPM4导致的钠离子向细胞内的引入量的变化作为TRPM4活性的变化的情况下，作为由TRPM4导致的钠离子向细胞内的引入量的测定方法，可以举出例如使用TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度作为钠离子向细胞内的引入量的指标而测定钠离子向细胞内的引入量的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。

在由TRPM4导致的钠离子向细胞内的引入量的测定中使用细胞内钙离子浓度作为指标的情况下，细胞内钙离子浓度的测定例如可以通过下述方式等进行：将与钙离子特异性结合的钙指示剂导入到TRPM4表达细胞中，使钙指示剂与该TRPM4表达细胞内的钙离子结合，测定与TRPM4表达细胞内的钙离子结合的钙指示剂的量。

在TRPM4被活化的TRPM4表达细胞内，与TRPM4未活化的TRPM4表达细胞相比，TRPM4介导的钠离子从TRPM4表达细胞外向TRPM4表达细胞内的流入量增加，TRPM4表达细胞的细胞内钠离子浓度增加。随着TRPM4表达细胞的细胞内钠离子浓度的增加，该TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度减少。另外，如后述实施例所示，TRPM4的活化与皮肤细胞中的细胞因子产生的抑制有关。因此，在与被测试样接触的TRPM4表达细胞的细胞内钙浓度低于未与被测试样接触的TRPM4表达细胞的细胞内钙浓度的情况下，可以评价为被测试样是具有活化TRPM4、抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的物质。与此相对，在与被测试样接触的TRPM4表达细胞的细胞内钙浓度高于未与被测试样接触的TRPM4表达细胞的细胞内钙浓度的情况下或两者同等的情况下，可以评价为被测试样是不具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的物质。

在由TRPM4导致的钠离子向细胞内的引入量的测定中使用细胞内钙离子浓度作为指标的情况下，TRPM4活化作用例如可以通过包括下述步骤的方法等来评价：

(I)使用钙指示剂测定TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度A的步骤；

(II)使TRPM4表达细胞与被测试样接触，使用钙指示剂测定该TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度B的步骤；和

(III)对步骤(I)中得到的细胞内钙离子浓度A与步骤(II)中得到的细胞内钙离子浓度B进行比较，评价被测试样所具有的TRPM4活化作用的步骤。

在步骤(I)中，使用钙指示剂测定TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度A。作为TRPM4表达细胞，优选使用表达外源性TRPM4的HEK293细胞等。

关于钙指示剂，出于能够通过简便的操作测定与钙离子结合的钙指示剂的量的原因，优选为能够利用光学特性的变化等来检测与钙离子结合前后的变化的试剂。作为光学特性的变化，可以举出例如荧光强度的变化、吸光度的变化等，但本发明并不仅限定于该例示。作为钙指示剂，可以举出例如在与钙离子结合前后荧光强度发生变化的荧光钙指示剂等，但本发明并不仅限于上述例示。作为钙指示剂的具体例，可以举出1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃基氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸五乙酰氧基甲酯(Fura 2-AM)、1-[2-氨基-5-(2,7-二氯-6-羟基-3-氧代-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酰氧基甲酯(Fluo 3-AM)、1-[2-氨基-5-(2,7-二氟-6-乙酰氧基甲氧基-3-氧代-9-呫吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲基苯氧基)乙烷-N,N,N’,N’-四乙酸四乙酰氧基甲酯(Fluo 4-AM)等荧光钙指示剂等，但本发明并不仅限于上述例示。在钙指示剂中，从测定容易、并且易于与TRPM4表达细胞内存在的夹杂物质的动态区分的方面考虑，优选在与钙离子结合前后荧光强度发生变化的荧光钙指示剂。

荧光钙指示剂可以具有一种激发波长，也可以具有两种以上的激发波长。在钙指示剂为荧光钙指示剂的情况下，出于荧光强度的测定容易、检测强度高的原因，该荧光钙指示剂优选具有两种激发波长的荧光钙指示剂。在测定细胞内钙浓度的变化时使用具有一种激发波长的荧光钙指示剂的情况下，可以基于该激发波长下的荧光强度来测定细胞内钙浓度的变化。在测定细胞内钙浓度的变化时使用具有两种以上的激发波长的荧光钙指示剂的情况下，从提高被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用的评价精度的方面考虑，可以选择从该两种以上的激发波长中选择的两种激发波长(第1激发波长和第2激发波长)，基于由第1激发波长和第2激发波长各自下的荧光强度计算出的荧光强度比，测定细胞内钙浓度的变化。在测定细胞内钙浓度时使用例如作为具有两种激发波长的荧光钙指示剂的FURA 2-AM的情况下，可以使用激发波长340nm下的荧光强度作为第1激发波长下的荧光强度(下文中也称为“第1荧光强度”)，使用激发波长380nm下的荧光强度作为第2激发波长下的荧光强度(下文中也称为“第2荧光强度”)。荧光强度比例如可以基于式(I)求出。

[荧光强度比]＝[第1荧光强度]/[第2荧光强度](I)

作为使用荧光钙指示剂的细胞内钙离子浓度A的测定方法，可以举出例如以下的测定法1等，但本发明并不仅限于上述例示。

<测定法1>

一种方法，其包括以下步骤：

将荧光钙指示剂导入TRPM4表达细胞中而得到指示剂导入细胞的步骤；

使指示剂导入细胞与钙离子接触，使钙离子与该指示剂导入细胞内的荧光钙指示剂结合的步骤；和

测定与指示剂导入细胞内的钙离子结合的荧光钙指示剂的荧光强度的步骤。

作为将荧光钙指示剂导入TRPM4表达细胞中的方法，可以举出例如在装有TRPM4表达细胞的回流室内使含有荧光钙指示剂的缓冲液进行循环的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。作为缓冲液，可以举出例如HEPES缓冲液等，但本发明并不仅限于上述例示。

作为使导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞与钙离子接触的方法，可以举出例如在装有导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞的回流室内使含有钙离子的缓冲液进行循环的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。作为缓冲液，可以举出例如HEPES缓冲液等，但本发明并不仅限于上述例示。

导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞与含有钙离子的缓冲液的接触温度根据TRPM4表达细胞的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据TRPM4表达细胞的种类等而决定。需要说明的是，为了排除温度对TRPM4活性的影响，TRPM4表达细胞与含有钙离子的缓冲液的接触优选在恒定温度环境下进行。

步骤(I)中使用的TRPM4表达细胞的数量根据钙离子浓度A的测定手段的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据钙离子浓度A的测定手段的种类等而决定。例如，在使用倒置显微镜以100倍的倍率对细胞进行观察并测定钙离子浓度A的情况下，从提高测定结果的可靠性的方面考虑，每1个视野(数据分析范围)的TRPM4表达细胞的数量优选为10个以上、更优选为100个以上，从确保细胞彼此的间隔以使细胞不会过密的方面考虑，优选为300个以下、更优选为200个以下。

在步骤(II)中，使TRPM4表达细胞与被测试样接触，使用钙指示剂测定该TRPM4表达细胞的细胞内钙离子浓度B。

作为使用荧光钙指示剂的细胞内钙离子浓度B的测定方法，可以举出例如以下的测定法2等，但本发明并不仅限于上述例示。

<测定法2>

一种方法，其包括以下步骤：

将荧光钙指示剂导入TRPM4表达细胞中而得到指示剂导入细胞的步骤；

使指示剂导入细胞与被测试样接触的步骤；

使被测试样接触后的细胞与钙离子接触，使钙离子与该细胞内的荧光钙指示剂结合的步骤；和

测定与细胞内的钙离子结合的荧光钙指示剂的荧光强度的步骤。

作为使导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞与被测试样接触的方法，可以举出在装有导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞的回流室内使含有荧光钙指示剂的缓冲液进行循环的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。作为使被测试样接触后的细胞与钙离子接触的方法，可以举出例如使含有钙离子而不含被测试样的缓冲液进行循环的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。需要说明的是，本发明中，可以在装有导入有荧光钙指示剂的TRPM4表达细胞的回流室内使含有被测试样的缓冲液进行循环后，使含有被测试样和钙离子的缓冲液进行循环。

步骤(II)中使用的细胞内钙离子浓度B的测定方法、接触温度和TRPM4表达细胞的数量与步骤(I)中使用的细胞内钙离子浓度A的测定方法、接触温度和TRPM4表达细胞的数量相同。

在步骤(III)中，对步骤(I)中得到的细胞内钙离子浓度A与步骤(II)中得到的细胞内钙离子浓度B进行比较，评价被测试样所具有的TRPM4活化作用。在步骤(III)中，在钙离子浓度B与钙离子浓度A相比减少的情况下，可以评价为该被测试样具有TRPM4活化作用，此外，钙离子浓度A与钙离子浓度B之间的差异越大，可以评价为该被测试样具有越高的TRPM4活化作用。

在使用被测试样接触前后的TRPM4表达细胞中的因TRPM4的活化引起的电流的增加作为TRPM4活性的变化的情况下，TRPM4的活化作用例如可以通过包括下述步骤的方法等来评价：

(i)在一定电位下测定TRPM4表达细胞内的电流A的步骤；

(ii)使TRPM4表达细胞与被测试样接触，在与步骤(i)中的电位相同的电位下测定该TRPM4表达细胞内的电流B的步骤；和

(iii)对步骤(i)中得到的电流A与步骤(ii)中得到的电流B进行比较，评价被测试样所具有的TRPM4活化作用的步骤。

在步骤(i)中，在一定电位下测定TRPM4表达细胞内的因TRPM4的活化引起的电流A。作为电流A的测定方法，可以举出例如膜片钳法等，但本发明并不仅限于上述例示。根据膜片钳法，可以测定TRPM4表达细胞的细胞膜中存在的1个或多个TRPM4的活化引起的电流。作为膜片钳法，可以举出例如全细胞法、细胞粘附法等，但本发明并不仅限于上述例示。

在步骤(ii)中，使TRPM4表达细胞与被测试样接触，在与步骤(i)中的电位相同的电位下测定该TRPM4表达细胞内的电流B。步骤(ii)中使用的电流B的测定方法与步骤(i)中使用的电流A的测定方法相同。

在步骤(iii)中，对步骤(i)中得到的电流A与步骤(ii)中得到的电流B进行比较，评价被测试样所具有的TRPM4活化作用。在步骤(iii)中，在电流A比电流B小的情况下，可以评价为该被测试样具有TRPM4活化作用。另外，电流A与电流B之间的差异越大，可以评价为该被测试样具有越高的TRPM4活化作用。

如以上所说明，根据本发明的被测试样的评价方法，由于采用了测定由被测试样通过TRPM4表达细胞中的TRPM4所引起的生理学现象、基于该生理学现象对被测试样所具有的细胞因子产生抑制作用进行评价的操作，因此能够容易且准确地评价被测试样是否具有抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用。因此，本发明的被测试样的评价方法可期待适用于炎症预防用化妆料、炎症预防剂等的开发。

2.细胞因子产生抑制剂

本发明的细胞因子产生抑制剂是在活化TRPM4而抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的用途中使用的细胞因子产生抑制剂，其特征在于，含有铝化合物作为用于活化TRPM4的有效成分。

本发明的细胞因子产生抑制剂由于含有铝化合物作为用于活化TRPM4的有效成分，因此能够有效抑制皮肤细胞中的细胞因子产生。因此，本发明的细胞因子产生抑制剂能够适合用于皮肤细胞中的细胞因子产生的抑制等。

本发明的产生抑制剂中的铝化合物的含量根据铝化合物的种类、本发明的细胞因子产生抑制剂的用途等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据铝化合物的种类、本发明的细胞因子产生抑制剂的用途等而适当设定。从充分表现出活化TRPM4而抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用的方面考虑，本发明的细胞因子产生抑制剂中的铝化合物的含量通常优选为0.0001质量％以上、更优选为0.005质量％以上、进一步优选为0.008质量％以上、特别优选为0.01质量％以上，从抑制对皮肤的负荷的方面考虑，优选为100质量％以下。

本发明的细胞因子产生抑制剂可以在不妨碍本发明目的的范围内含有例如水、pH调节剂、稳定剂等其他成分。需要说明的是，在本发明的细胞因子产生抑制剂含有其他成分的情况下，在不妨碍本发明目的的范围内，在本发明的细胞因子产生抑制剂中，铝化合物与其他成分可以形成复合体。

如以上所说明，本发明的细胞因子产生抑制剂能够有效抑制皮肤细胞中的细胞因子产生，因而能够适合用于抑制皮肤中的炎症的发病于未然。因此，本发明的细胞因子产生抑制剂可期待用于皮肤中的炎症预防用化妆料、皮肤中的炎症预防剂等用途中。

在将本发明的细胞因子产生抑制剂用于皮肤中的炎症预防用化妆料或皮肤中的炎症预防剂的情况下，该炎症预防用化妆料或炎症预防剂中的本发明的细胞因子产生抑制剂的含量根据炎症预防用化妆料或炎症预防剂的用途、本发明的细胞因子产生抑制剂中包含的铝化合物的种类等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据炎症预防用化妆料或炎症预防剂的用途、本发明的细胞因子产生抑制剂中包含的铝化合物的种类等而决定。关于炎症预防用化妆料或炎症预防剂中的本发明的细胞因子产生抑制剂的含量，通常，从充分表现出活化TRPM4而抑制皮肤中的炎症的作用的方面考虑，炎症预防用化妆料或炎症预防剂中的铝化合物的含量优选为0.0001质量％以上、更优选为0.0005质量％以上、进一步优选为0.0008质量％以上、特别优选为0.01质量％以上，从抑制对皮肤的负荷的方面考虑，希望调整成优选为20质量％以下、更优选为10质量％。在不妨碍活化TRPM4而抑制皮肤中的炎症的作用的范围内，炎症预防用化妆料或炎症预防剂中可以混配有例如溶剂、表面活性剂、保湿剂、增稠剂、防腐剂、抗氧化剂、pH调节剂等其他成分。炎症预防用化妆料或炎症预防剂的用量和施用次数根据炎症的种类、施用对象的种类、施用对象的年龄、施用对象的体重等而不同，因而不能一概地决定，因此优选根据炎症的种类、适用对象的种类、适用对象的年龄、适用对象的体重等而决定。

实施例

以下通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。需要说明的是，以下，“％(m/m)”表示质量/质量％(质量％)，“％(m/v)”表示质量/体积％，“％(v/v)”表示体积/体积％(体积％)。

制造例1

在含有5％(v/v)二氧化碳的空气的气氛中，在维持于37℃的直径35mm的培养皿上的含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM中，对5×10⁶个细胞的HEK293细胞进行培养。使用培养后的HEK293细胞、人TRPM4表达载体[OriGene公司制造、商品名：TrueClone TRPM4(NM_017636)Human cDNA Clone]和基因导入用试剂[ThermoFisher SCIENTIFIC公司制造、商品名：Lipofectamine Transfection Reagent]，按照该基因导入用试剂附带的规程将编码人TRPM4的核酸和编码红色荧光蛋白的核酸瞬时导入HEK293细胞中，得到转染子。以下，将发出红色荧光的转染子用作TRPM4过表达细胞。

参考例1

用磷酸缓冲生理盐水清洗制造例1中得到的TRPM4过表达细胞(实验编号1)。对于清洗后的1×10⁶个细胞，添加裂解缓冲液[组成：25mM三羟基甲基氨基甲烷(下文中称为“Tris”)、1mM乙二胺四乙酸、0.1mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、5mM氯化镁、100mM氯化钠、10％(v/v)甘油和1％(v/v)聚乙二醇-叔辛基苯基醚(TritonX-100)]100μL。对所得到的混合物进行搅拌后，在冰上孵育10分钟而得到细胞裂解物。将细胞裂解物以20000×g进行10分钟的离心分离(4℃)，得到上清。向所得到的上清90μL中添加试样缓冲液[组成：187mMTris/盐酸缓冲液(pH6.8)、6％(m/v)十二烷基硫酸钠、15％(m/v)蔗糖、0.015％(m/v)溴酚蓝、15％(v/v)2-巯基乙醇]45μL，得到电泳用试样(实验编号1)。

在实验编号1中，代替使用制造例1中得到的TRPM4过表达细胞(实验编号1)而使用人表皮角化细胞确立株(HaCaT细胞)(实验编号2)或正常人表皮角化细胞(实验编号3)，除此以外进行与实验编号1同样的操作，得到实验编号2和实验编号3的各电泳用试样。

将实验编号1～3的各电泳用试样5μL注入泳动凝胶[Invitrogen公司制造、商品名：NuPAGE 4-12％Bis Tris Gel]的孔中，以200V电泳45分钟。接着，使用转印试剂盒[Invitrogen公司制造、商品名：iBlot gel transfer stacks mini]和转印装置[Invitrogen公司制造、商品名：iBlot]，将泳动后的凝胶上的蛋白质转印到膜上。

使用转印后的膜、小鼠抗TRPM4抗体[OriGene公司制造、商品名：Anti-TRPM4,Mouse-Mono(10H5)TrueMAB、产品编号：TA500381]和二次抗体[HRP结合抗小鼠IgG抗体[CSTJapan株式会社制造、商品名：Anti-mouse IgG,HRP-linked Antibody、产品编号：#7076]，进行蛋白免疫印迹分析。

将参考例1中的免疫印迹分析的结果示于图1。图中，泳道M表示标记物，泳道1表示实验编号1的电泳用试样的蛋白免疫印迹分析的结果，泳道2表示实验编号2的电泳用试样的蛋白免疫印迹分析的结果，泳道3表示实验编号3的电泳用试样的蛋白免疫印迹分析的结果。另外，图中，箭头A表示与TRPM4对应的条带，箭头B表示与β-肌动蛋白对应的条带。

根据图1所示的结果，在泳道1～3中，在与TRPM4对应的位置检测出条带，因此可知，制造例1中得到的TRPM4过表达细胞、HaCaT细胞和正常人表皮角化细胞均表达TRPM4蛋白。

实施例1和2

在含有5％(v/v)二氧化碳的空气的气氛中，在维持于37℃的96孔板的培养基A[含有含10％(v/v)胎牛血清-100U/mL青霉素-100μg/mL链霉素-1％(v/v)L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的培养基用添加物(ThermoFisher SCIENTIFIC公司制造、商品名：GlutaMAX)的DMEM]0.1mL中，将HaCaT细胞培养24小时，得到含有6.4×10³个HaCaT细胞的细胞培养物。

将作为TRPM4激动剂的BTP2添加到细胞培养物中使其浓度为1nM(实施例1)或10nM(实施例2)，由此使BTP2与HaCaT细胞接触。将所得到的混合物在37℃下孵育10分钟。在孵育后的混合物中添加TNFα使其浓度为20ng/mL后，将所得到的混合物在37℃下孵育1小时，由此使TNFα与HaCaT细胞接触。之后，回收混合物中包含的HaCaT细胞。

比较例1

在含有5％(v/v)二氧化碳的空气的气氛中，在维持于37℃的96孔板的培养基A0.1mL中，将HaCaT细胞培养24小时，得到含有6.4×10³个HaCaT细胞的细胞培养物。将细胞培养物在培养基中于37℃孵育1小时10分钟，之后回收细胞。

比较例2

在含有5％(v/v)二氧化碳的空气的气氛中，在维持于37℃的96孔板的培养基A0.1mL中，将HaCaT细胞培养24小时，得到含有6.4×10³个HaCaT细胞的细胞培养物。在细胞培养物中添加TNFα使其浓度为20ng/mL后，将所得到的混合物在37℃下孵育1小时，由此使TNFα与HaCaT细胞接触。之后，从混合物中回收细胞。

试验例1

使用实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞和细胞裂解试剂[Roche公司制造、商品名：Realtime ReadyCell Lysis Kit]，得到含有RNA的试样。使用所得到的含有RNA的试样和RT-PCR用试剂盒[宝生物株式会社制造、商品名：One stepPrimeScript RT-PCRkit]进行qRT-PCR，由此测定实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的IL-1α基因、IL-8基因和TNF基因的各表达量。需要说明的是，IL-1α、IL-8和TNF是由TNFα诱导的炎性细胞因子。

将在试验例1中对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的IL-1α基因的表达量进行调查的结果示于图2，将对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的IL-8基因的表达量进行调查的结果示于图3，将对实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞中的TNF基因的表达量进行调查的结果示于图4。图2中，道1表示比较例1中得到的细胞中的IL-1α基因的表达量，道2表示比较例2中得到的细胞中的IL-1α基因的表达量，道3表示实施例1中得到的细胞中的IL-1α基因的表达量，道4表示实施例2中得到的细胞中的IL-1α基因的表达量。图3中，道1表示比较例1中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道2表示比较例2中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道3表示实施例1中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道4表示实施例2中得到的细胞中的IL-8基因的表达量。图4中，道1表示比较例1中得到的细胞中的TNF基因的表达量，道2表示比较例2中得到的细胞中的TNF基因的表达量，道3表示实施例1中得到的细胞中的TNF基因的表达量，道4表示实施例2中得到的细胞中的TNF基因的表达量。

由图2～4所示的结果可知，IL-1α基因、IL-8基因和TNF基因的各表达量随着BTP2的浓度的增加而减少。由这些结果暗示，TRPM4的活化与IL-1α基因、IL-8基因、TNF基因等炎性细胞因子基因的表达的抑制有关。另外，通过使具有活化TRPM4的作用的物质预先与皮肤细胞接触，能够抑制由TNFα诱导的炎性细胞因子在基因水平的表达，由此暗示，利用具有活化TRPM4的作用的物质，能够预防炎症。

制造例2

利用基因敲除技术破坏HaCaT细胞中的TRPM4基因，由此得到TRPM4基因被敲除的敲除HaCaT细胞。

比较例3

在实施例1中，代替使用HaCaT细胞而使用制造例2中得到的敲除HaCaT细胞，除此以外进行与实施例1相同的操作，得到细胞。

比较例4

在实施例2中，代替使用HaCaT细胞而使用制造例2中得到的敲除HaCaT细胞，除此以外进行与实施例2同样的操作，得到细胞。

比较例5

在比较例1中，代替使用HaCaT细胞而使用制造例2中得到的敲除HaCaT细胞，除此以外进行与比较例1同样的操作，得到细胞。

比较例6

在比较例2中，代替使用HaCaT细胞而使用制造例2中得到的敲除HaCaT细胞，除此以外进行与比较例2同样的操作，得到细胞。

试验例2

在试验例1中，代替使用实施例1～2和比较例1～2中得到的各细胞而使用比较例3～6中得到的各细胞，除此以外进行与试验例1同样的操作，测定比较例3～6中得到的各细胞中的IL-1α基因、IL-8基因和TNF基因的各表达量。

将在试验例2中对比较例3～6中得到的各细胞中的IL-8基因的表达量进行调查的结果示于图5。图5中，道1表示比较例5中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道2表示比较例6中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道3表示比较例3中得到的细胞中的IL-8基因的表达量，道4表示比较例4中得到的细胞中的IL-8基因的表达量。

由图5所示的结果可知，在使敲除HaCaT细胞与BTP2接触后与TNFα接触时的IL-8基因的表达量与不使敲除HaCaT细胞与BTP2接触而与TNFα接触时的IL-8基因的表达量为相同程度。另外，对于IL-1α基因、TNF基因等IL-8基因以外的炎性细胞因子基因，也观察到与IL-8基因同样的倾向。由这些结果可知，与BTP2接触时的TRPM4表达细胞中的炎性细胞因子基因的表达量的减少是TRPM4的活化引起的。

如以上所说明，通过使具有活化TRPM4的作用的物质预先与皮肤细胞接触，可抑制皮肤细胞中的炎性细胞因子基因的表达，由此可知，利用具有活化TRPM4的作用的物质，能够抑制炎性细胞因子的表达，能够预防炎症。

制造例3

将毒胡萝卜素添加到不含钙的溶液(下文中称为“溶液B”)[组成：140mM氯化钠、5mM氯化钾、2mM氯化镁、5mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、10mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)]中使其浓度为1μM，得到含有毒胡萝卜素的浴液。

制造例4

将离子霉素添加到含钙溶液(下文中称为“溶液A”)[组成：140mM氯化钠、5mM氯化钾、2mM氯化镁、2mM氯化钙、10mM葡萄糖和10mM的HEPES缓冲液(pH7.4)]中使其浓度为25μM，得到含有离子霉素的溶液A。

制造例5

将作为TRPM4激动剂的U-73122添加到溶液B中使其浓度为10μM，得到含有U-73122的浴液。

制造例6

将作为TRPM4激动剂的U-73122添加到溶液A中使其浓度为10μM，得到含有U-73122的溶液A。

参考例2

(1)Fura 2-AM导入细胞的制备

在含有细胞内钙离子测定用试剂Fura 2-AM的DMEM中，将作为TRPM4表达细胞的在制造例1中得到的表达外源性TRPM4的TRPM4过表达细胞在室温(25℃)下孵育60分钟，由此得到Fura 2-AM导入细胞。

(2)不存在TRPM4激动剂下的细胞内钙离子浓度的测定

将参考例2(1)中得到的FURA 2-AM导入细胞放入带回流室的倒置显微镜的回流室中。以下，使用CCD照相机，连续拍摄FURA 2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的激发波长340nm下的荧光和FURA 2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的激发波长380nm下的荧光，使用图像分析用软件[株式会社Solution Systems制造、商品名：IPLab]求出FURA 2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的激发波长340nm下的荧光强度(下文中称为“荧光强度_340nm”)和FURA2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的激发波长380nm下的荧光强度(下文中称为“荧光强度_380nm”)。

在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使溶液B回流。从溶液B的回流开始时起经过50秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使制造例3中得到的含有毒胡萝卜素的浴液进行回流，由此使钙离子从内质网释放。从含有毒胡萝卜素的浴液回流开始时起经过240秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使溶液A进行回流。从溶液A回流开始时起经过150秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使制造例4中得到的含有离子霉素的溶液A回流180秒。在TRPM4活化的情况下，钠离子通过TRPM4被引入细胞内，伴随着引入的钠离子的量的增加，流入细胞内的钙离子的量减少。因此，通过测定细胞内钙离子浓度的经时变化，能够间接地测定TRPM4活性。

(3)TRPM4激动剂存在下的细胞内钙离子浓度的测定

将参考例2(1)中得到的FURA 2-AM导入细胞放入带回流室的倒置显微镜的回流室中。以下，经时地测定FURA 2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的荧光强度_340nm和FURA 2-AM导入细胞内的基于FURA 2-AM的荧光强度_380nm。使用所测定的荧光强度_340nm和荧光强度_380nm，基于式(Ia)求出荧光强度比的经时变化。

荧光强度比＝荧光强度_340nm/荧光强度_380nm (Ia)

在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使溶液B回流。从溶液B的回流开始时起经过50秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使制造例3中得到的含有毒胡萝卜素的浴液回流，由此使钙离子从内质网释放。从含有毒胡萝卜素的浴液回流开始时起经过120秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使制造例5中得到的含有U-73122的浴液回流。从含有U-73122的浴液回流开始时起经过120秒后，在放有FURA 2-AM导入细胞的回流室内，使制造例6中得到的含有U-73122的溶液A回流。从含有U-73122的溶液A回流开始时起经过150秒后，在放有FURA2-AM导入细胞的回流室内，使制造例4中得到的含有离子霉素的溶液A回流180秒。

(4)相对荧光强度的计算

使用参考例2(2)中的从溶液A回流开始时起经过40秒后的荧光强度比A和参考例2(2)中的从含有离子霉素的溶液A回流开始时起经过170秒后的荧光强度比B，根据式(II)计算出不存在TRPM4激动剂(对照)下的相对荧光强度。

[相对荧光强度]＝荧光强度比A/荧光强度比B (II)

使用参考例2(3)中的从含有U-73122的溶液A回流开始时起经过40秒后的荧光强度比和参考例2(3)中的从含有离子霉素的溶液A回流开始时起经过170秒后的荧光强度比，根据式(II)计算出TRPM4激动剂存在下的相对荧光强度。

将在参考例2中对TRPM4激动剂的有无与相对荧光强度的关系进行调查的结果示于图6。图中，道1表示TRPM4激动剂存在下的相对荧光强度，道2表示不存在TRPM4激动剂下的相对荧光强度。

根据图6所示的结果，TRPM4激动剂存在下的相对荧光强度比不存在TRPM4激动剂下的相对荧光强度低，因此可知，随着TRPM4的活化，流入HEK293细胞内的钠离子量增加，与之相伴，细胞内钙离子浓度减少。由这些结果可知，通过使用如制造例1中得到的TRPM4过表达细胞那样过表达外源性TRPM4的细胞来调查被测试样对细胞内钙离子浓度的作用，可以评价被测试样是否具有活化TRPM4而抑制皮肤细胞中的细胞因子产生的作用。

制造例7

将作为被测试样的氯化铝添加到溶液B中使其浓度为1mM，得到含有被测试样的浴液。

制造例8

将作为被测试样的氯化铝添加到溶液A中使其浓度为1mM，得到含有被测试样的溶液A。

制造例9

将作为被测试样的硫酸铝钾添加到溶液B中使其浓度为1mM，得到含有被测试样的浴液。

制造例10

将作为被测试样的硫酸铝钾添加到溶液A中使其浓度为1mM，得到含有被测试样的溶液A。

实施例3

在参考例2中，代替使用含有U-73122的浴液而使用制造例7中得到的含有被测试样的浴液，并且代替使用含有U-73122的溶液A而使用制造例8中得到的含有被测试样的溶液A，除此以外进行与参考例2同样的操作，计算出相对荧光强度。

另外，在上述操作中，代替使用制造例7中得到的含有被测试样的浴液而使用制造例9中得到的含有被测试样的浴液，并且代替使用制造例8中得到的含有被测试样的溶液A而使用制造例10中得到的含有被测试样的溶液A，除此以外进行与上述同样的操作，计算出相对荧光强度。

将在实施例3中对被测试样的种类与相对荧光强度的关系进行调查的结果示于图7。图中，道1表示使用氯化铝作为被测试样时的相对荧光强度，道2表示使用硫酸铝钾作为被测试样时的相对荧光强度，道3表示不存在被测试样下的相对荧光强度。

由图7所示的结果可知，使用氯化铝或硫酸铝钾作为被测试样时的相对荧光强度低于不存在被测试样下的相对荧光强度。由这些结果可知，氯化铝和硫酸铝钾具有活化TRPM4而抑制细胞因子产生的作用。

实施例4

将表皮角化细胞在DMEM中于37℃下培养1天。对所得到的培养细胞实施胰蛋白酶处理。在胰蛋白酶处理后的培养细胞中添加DMEM，调整成培养细胞的浓度为1×10⁵个/mL，由此得到培养液。将所得到的培养液1mL接种到12孔板的各孔中，将上述培养细胞在37℃下培养24小时。培养后，用含有硫酸铝钾的DMEM(硫酸铝钾浓度：2mM)500μL置换培养上清500μL，之后在37℃下静置10分钟。静置后，添加含有TNFα的DMEM(TNFα浓度：220ng/mL)100μL，得到培养液A(硫酸铝钾浓度：1mM、TNFα浓度：20ng/mL)。

将所得到的培养液A在37℃下培养48小时后，将培养上清装入离心管中，以14000×g离心分离5分钟，回收培养上清A。另一方面，将12孔板的各孔中残留的细胞用冰冷PBS进行清洗。向该细胞中添加蛋白提取用缓冲液[Santa Cruz公司制造、商品名：RIPA缓冲液]200μL，利用细胞刮从各孔的壁面上剥离细胞，得到细胞悬浮液。将细胞悬浮液以14000×g离心分离5分钟，回收上清，由此得到细胞提取液A。

比较例7

将表皮角化细胞在DMEM培养基中于37℃下培养1天。对所得到的培养细胞实施胰蛋白酶处理。在胰蛋白酶处理后的培养细胞中添加DMEM，调整成培养细胞的浓度为1×10⁵个/mL，由此得到培养液。将所得到的培养液1mL接种到12孔板的各孔中，将上述培养细胞在37℃下培养24小时。培养后，用DMEM 500μL置换培养上清500μL，之后在37℃下静置10分钟。静置后，添加含有TNFα的DMEM(TNFα浓度：220ng/mL)100μL，得到培养液B(TNFα浓度：20ng/mL)。

将所得到的培养液B在37℃下培养48小时后，将培养上清装入离心管中，以14000×g离心分离5分钟，回收培养上清B。另一方面，将12孔板的各孔中残留的细胞用冰冷PBS进行清洗。向该细胞中添加蛋白提取用缓冲液[Santa Cruz公司制造、商品名：RIPA缓冲液]200μL，利用细胞刮从各孔的壁面上剥离细胞，得到细胞悬浮液。将细胞悬浮液以14000×g离心分离5分钟，回收上清，由此得到细胞提取液B。

试验例3

使用实施例4中得到的细胞提取液A或比较例7中得到的细胞提取液B与IL-1α定量试剂[R&D公司制造、商品名：Human IL-1alpha/IL-1F1 DuoSet ELISA DY200]，测定实施例4和比较例7中得到的各培养细胞(表皮角化细胞)中的IL-1α表达量。

将在试验例3中对实施例4和比较例7中得到的各表皮角化细胞中的IL-1a表达量进行调查的结果示于图8。图中，道1表示实施例4中得到的表皮角化细胞中的IL-1α表达量，道2表示比较例7中得到的表皮角化细胞中的IL-1α表达量。

由图8所示的结果可知，实施例4中得到的表皮角化细胞中的IL-1α表达量少于比较例7中得到的表皮角化细胞中的IL-1α表达量。由该结果可知，硫酸铝钾抑制由TNFα诱导的IL-1α的表达。

另外，使用实施例4中得到的培养上清A或比较例7中得到的培养上清B与IL-6定量试剂[R&D公司制造、商品名：Human IL-6DuoSet ELISA DY206]，测定实施例4和比较例7中得到的各培养细胞(表皮角化细胞)中的IL-6表达量。

将在试验例3中对实施例4和比较例7中得到的各表皮角化细胞中的IL-6表达量进行调查的结果示于图9。图中，道1表示实施例4中得到的表皮角化细胞中的IL-6表达量，道2表示比较例7中得到的表皮角化细胞中的IL-6表达量。

由图9所示的结果可知，实施例4中得到的表皮角化细胞中的IL-6表达量少于比较例7中得到的表皮角化细胞中的IL-6表达量。由该结果可知，硫酸铝钾抑制由TNFα诱导的IL-6的表达。

由这些结果可知，通过利用由被测试样通过TRPM4表达细胞的TRPM4所引起的生理学现象，能够对活化TRPM4而抑制炎性细胞因子的表达的物质进行评价。另外可知，利用活化TRPM4的物质，能够抑制IL-1α、IL-6等炎性细胞因子的表达，能够预防炎症。

如以上所说明，通过使BTP2等TRPM4激动剂；氯化铝、硫酸铝钾等铝化合物等具有活化TRPM4的作用的物质预先与皮肤细胞接触，可抑制皮肤细胞中的炎性细胞因子及其基因的表达，因此可知，利用具有活化TRPM4的作用的物质，能够抑制炎性细胞因子的表达，能够预防炎症。因此，本发明可期待适合用于炎症预防用化妆料、炎症预防剂等的开发。

另外可知，通过使用TRPM4表达细胞，测定由被测试样通过TRPM4表达细胞的TRPM4所引起的生理学现象，并将该生理学现象用于被测试样的评价，能够对被测试样所具有的皮肤细胞中的细胞因子产生抑制作用进行评价。