阅读说明：本技术 一组芥蓝InDel分子标记及其开发方法与应用 (Mustard blue InDel molecular markers and development method and application thereof ) 是由 张艳 洪晓如 陈汉才 黎庭耀 沈卓 杨易 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一组芥蓝InDel分子标记及其开发方法与应用,涉及分子标记技术领域。本发明提供的一组芥蓝InDel分子标记包括60个位点所对应的引物对,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.120所示。本发明开发的标记具有操作简单、稳定性好、多态性高的特点；且上述引物对稳定性好,均匀分布于9个连锁群,可用于芥蓝重要农艺性状基因的定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与遗传连锁图谱的构建或分子标记辅助选择育种,可以提高工作效率。(The invention provides a group of cabbage mustard InDel molecular markers and a development method and application thereof, and relates to the technical field of molecular markers. The group of mustard blue InDel molecular markers provided by the invention comprises primer pairs corresponding to 60 sites, and the nucleotide sequences of the primer pairs are shown as SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 120. The marker developed by the invention has the characteristics of simple operation, good stability and high polymorphism; the primer pair has good stability, is uniformly distributed in 9 linkage groups, can be used for positioning important agronomic trait genes of the cabbage mustard, analyzing genetic diversity, constructing a fingerprint map, performing whole genome association analysis and constructing a genetic linkage map or performing molecular marker-assisted selective breeding, and can improve the working efficiency.)

一组芥蓝InDel分子标记及其开发方法与应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一组芥蓝InDel分子标记及其开发方法与应用。

背景技术

芥蓝(Brassica alboglabra)是十字花科芸薹属甘蓝种的一个亚种，主要栽培于广东、广西、福建等地，是华南地区的特色蔬菜，以花薹和叶片为食。芥蓝传统的育种方法周期长，效率低。将分子标记辅助选择与传统育种相结合，将加快新品种选育及遗传改良进程。分子标记的开发将为分子标记辅助育种奠定基础。

分子标记(Molecular Markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。广泛应用于遗传育种、基因定位、物种亲缘关系鉴别等方面。随着生物技术的不断发展，目前已建立20多种标记，如RFLP(restrictionfragment length polymorphisms)、RAPD(random amplified polymorthic DNAs)、SSR(simple sequence repeat)、SRAP(sequence related amplified polymorphism)、SNP(single nucleotide polymorphisms)、InDel(insertion-deletion)等，其中InDel被广泛用于基因定位和遗传多样性分析(Li and Mao.,2018；Shu et al.,2018；Wu et al.,2014)。InDel标记指的是在近缘种或同一物种的不同个体间同源序列的等位基因位点上***或缺失一定的核苷酸片段的分子标记，InDel的出现主要与基因组序列的碱基类型和DNA复制错误有关(杨洁等,2016；Jander et al.,2002)。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多。就分布密度而言，InDel仅次于SNP，但远高于SSR。在水稻中平均密度为每953bp包含一个InDel，茄子中平均密度为每1.4M包含一个InDel。InDel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊，InDel标记已经逐渐应用到水稻、黄瓜、辣椒、小麦、甘蓝、白菜等作物中。然而，相对其它作物，芥蓝的InDel标记较少，其应用也较为有限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于建立芥蓝InDel标记开发的技术体系，为芥蓝重要性状基因定位、遗传图谱构建、遗传多样性分析及分子标记辅助选择育种提供更多新的InDel标记，弥补目前芥蓝InDel标记不足的问题。本发明的一个目的在于提供一组芥蓝InDel分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述芥蓝InDel分子标记的开发方法。

本发明的再一目的在于提供上述芥蓝InDel分子标记的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一组芥蓝InDel分子标记，包括60个位点所对应的引物对，各引物对名称和核苷酸序列如表1所示(亦如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.120所示)：

表1 60对InDel分子标记的引物对信息

上述芥蓝InDel分子标记的开发方法，包括以下步骤：

(1)提取紫薹芥蓝“HJJL”和绿薹芥蓝“612F”的基因组DNA；

(2)利用illumina HiSeqTM对所得基因组DNA进行重测序，利用生物信息学软件进行数据分析，以参考序列为“桥梁”找出双亲之间的InDel位点；

(3)挑选均匀分布于芥蓝9条染色体上的InDel位点，提取InDel位点前后400bp的序列，设计对应的InDel引物；引物设计的条件是：长度为100～300bp，Tm值为55℃～60℃；

(4)通过多个代表性芥蓝材料鉴定步骤(3)的InDel位点在多材料中的扩增多态性，以至少在2个材料间呈现扩增多态性为原则筛选得到一组InDel位点；

(5)从步骤(4)得到的InDel位点中进一步挑选扩增条带清晰的InDel位点，每条染色体上的InDel位点不少于5个，得到所述的芥蓝InDel分子标记。

步骤(4)中所述的多个代表性芥蓝材料优选为8个代表性芥蓝材料，具体选自：紫薹芥蓝“HJJL”、桃山芥蓝、大叶红脚芥蓝、潮阳红脚芥蓝、绿薹芥蓝“612F”、07M芥蓝、612M芥蓝、冬强M芥蓝。

其中，桃山芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00078；大叶红脚芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00068；潮阳红脚芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00077；07M芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00039；612M芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00042；冬强M芥蓝：广东省农作物种质资源保护库GDⅡ4E00046。所涉及的8个代表性芥蓝材料均可从广东省农业科学院蔬菜研究所获得。

该方法还可应用于包括芥蓝、甘蓝、白菜等所有十字花科蔬菜InDel分子标记的开发。

上述芥蓝InDel分子标记在芥蓝遗传图谱构建、QTL定位、全基因组关联分析、分子辅助育种及遗传多样性分析中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点及效果：

(1)本发明通过对2个芥蓝自交系进行了全基因组重测序和InDel位点差异分析，以***/缺失5～20bp为标准设计InDel引物，得到覆盖全基因组的InDel标记。针对芥蓝二个代表性品种的基因组差异开发的InDel多态标记具有很高的成功率，比起根据SSR位点设计的引物再筛选多态性具有更高的效率，并且分布密度远远高于SSR。具有操作简单、稳定性好、多态性高的特点。

(2)本发明的60对InDel分子标记，稳定性好，均匀分布于9个连锁群上。用于芥蓝重要农艺性状基因的定位、遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析与遗传连锁图谱的构建或分子标记辅助选择育种，可以提高工作效率。

附图说明

图1为5个InDel分子标记在8份芥蓝材料的PCR扩增产物凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker、泳道A1-A8为InDel标记J113、泳道B1-B8为InDel标记J115、泳道C1-C8为InDel标记J117、泳道D1-D8为InDel标记J125、泳道E1-E8为InDel标记J128；8份芥蓝材料依次为紫薹芥蓝“HJJL”、桃山芥蓝、大叶红脚芥蓝、潮阳红脚芥蓝、绿薹芥蓝“612F”、07M芥蓝、612M芥蓝、冬强M芥蓝。

图2为InDel标记J252在33份芥蓝材料的PCR扩增产物凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker，其余泳道的编号与33种芥蓝材料的DNA序号对应。

图3为InDel标记J117在33份芥蓝材料的PCR扩增产物凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker，其余泳道的编号与33种芥蓝材料的DNA序号对应。

图4为InDel标记J813在33份芥蓝材料的PCR扩增产物凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker，其余泳道的编号与33种芥蓝材料的DNA序号对应。

图5为本发明一组芥蓝InDel分子标记对33份芥蓝材料的聚类分析结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例子仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中所述的紫薹芥蓝“HJJL”和绿薹芥蓝“612F”在文献“张艳,洪晓如,黎庭耀,et al.芥蓝紫薹性状的遗传分析与基因定位[J].分子植物育种,2018.”中公开。

实施例1一组芥蓝InDel分子标记的开发

为了提高芥蓝InDel分子标记开发的成功率，本发明对芥蓝代表性品种紫薹芥蓝“HJJL”和绿薹芥蓝“612F”进行了全基因组重测序，再和参考基因组甘蓝(B.oleracea)比对，筛选两个芥蓝品种间有差异的InDel位点进行标记开发。

(1)芥蓝DNA的提取：

①取芥蓝的嫩叶约2g，用液氮研磨，在液氮快蒸发干时迅速加入1000μL 2％CTAB提取缓冲液，混匀后置于65℃水浴中温浴50min，每隔10min摇动一次；

②静置至室温后在4℃下12000rpm离心10min，将上清约800μL转移到新的2mL离心管；

③加入等体积的氯仿：异戊醇＝24：1，颠倒混匀，静置3-5分钟，在4℃下12000rpm离心10min，将上清液约600μL转入新的1.5mL离心管中；

④加等体积-20℃下预冷的异丙醇，缓慢混匀，缓慢颠倒20次，置于-20℃下培养30min；

⑤在4℃下12000rpm离心10min，看到底部白色沉淀后，弃上清，先后分别加入800μL 75％和95％酒精洗涤两次沉淀，弃上清，室温下于通风橱中晾干；

⑥加入100μL无菌水溶解。

利用紫外/可见光光度计进行DNA纯度分析和定量检测。其中，OD值在1.8～2.0，含量在1.5μg以上的DNA样品被用于建库。

(2)芥蓝样品重测序和数据分析

检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit进行建库，严格使用说明书推荐的试剂和耗材。DNA片段经末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。

构建好的文库通过illumina HiSeq进行测序。本次测序共产生Raw data11.926G，过滤后的Clean data11.855G，各样本的Raw data在5896.781M～6029.31M之间，测序质量高(Q20>＝95.72％、Q30>＝90.47％)，GC含量在40.92％～40.96％之间。有效测序数据通过BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组^[1]，比对结果经SAMTOOLS(参数：rmdup)去除重复^[2]。参考基因组下载地址：Brassica_oleracea.v2.1.29.dna.toplev el.fa。参考基因组大小为488622507bp，所有样本的比对率在96.44％～96.73％之间，对参考基因组(排除N区)的平均覆盖深度在12.43X～12.81X之间，1X覆盖度(至少有一个碱基的覆盖)在87.81％以上。

利用SAMTOOLs(mpileup-m 2-F 0.002-d 1000)^[2]检测长度小于50bp的小片段***与缺失(InDel)，然后用ANNOVAR软件对检测出的InDel进行注释^[3]。

“HJJL”和“612F”基因组序列经过比对后，对两个自交系序列进行InDel提取，共有176719个InDel位点差异，InDel的长度从1～21bp均有分布，但是主要还是以小片段(1～6bp)分布为主。总体上，分布于芥蓝各个染色体上，InDel位点比较均匀。

参考文献：

[1].Li H,Durbin R:Fast and accurate short read alignment withBurrows-Wheeler transform.Bioinformatics2009,25(14):1754-1760.

[2].Li H,Handsaker B,Wysoker A,Fennell T,Ruan J,Homer N,Marth G,Abecasis G,Durbin R:The Sequence Alignment/Map format andSAMtools.Bioinformatics 2009,25(16):2078-2079.

[3].Wang K,Li M,Hakonarson H:ANNOVAR:functional annotation of geneticvariants from high-throughput sequencing data.Nucleic acids research 2010,38(16):e164.

(3)芥蓝InDel分子标记的确定

挑选均匀分布于芥蓝9条染色体上的InDel位点，共筛选出367个InDel位点，提取InDel位点前后400bp的序列，利用Primer 3.0软件设计对应的InDel引物。为了后续检测方便，InDel引物设计长度一般为100～300bp，引物的Tm值为55℃～60℃。引物由上海生物工程有限公司合成。

利用“HJJL”、桃山芥蓝、大叶红脚芥蓝、潮阳红脚芥蓝、“612F”、07M芥蓝、612M芥蓝、冬强M芥蓝等8个代表芥蓝样品鉴定上述InDel引物在多品种中的扩增多态性。以8个芥蓝基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：2μL 10×PCR缓冲液，正、反引物各0.6μL(10μmol/L)，dNTP0.3μL(10mmol/L)，0.3μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，1μL DNA模板，双蒸水补足至20μL。扩增反应PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸60s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min。用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，发现284对InDel引物在至少2个芥蓝自交系间有多态性，阳性率为77.4％。其中5对InDel引物J113、J115、J117、J125、J128在8份芥蓝材料的电泳结果如图1所示。根据图1可知，5对InDel引物在8份芥蓝材料中均扩增出多态性条带，具有多态性。

从这284对多态性InDel标记中进一步挑选扩增条带清晰的60对InDel标记，每条染色体上的InDel标记不少于5对，得到本发明一组芥蓝InDel分子标记，各引物对名称和核苷酸序列如表1所示，亦如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.120所示。

实施例2一组芥蓝InDel分子标记在芥蓝遗传多样性分析中的应用

取33份不同品种芥蓝材料的嫩叶提取基因组DNA(参考实施例1中的方法)，33种芥蓝材料的名称及对应DNA序号如下表2所示。以33个芥蓝材料的基因组DNA为模板，用实施例1进一步挑选得到的60对InDel标记引物对33份芥蓝DNA样品进行PCR扩增(参考实施例1中的反应条件)，用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，其中InDel引物J252、J117、J813的电泳结果分别如图2、3、4所示。电泳图谱中的每一条带均作为1个位点，扩增片段的出现与否分别赋值“1”和“0”，制成0-1矩阵表。然后将制成的0-1矩阵表输入NTSYS-PC软件用UPGMA法进行聚类分析，自动生成树状图，结果如图5所示。分析结果表明，60对引物在33份芥蓝材料中均有良好的扩增效果，适用于芥蓝遗传多样性分析。

表2 33种芥蓝材料的名称及对应DNA序号

上述涉及的33种芥蓝材料均可从广东省农业科学院蔬菜研究所获得。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所

<120> 一组芥蓝InDel分子标记及其开发方法与应用

<160> 120

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> J113正向引物

<400> 1

gtatcgtcct gtaatagaaa acg 23

<210> 2

<220>

<223> J113反向引物

<400> 2

tgccaaggaa taatgatgta aag 23

<210> 3

<220>

<223> J115正向引物

<400> 3

gaaacaaatc gatcagtctc tc 22

<210> 4

<220>

<223> J115反向引物

<400> 4

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<210> 5

<220>

<223> J117正向引物

<400> 5

caccatttct tctcattagt cg 22

<210> 6

<220>

<223> J117反向引物

<400> 6

aaccctcttc acttgacatt at 22

<210> 7

<220>

<223> J125正向引物

<400> 7

ttatcatata cagtggtgga gc 22

<210> 8

<220>

<223> J125反向引物

<400> 8

ttggttctga tggttaaatt gg 22

<210> 9

<220>

<223> J128正向引物

<400> 9

atctccttta acatcacagc ag 22

<210> 10

<220>

<223> J128反向引物

<400> 10

tcatcctcac cttctaactc at 22

<210> 11

<220>

<223> J129正向引物

<400> 11

gtgacataga ctagttggga ttt 23

<210> 12

<220>

<223> J129反向引物

<400> 12

cacggtcaat aacttaacca ttt 23

<210> 13

<220>

<223> J135正向引物

<400> 13

gtgaggaaca tgagtagatg ac 22

<210> 14

<220>

<223> J135反向引物

<400> 14

attgagctga ctattcatga cc 22

<210> 15

<220>

<223> J136正向引物

<400> 15

tttcaatcaa caatgtgaca gac 23

<210> 16

<220>

<223> J136反向引物

<400> 16

ctctgaatat tttggtggtc tct 23

<210> 17

<220>

<223> J144正向引物

<400> 17

tttctatgtt tgattgctgc ttc 23

<210> 18

<220>

<223> J144反向引物

<400> 18

tgggattagt cgaagcataa ttt 23

<210> 19

<220>

<223> J214正向引物

<400> 19

tacccaatca aagccaatac aa 22

<210> 20

<220>

<223> J214反向引物

<400> 20

tttgtctagt ttccttgcag tt 22

<210> 21

<220>

<223> J224正向引物

<400> 21

cttcctactt tgttaccata cgt 23

<210> 22

<220>

<223> J224反向引物

<400> 22

tgaatacatt ggagctagga ttc 23

<210> 23

<220>

<223> J225正向引物

<400> 23

tcaacaactt taggcatcat ca 22

<210> 24

<220>

<223> J225反向引物

<400> 24

ccagcagagc aattaatcaa ag 22

<210> 25

<220>

<223> J231正向引物

<400> 25

atctcccaac ttcacatgat tc 22

<210> 26

<220>

<223> J231反向引物

<400> 26

gtgaaaacat gaaacgcctt ta 22

<210> 27

<220>

<223> J238正向引物

<400> 27

tctactcttt acgcttgaaa gtt 23

<210> 28

<220>

<223> J238反向引物

<400> 28

ctcgagcaag tttaaccaat tag 23

<210> 29

<220>

<223> J252正向引物

<400> 29

gctttaacca catgactgaa tg 22

<210> 30

<220>

<223> J252反向引物

<400> 30

tttcgaacta agtttctccc ag 22

<210> 31

<220>

<223> J335正向引物

<400> 31

tcatcatcct gagtaagagt gt 22

<210> 32

<220>

<223> J335反向引物

<400> 32

gagtcctcag agagtttact tc 22

<210> 33

<220>

<223> J339正向引物

<400> 33

aacatcgaat tgctatggag tt 22

<210> 34

<220>

<223> J339反向引物

<400> 34

ttgtgagggg aattcgatta tc 22

<210> 35

<220>

<223> J343正向引物

<400> 35

atcctttcga ctttcacgtt ta 22

<210> 36

<220>

<223> J343反向引物

<400> 36

agcttcaatt ataccacgct ag 22

<210> 37

<220>

<223> J347正向引物

<400> 37

cttcttcatt cgagttgttc tgt 23

<210> 38

<220>

<223> J347反向引物

<400> 38

gaaacgattg gagaaactac gat 23

<210> 39

<220>

<223> J354正向引物

<400> 39

aaccagttaa tgaagcagtt gg 22

<210> 40

<220>

<223> J354反向引物

<400> 40

taagacatat gacggtttgg ga 22

<210> 41

<220>

<223> J410正向引物

<400> 41

tctgcactag tttcatcact atc 23

<210> 42

<220>

<223> J410反向引物

<400> 42

cgctgctgat tatctgatta aac 23

<210> 43

<220>

<223> J411正向引物

<400> 43

gatctccacc aagcttataa ctt 23

<210> 44

<220>

<223> J411反向引物

<400> 44

tacgactaac attttgctcg ata 23

<210> 45

<220>

<223> J412正向引物

<400> 45

ctaatcgtcc ttagtgtgca ata 23

<210> 46

<220>

<223> J412反向引物

<400> 46

gggagagagc tattaagagt ttc 23

<210> 47

<220>

<223> J414正向引物

<400> 47

ttgagatatc agtatgagcc ca 22

<210> 48

<220>

<223> J414反向引物

<400> 48

tttactgaaa atggtagccc tc 22

<210> 49

<220>

<223> J421正向引物

<400> 49

tgagattttg cagacgaatt tg 22

<210> 50

<220>

<223> J421反向引物

<400> 50

ccctagaatt agtcggaagg ta 22

<210> 51

<220>

<223> J422正向引物

<400> 51

attggatatc gtgtcgtttt cta 23

<210> 52

<220>

<223> J422反向引物

<400> 52

aaagaggttt tcaacgagta tga 23

<210> 53

<220>

<223> J434正向引物

<400> 53

gactttctct tgtggctata tca 23

<210> 54

<220>

<223> J434反向引物

<400> 54

tgtttggttg aagtatgttt tgg 23

<210> 55

<220>

<223> J437正向引物

<400> 55

taccattgct tatctgaaca tgt 23

<210> 56

<220>

<223> J437反向引物

<400> 56

gcctagattt ggtttcttag tct 23

<210> 57

<220>

<223> J440正向引物

<400> 57

ccatcatcta caggtttcga at 22

<210> 58

<220>

<223> J440反向引物

<400> 58

aagggttatg gccttctact at 22

<210> 59

<220>

<223> J516正向引物

<400> 59

tttgtattga accctgagat gg 22

<210> 60

<220>

<223> J516反向引物

<400> 60

aggccgacga tatttataga ga 22

<210> 61

<220>

<223> J524正向引物

<400> 61

ttggaagtga gattgagaaa gg 22

<210> 62

<220>

<223> J524反向引物

<400> 62

ataaagggca aagaggacat tt 22

<210> 63

<220>

<223> J527正向引物

<400> 63

tcggaactga ttacaacgaa g 21

<210> 64

<220>

<223> J527反向引物

<400> 64

gctaatagtt acggcagtga a 21

<210> 65

<220>

<223> J534正向引物

<400> 65

cgacaactca actccaagta a 21

<210> 66

<220>

<223> J534反向引物

<400> 66

caacgagctg caacttagat a 21

<210> 67

<220>

<223> J538正向引物

<400> 67

catctccata cctttcacgt c 21

<210> 68

<220>

<223> J538反向引物

<400> 68

actcaccgaa cacaaaattc t 21

<210> 69

<220>

<223> J545正向引物

<400> 69

gcaaatcaag gaagacaaga ag 22

<210> 70

<220>

<223> J545反向引物

<400> 70

agccactttc tagactccta at 22

<210> 71

<220>

<223> J6601正向引物

<400> 71

agagcacacc tttaactttg c 21

<210> 72

<220>

<223> J6601反向引物

<400> 72

tcagaagagt tcatccctta gc 22

<210> 73

<220>

<223> J6603正向引物

<400> 73

gcctatcacc gttctagctt at 22

<210> 74

<220>

<223> J6603反向引物

<400> 74

tttccccatc aaattccgtt tt 22

<210> 75

<220>

<223> J6609正向引物

<400> 75

gagattatcg tgtcatggaa gc 22

<210> 76

<220>

<223> J6609反向引物

<400> 76

atctcaatca gcatttgttc cc 22

<210> 77

<220>

<223> J6610正向引物

<400> 77

tacctttcgt agcttatgtc gt 22

<210> 78

<220>

<223> J6610反向引物

<400> 78

aagtagagac attgccaaga ct 22

<210> 79

<220>

<223> J6617正向引物

<400> 79

gggcaatgga aagcatatta ca 22

<210> 80

<220>

<223> J6617反向引物

<400> 80

tagtcctatg aaaagacctg gc 22

<210> 81

<220>

<223> J6619正向引物

<400> 81

ctgtcctttt agtcaagaag aga 23

<210> 82

<220>

<223> J6619反向引物

<400> 82

caattttctt ctgcatttcg gta 23

<210> 83

<220>

<223> J6636正向引物

<400> 83

ctcagaacgg gttagtcgaa a 21

<210> 84

<220>

<223> J6636反向引物

<400> 84

tcattcctac tgtgttgggt t 21

<210> 85

<220>

<223> J6637正向引物

<400> 85

ctgattcgtg gaaactcaaa ga 22

<210> 86

<220>

<223> J6637反向引物

<400> 86

gatcaaacac acttacttgc ct 22

<210> 87

<220>

<223> J718正向引物

<400> 87

gcaaagctgt aaaagttgaa gta 23

<210> 88

<220>

<223> J718反向引物

<400> 88

aaccaaagta caactacact caa 23

<210> 89

<220>

<223> J720正向引物

<400> 89

atgttcccag atatatccag tct 23

<210> 90

<220>

<223> J720反向引物

<400> 90

tcttccctcc accattattc tat 23

<210> 91

<220>

<223> J722正向引物

<400> 91

tctgggaaga ctactctgtt ag 22

<210> 92

<220>

<223> J722反向引物

<400> 92

acaaaactca atgggtagtc ag 22

<210> 93

<220>

<223> J729正向引物

<400> 93

ctgagttctt tgagatgatg ct 22

<210> 94

<220>

<223> J729反向引物

<400> 94

aggaaaacag gaaacaatgt ct 22

<210> 95

<220>

<223> J731正向引物

<400> 95

gcataagtcc atctacattg acc 23

<210> 96

<220>

<223> J731反向引物

<400> 96

aaggacatct ctttccattt tcg 23

<210> 97

<220>

<223> J749正向引物

<400> 97

ttgaggaaat ttgatctgag gg 22

<210> 98

<220>

<223> J749反向引物

<400> 98

tgctaatcta attccggttc tg 22

<210> 99

<220>

<223> J813正向引物

<400> 99

ccacaagatt gaaagttaca tgg 23

<210> 100

<220>

<223> J813反向引物

<400> 100

ccaatcctta aacttccacc tat 23

<210> 101

<220>

<223> J819正向引物

<400> 101

ttgagtttgc tgatcttaga tgt 23

<210> 102

<220>

<223> J819反向引物

<400> 102

gaaaaccgag tacttcagaa cta 23

<210> 103

<220>

<223> J844正向引物

<400> 103

tcttggcttt tcaatatcta ggg 23

<210> 104

<220>

<223> J844反向引物

<400> 104

ataaaaggga ggatgtattg gtg 23

<210> 105

<220>

<223> J846正向引物

<400> 105

catgtaatgg attcgatgtt gc 22

<210> 106

<220>

<223> J846反向引物

<400> 106

ataggagcta aacaggcata ac 22

<210> 107

<220>

<223> J848正向引物

<400> 107

gtattgatga accagacgta ctt 23

<210> 108

<220>

<223> J848反向引物

<400> 108

cgacttcagg gatttatagt gtt 23

<210> 109

<220>

<223> J913正向引物

<400> 109

tctactcatt gcataaccca ttt 23

<210> 110

<220>

<223> J913反向引物

<400> 110

ctcgatgtct ctggtgattt tat 23

<210> 111

<220>

<223> J916正向引物

<400> 111

aaagactgaa aatccaaaca cg 22

<210> 112

<220>

<223> J916反向引物

<400> 112

tgatttgtgt gaaaagctaa cg 22

<210> 113

<220>

<223> J927正向引物

<400> 113

gtggaataga gagcggttta at 22

<210> 114

<220>

<223> J927反向引物

<400> 114

tgtctttctt tcgcttcact aa 22

<210> 115

<220>

<223> J929正向引物

<400> 115

catggtttgt tgacattctc ag 22

<210> 116

<220>

<223> J929反向引物

<400> 116

cggttcatat aggacattgg tt 22

<210> 117

<220>

<223> J935正向引物

<400> 117

ttcagataca atcgtaggca att 23

<210> 118

<220>

<223> J935反向引物

<400> 118

tgctgacact atgttattca ctt 23

<210> 119

<220>

<223> J936正向引物

<400> 119

gcaacaattg taactccttc att 23

<210> 120

<220>

<223> J936反向引物

<400> 120

gctatttcaa agaacactgg aag 23