一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法
阅读说明：本技术 一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法 (miRNAs related to highland barley stripe disease and mining method thereof ) 是由 姚晓华 吴昆仑 姚有华 王越 苏乐平 侯璐 白羿雄 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法,通过从青稞条纹病叶上分离纯化青稞条纹病菌株,构建实验室条纹病病原菌侵染体系,采集发病和未发病的幼叶,进行高通量测序(miRNA-seq),构建了青稞miRNA的数据库,通过与miRBase 22、PMRD、mRNA/EST和rRNAetc数据库进行比对,挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs。(The invention provides miRNAs related to highland barley stripe disease and an excavating method thereof, wherein a highland barley stripe disease strain is separated and purified from highland barley stripe disease leaves, a laboratory stripe disease pathogenic bacteria infection system is constructed, diseased and non-diseased young leaves are collected, high-throughput sequencing (miRNA-seq) is carried out, a highland barley miRNA database is constructed, and miRNAs related to highland barley stripe disease are excavated by comparing with miRBase22, PMRD, mRNA/EST and rRNAetc databases.)
技术领域
本发明涉及青稞条纹病，具体为一种与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法。
背景技术
青稞(Hordeum vulgare L.var.nudum)属禾本科大麦属，是大麦(Hordeumvulgare L.)的一个变种，遗传背景与大麦高度相似，因内外颖与颖果相分离，籽粒裸露，所以又被称为裸大麦。青稞是青藏高原最具特色的农作物，生产地位举足轻重。
青稞条纹病是影响青稞生产最严重的一种真菌病害(图1)。目前防止青稞条纹病的主要方法为药物浸种处理。但现有浸种药物如立克秀、粉锈宁、浸种灵等(有效成分分别为：戊唑醇、***酮、二硫氰基甲烷)会明显影响青稞发芽率，而且浸种温汤需要在技术指导下配制使用，在以藏族为主的广大青稞种植区难以普遍实现。加上高原地区生态环境脆弱，严控农药化肥，药物防治难以推行(***等，2016)。因此，抗病新品种选育是学界对青稞条纹病防控的普遍共识。
青稞条纹病的病原菌无性态为禾内脐蠕孢[Drechslera graminea(Rabenh.exSchl.)Shoemaker，异名Helminthosporium Rabenh.]，属半知菌亚门真菌；有性态为麦类核腔菌[Pyrenophora graminea(Rabenh.)Ito et Kurib.]，是子囊菌亚门的真菌(Gatti etal,1992；吴宽然等，2013)。
虽然青稞条纹病的病原确认已有多年，但是目前对于条纹病发病过程中病原与寄主之间相互作用的分子机制仍不清楚。学者们通过对具有抗与不抗条纹病大麦的品种进行杂交，并对杂种后代进行QTL(数量性状位点quantitative trait loci)分析，定位出三个与抗病相关的基因(QTL)Rdg1a、Rdg2a和Rdg3，分别位于2HL和7HS染色体上(Arru et al,2002；Arru et al,2003；张宇，2016)。对Rdg1a(Biselli et al,2010)和Rdg2a(Haegi etal,2008；Bulgarelli et al,2010)分别进行功能研究，表明过量表达这两个基因能够显著提高地中海品种大麦对条纹病菌株的抗性。但到目前为止，再未见到类似的大麦条纹病作用机制方面的研究报道(吴宽然等，2013)。可见，通过传统的基因定位的分析方法研究青稞条纹病时可能存在瓶颈，需要从新的角度去探索。
MicroRNA(miRNA)是一类21～24nt的非编码小分子RNA，在植物抵御病虫害过程中miRNA起着重要作用(Sun,2012；Chinen et al,2012；Rawat et al,2015)。然而，目前植物病害相关miRNA的报道主要来自拟南芥，在单子叶和麦谷类作物中研究相对较少。在青稞中目前还没有miRNA的报道，即使在大麦中也仅收录了71个miRNA。因此，与其他作物相比，研究青稞miRNA功能可供借鉴的参考信息较少。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法，挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs，为今后青稞抗条纹病基因的挖掘和抗病新品种的选育奠定理论基础。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种与青稞条纹病相关的miRNAs的挖掘方法，包括如下步骤：
步骤1，采集感染条纹病的青稞叶片；
步骤2，条纹病病原菌侵染体系的构建
步骤2.1，对感染条纹病的青稞叶片进行培养并分离获取青稞条纹病病原菌；
步骤2.2，用青稞条纹病病原菌侵染条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种的种子，然后进行培育；
步骤3，待步骤2.2中青稞叶片长出且感病后，采集条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种的感病和未感病叶片，分别提取总RNA，构建Small RNA文库，并进行miRNA高通量测序；
步骤4，条纹病相关miRNA挖掘
根据miRNA高通量测序结果，以青稞基因组为参考，通过与miRBase22、PMRD、mRNA/EST和rRNAetc数据库进行比对，分析条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种感病前后miRNA的差异，得出差异miRNAs，再通过表达量差异筛选出与青稞条纹病相关的miRNAs。
优选的，步骤1中，采集的感染条纹病的青稞叶片保存在-80度超低温冰箱中备用。
优选的，步骤2.1具体为；将感染条纹病的青稞叶片接种在培养基上，密封，22-25℃生化培养箱中培养，然后分离得到青稞条纹病病原菌。
进一步的，将感染条纹病的青稞叶片接种在培养基上之前进行如下处理：将感染条纹病的青稞叶片用水冲洗干净后，用75％酒精和2％次氯酸钠分别处理，然后用水冲洗，去除青稞叶片表面水分。
优选的，步骤2.2具体为；将分离的青稞条纹病菌接种到培养皿中，密封，22-25℃生化培养箱中培养，等到菌长满整个培养皿后，取条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种的种子，放在长满青稞条纹病菌的培养皿中，密封，在培养箱中侵染至种子发芽，之后将发芽的种子种在装有营养土的容器中，进行培育。
优选的，所述条纹病高感青稞品种为ZDM6006，条纹病高抗青稞品种为昆仑14号。
优选的，步骤3中，提取总RNA，构建Small RNA文库，并进行miRNA高通量测序具体是：
(1)Small RNA文库构建
分别提取条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种的感病和未感病叶片的总RNA，使用Small RNA Sample Pre Kit试剂盒构建Small RNA文库；
(2)miRNA高通量测序
Small RNA文库库检合格后进行miRNA高通量测序。
优选的，步骤4中，从差异miRNAs中筛选出与青稞条纹病相关的miR NAs具体为：从差异的倍数和校正后的显著水平两个指标进行评估，再通过比较条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种的感病组和未感病组结果，得出条纹病高感青稞品种和条纹病高抗青稞品种共同的差异miRNAs，即为与青稞条纹病相关的miRNAs。
与青稞条纹病相关的miRNAs，为hvu-novel-11或hvu-novel-91，hvu-novel-11的RNA序列如SEQ No:1所示，hvu-novel-91的RNA序列如SEQ No:2所示。
miRNAs在选育抗条纹病青稞新品种中的应用，miRNAs为hvu-miR168-5p或hvu-miR6198。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)研究思路的新颖：很多抗病基因受miRNA的调控，并以miRNA为媒介与其它基因发生联系。青稞miRNAs参考信息较少，与条纹病相关的miRNAs未见报道，本发明公开了一种青稞条纹病相关的miRNAs的挖掘方法，通过从青稞条纹病叶上分离纯化青稞条纹病菌株，构建实验室条纹病病原菌侵染体系，采集发病和未发病的幼叶，进行高通量测序(miRNA-seq)，构建了青稞miRNA的数据库，通过与miRBase 22、PMRD、mRNA/EST和rRNAetc数据库进行比对，挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs。
(2)研究方向的拓展：本发明发现了一系列与青稞条纹病相关的miRNAs。从miRNA调控病害发展入手研究植物发病和抗病机理是一个新的角度，因此与青稞条纹病相关的miRNAs的挖掘也可为青稞抗病新基因的发现奠定基础，也为后续青稞抗条纹病新品种的选育奠定一定的基础。
通过本发明的方法，挖掘出四个与青稞条纹病相关的miRNAs，分别为hvu-miR168-5p，hvu-miR6198，hvu-novel-11和hvu-novel-91。
附图说明
图1为大田和室内发病中期的青稞条纹病叶，(a)为大田发病中期的青稞单株；(b)中为大田发病中期的单株局部；(c)为实验室发病中期的正常和病叶。
图2为室内分离的青稞条纹病病原菌。
图3为纯化的青稞条纹病病原菌。
图4为青稞条纹病病原菌侵染15天的种子。
图5为室内侵染15d青稞叶片图。
图6为ZDM6006正常叶vs ZDM6006病叶和昆仑14正常叶vs昆仑14病叶火山图；ZN代表ZDM6006正常叶；ZS代表ZDM6006病叶；KL14N代表昆仑14正常叶；KL14S代表昆仑14病叶。
图7为差异miRNA韦恩图；ZN代表ZDM6006正常叶；ZS代表ZDM6006病叶；KL14N代表昆仑14正常叶；KL14S代表昆仑14病叶。
图8为不同品种相同差异miRNA的含量图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明青稞条纹病相关的miRNAs的挖掘方法，包括如下步骤：
①样品采集
实验材料为条纹病高抗青稞杂交品种昆仑14号和条纹病高感青稞品种ZDM6006，采取大田发病中期的青稞条纹病叶，保存在-80度超低温冰箱中，用于实验室条纹病病原菌侵染体系的构建。
②青稞条纹病病原菌分离
将青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006的感染条纹病的叶片用蒸馏水冲洗干净后，用消毒的剪刀剪取条纹病叶(5×5mm方块)，用75％酒精处理30s和2％次氯酸钠处理30s，然后用蒸馏水冲洗3次，重复3次。用滤纸吸干水分后接种在培养基上，每个培养皿约3-4块病叶，封口膜封口，22-25℃生化培养箱中培养7天取出培养皿。
③青稞条纹病病原菌的侵染
将分离的青稞条纹病菌，用打孔器打菌饼，用接种环把一个菌饼接种到新的培养皿中，封口膜封口，22-25℃生化培养箱中培养6-8天，等到菌长满整个培养皿。后取所需青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006的种子(挑选种子时，尽量选取籽粒饱满的种子)，用75％酒精处理1min，3次蒸馏水冲洗干净，用滤纸把水分吸干，放在桌子上晾一会，直到种子表面没有水分。将处理好的青稞种子放在长满青稞条纹病菌的培养基中封口膜密封，PDA培养基正放在超低温培养箱中浸染15天。之后将侵染的种子种在装有营养土的花盆中，放在人工气候培养箱中白天14h，20℃；黑夜10h，10℃，10天左右取两个品种感病前后叶片，提取其总RNA，并对其进行检测，合格后用于高通量测序。
④青稞small RNA文库构建
青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006的RNA检测合格后，使用Small RNA试剂盒构建文库，利用Small RNA的3’端羟基及5’端的完整磷酸基团的特性，以RNA为起始样品，直接将Small RNA两端加上接头，然后反转录合成cDNA。经PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目标DNA片段，切胶回收得到的即为青稞small RNA文库。后使用荧光定量仪进行初步定量，稀释文库浓度至1ng/μl，使用安捷伦2100生物分析仪对文库中***的片段大小进行检测，符合预期后，利用Q-PCR方法对文库有效浓度大于2nM进行准确定量，以保证文库质量。
⑤miRNA高通量测序及候选miRNA挖掘
青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006的Small RNA文库库检合格后进行miRNA高通量测序，根据miRNA高通量测序结果，以青稞基因组为参考，通过miRBase 22、PMRD、mRNA/EST、rRNAetc数据库进行比对，分析抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006感染前后miRNA的差异。不同品种的不同差异去除，相同差异作为研究的重点，不同品种感病前后相比，均增加或均较少的视为相同差异，一个品种增加、另一个品种减少的视为不同差异；以此为筛选标准挖掘出与青稞条纹病相关的miRNAs。
具体实施例：
(1)大田青稞条纹病调查与取样：
连续三年在青海省调查青稞条纹病的发病率，获得青稞条纹病抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006(表1)，对大田发病中期的感病和抗病青稞品种的感病和未感病的叶片进行采集，保存在-80度超低温冰箱中。
表1青海省主栽青稞品种及感病品种ZDM6006条纹病的发病率
(2)实验室条纹病病原菌侵染体系的构建
①青稞条纹病病原菌分离：将保存在-80度超低温冰箱中的大田发病中期的青稞条纹病叶蒸馏水冲洗干净后，剪取病斑5×5mm方块，用75％酒精处理30s和2％次氯酸钠处理30s，然后用蒸馏水冲洗3次，重复3次。用滤纸吸干水分后接种在PDA(Potato DextroseAgar)培养基上，配方见表2。每个培养皿约3-4块病组织，封口膜封口，22-25℃生化培养箱中培养，大约7天取出培养皿。分离的青稞条纹病病原菌如图2。
表2 PDA(Potato Dextrose Agar)培养基配方
注：马铃薯200g，加蒸馏水煮汁，四层纱布去残渣。
②青稞条纹病病原菌纯化：将室内分离的青稞条纹病病原菌，用打孔器打菌饼，用接种针把一个菌饼接种到新的培养皿中，封口膜封口，22-25℃生化培养箱中培养，待菌落长满整个培养皿(约6-8天)，得到纯化的青稞条纹病病原菌(图3)。
③青稞条纹病病原菌的侵染：取待侵染的种子，75％酒精处理1min，蒸馏水冲洗3次，后用滤纸将水分吸干，室温静置2h后点播于长满菌的PDA培养基中，再取同样一片长满条纹病菌的PDA培养基覆盖在种子上面，6℃低温培养箱中培养15天(图4)。用镊子轻取上层染满条纹病菌的PDA培养基，然后用镊子小心取发芽的种子，不要损伤根和芽，移栽到盛有营养土(蛭石：营养土＝1：1)的花盆中。将花盆置于人工气候培养箱中，白天14h，20℃，15000Lx；黑夜10h，10℃，温度55％。10-15天后青稞叶子开始陆续染病，15-20天取样(图5)，用于miRNA高通量测序。
(3)样品采集：取其发病中期的青稞条纹病叶和同一时期的未发病叶如图5，液氮速冻后，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司分别进行总RNA的提取。
(4)青稞small RNA文库构建及条纹病相关miRNA挖掘
青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006的总RNA检测合格后，使用Small RNA试剂盒构建Small RNA文库，进行miRNA-seq。以大麦基因组为参考(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-36/plants/fasta/hordeum_vulgare/dna/Hordeum_vulgare.Hv_IBSC_PGSB_v2.dna.toplevel.fa.gz)，通过miRBase 22、PMRD、mRNA/EST、rRNAetc数据库进行比对。通过对青稞抗病品种昆仑14号和感病品种ZDM6006感病前后miRNA数据分析，最终从Small RNA文库中鉴别出92个青稞的miRNAs，其中36个为已报道的miRNAs，另有56个为新发现的miRNAs(表3)。根据表达量差异显著性分析获得差异显著(P＜0.05)的miRNAs 35个，即差异miRNAs(表4)。
表3发现的92个已知和未知miRNAs
表4差异显著的35个miRNAs
(5)青稞条纹病相关差异miRNA的筛选
由火山图可见青稞感病ZDM6006和抗病品种昆仑14号感病前后差异miRNA的整体分布情况(图6)，从差异倍数和校正后的显著水平两个指标进行评估，利用比较组合ZDM6006正常叶vs ZDM6006病叶和昆仑14正常叶vs昆仑14病叶对差异miRNA进行筛选，其中ZDM6006正常叶vs ZDM6006病叶比较获得6个上调miRNAs、2个下调miRNAs；昆仑14正常叶vs昆仑14病叶比较获得10个上调miRNAs，10个下调miRNAs。再通过比较昆仑14号和ZDM6006的感病组和对照组(未感病组)结果，发现有4个共同的差异显著的miRNAs(P＜0.05)(图7)，其中2个已知的miRNA s，即hvu-miR168-5p和hvu-miR6198，2个未知的miRNAs，即hvu-novel-11和hvu-novel-91，其中hvu-novel-11和hvu-novel-91的RNA序列分别为SE Q No:1和SEQ No:2。
SEQ No:1：UCAGUGCGAUCCCUCUGGAAU；
SEQ No:2：AAUUAGACGGUCUAGAUUGCGAGU。
(6)4个差异miRNAs表达量
如图8，由高通量检测的miRNAs的表达量结果可知，感染条纹病后，ZDM6006和昆仑14中hvu-miR168-5p和hvu-miR6198表达量显著升高，而hvu-novel-11和hvu-novel-91表达量显著降低，可见这4个miRNAs在青稞条纹病过程中发挥重要的作用。
综合本发明的以上结果表明，以条纹病高抗青稞杂交品种昆仑14号和高感青稞品种ZDM6006为研究对象，对大田发病中期的青稞条纹病叶进行采集，实验室条件下进行条纹病病原菌侵染体系的构建。选取发病中期的青稞幼叶的中上部和同一时期没有发病的青稞幼叶送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司分别进行miRNA-seq，并将其测序结果进行比对结合数据库得以挖掘，筛选与青稞抗条纹病相关的4个miRNAs(hvu-miR168-5p，hvu-miR6198，hvu-novel-11和hvu-novel-91)，为后续miRNAs调控青稞抗条纹病机理的研究和新品种的选育奠定理论基础。
针对目前抗条纹病基因挖掘困难的现状，本发明运用一种高通量测序(miRNA-seq)技术来挖掘青稞抗条纹病相关miRNAs，从新的角度去探索青稞条纹病的防治，为今后青稞抗条纹病基因的挖掘和抗病新品种的选育奠定理论基础。
序列表
<110> 青海大学
<120> 与青稞条纹病相关的miRNAs及其挖掘方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum)
<400> 1
ucagugcgau cccucuggaa u 21
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 青稞(Hordeum vulgare L. var. nudum)
<400> 2
aauuagacgg ucuagauugc gagu 24