阅读说明：本技术 水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法 (Molecular marking method of rice multi-pistil gene LOC _ Os03g11630 ) 是由 梁永书 闫超 段文静 南文斌 秦小健 张汉马 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法,以多雌蕊水稻为基因供体构建F<Sub>2</Sub>遗传定位分离群体,以F<Sub>2</Sub>群体隐性单株为基因定位群体,借助SSR和InDel<Sup>#</Sup>标记进行PCR扩增,根据PCR扩增电泳结果,对水稻多雌蕊进行高密度连锁分析,获得了与之紧密连锁的基于PCR反应的2对特异PCR引物对L3-135和RM7576,2特异标记间物理距离为40.617Kb,与LOC_Os03g11630基因紧密连锁。当标记L3-135和RM7576能单独或者同时扩增250bp和206bp大小的片段,则该水稻材料携带多雌蕊基因LOC_Os03g11630,并由此获得该多雌蕊基因。本发明用于检测、筛选水稻多雌蕊基因,为水稻遗传机理解析提供基因资源,挖掘与新创优异水稻资源,支持超高产水稻新品种的培育。(Molecular marking method of rice multi-pistil gene LOC _ Os03g11630, and F is constructed by using multi-pistil rice as gene donor 2 Genetically mapping the segregating population with F 2 Recessive individual plant of the population is a gene-located population by virtue of SSR and InDel # The markers are subjected to PCR amplification, and high-density linkage analysis is carried out on the rice pistils according to the PCR amplification electrophoresis result, so that 2 pairs of specific PCR primer pairs L3-135 and RM7576 which are closely linked with the markers and are based on PCR reaction are obtained, the physical distance between the 2 specific markers is 40.617Kb, and the markers are closely linked with the LOC _ Os03g11630 gene. When the markers L3-135 and RM7576 can amplify fragments of 250bp and 206bp separately or simultaneously, the rice material carries multiple pistil genes LOC _ Os03g11630, and the multiple pistil genes LOC _ Os03g11630 are obtained from the rice materialObtaining the multiple pistil gene. The invention is used for detecting and screening the rice multi-pistil gene, provides gene resources for analyzing the rice genetic mechanism, excavates and creats new excellent different rice resources, and supports the cultivation of new varieties of ultrahigh-yield rice.)

水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法

技术领域

本发明涉及一种控制水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法，属于水稻优异基因资源挖掘和分子遗传学领域。

背景技术

水稻是世界上最重要的第一大粮食作物，全球半数以上人口以稻米为主食，特别在保障我国可持续的粮食供给中其扮演着重要角色。回顾我国建国以来水稻遗传育种的研发历程，每个优质高产新品种的成功培育和每篇世界顶级杂志所刊发水稻相关论文都离不开水稻优异种质资源的挖掘与特异基因的创新利用。因此，不断挖掘与创新利用优异水稻资源是超高产水稻新品种培育必不可缺的重要环节,更是丰富和发展水稻遗传基础理论研究的源动力。花器官是水稻完成整个生活史中必不可缺的器官，其发育正常与否直接决定着稻谷产量和品质的形成。鉴定影响水稻花器官数目和结构变异的相关基因，为进一步研究水稻花发育的分子机制，为提高水稻产量、品质及挖掘水稻潜在的种质资源奠定基础。

分子遗传学研究表明，水稻花器官变异基因属于单基因控制的质量性状。随着基因定位克隆技术的广泛应用，图位克隆技术是从水稻种质资源中定位克隆控制重要农艺性状QTL/基因最有效的手段之一。利用SSR，InDel，Caps等标记技术及不同变异来源的水稻花器官突变资源，综合运用经典遗传学、分子生物学、基因工程学及育种学等多学科交叉的基础理论技术体系鉴定出大量水稻花器官突变基因，从一定程度上促进了人们对水稻花器官遗传突变机制的理解。但是，由于之前的研究选用不同类型的花器官突变材料为基因供体，筛选鉴定目标基因的遗传差异较大，基因的遗传多样性丰富，特别是目前鉴定的花器官数目和结构突变基因在染色体上的物理位置分布存在较大差异。迄今为止，控制水稻花器官数量和形态结构变异的相关基因都有报道，并精细定位和克隆了部分花器官突变基因，这些基因位于水稻不同染色体上。目前，还有很多水稻多雌蕊相关基因未被发掘。本申请人从“热粳35/协青早B”F₂遗传分离群体中筛选到1份花器官突变材料，经过海南和重庆两地连续多代自交遗传分离纯化后、花器官突变体田间表型稳定且不受环境影响，在扬花期该突变材料表现为6枚雄蕊正常，花药花丝发育正常，雌蕊突变表现为2或3个子房，成熟期受精结实形成完整的2或3颗谷粒，成熟种子萌发成连体双苗，暂命名为多雌蕊172。申请人以多雌蕊172作为基因供体，构建“02428/多雌蕊172”杂交组合获得F₀杂交种子，种植F₀杂交种子获得F₁植株，F₁植株自交获得F₂遗传定位群体种子，采用图位定位克隆策略将多雌蕊基因定位在第3染色体短臂上L3-135-RM7576区间，2对特异PCR标记间物理距离40.617Kb，2对特异PCR标记与多雌蕊基因LOC_Os03g11630存在紧密连锁关系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一个全新的影响水稻雌蕊数目变化的新基因。并提供了多雌蕊突变基因的分子标记方法和检测方法。

本发明水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法的技术方案为：以多雌蕊水稻为基因供体构建F2遗传定位分离群体，以F2群体隐性单株为基因定位群体，借助SSR和InDel#标记进行PCR扩增，根据PCR扩增电泳结果，对水稻多雌蕊进行高密度连锁分析，并获得了与之紧密连锁的基于PCR反应的2对特异PCR引物对L3-135(SEQ ID NO：1、2)和RM7576(SEQ ID NO：3、4)，2特异标记间物理距离为40.617Kb，与LOC_Os03g11630基因紧密连锁。

本发明用2对特异的PCR标记L3-135(SEQ ID NO：1、2)和RM7576(SEQ ID NO：3、4)，PCR扩增待检测水稻基因组DNA，如果标记L3-135和RM7576能单独或者同时扩增250bp和206bp大小的片段，则该水稻材料带有多雌蕊基因LOC_Os03g11630。

本发明的水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法或判断水稻是否含有水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的方法在水稻花器官突变选择中应用。

本发明的水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630位于水稻第3染色体短臂上的1个与水稻子房数目突变相关基因位点，该基因能控制水稻雌蕊数目多少。

本发明利用申请人创制的水稻多雌蕊突变体材料为基因供体，该突变体材料来源于“热粳35/协青早B”杂交组合F2遗传分离群体。这是在水稻抽穗扬花期，大量田间表型鉴定获得1份多雌蕊突变材料，命名为多雌蕊172，本发明以多雌蕊172为基因供体材料。

与现有水稻花器官突变基因相比，本发明具有以下特点：

1、基因LOC_Os03g11630是利用籼粳交组合后代群体筛选获得多雌蕊突变体为基因供体材料，通过基因图位克隆技术分析，检测到一个新基因。该基因与水稻多雌蕊的形成相关。

2、基因LOC_Os03g11630定位在第3染色体短臂上，与现已报道水稻花器官突变基因不存在染色体共线性重叠，为一个全新基因。本发明的新基因可为水稻花器官遗传机理解析提供基因资源。

附图说明

图1为多雌蕊172田间表型；a.扬花期表现多雌蕊；b-c.成熟期形成完整的2或3颗谷粒；d.成熟种子萌发连体双苗。

图2为多雌蕊基因LOC_Os03g11630紧密连锁标记L3-135，第1泳道为Marker带型；第2泳道为父本多雌蕊172带型；第3泳道为母本02428；第1、2、3……….20、21、22泳道为“02428/多雌蕊172”构建F2隐性群体单株电泳带型。

图3为多雌蕊基因LOC_Os03g11630紧密连锁标记RM7576，第1泳道为父本多雌蕊172带型；第2泳道为母本02428，第3泳道为Marker带型；第1、2、3……….20、21、22泳道为“02428/多雌蕊172”F2隐性群体单株电泳带型。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。

(一)控制水稻多雌蕊新基因的初步定位

1.供试材料

多雌蕊172来源于“热粳35/协青早B”F2遗传分离群体，田间表现如图1所示，在水稻抽穗扬花期该突变材料表现为6枚雄蕊正常，花药花丝发育正常，雌蕊突变表现为2或3个子房(图1-a)，蜡熟成熟期受精结实形成完整的2或3粒稻谷(图1-b,c)，成熟种子萌发成连体双苗(图1-d)，暂命名为多雌蕊172。

以“02428/多雌蕊172”构建的F2遗传群体为主要研究材料。其构建过程如下：将配制“02428/多雌蕊172”杂交组合获得F0种子，F1植株雌蕊发育正常，多雌蕊性状呈隐性遗传表现。海南陵水县种植F0种子，F1植株自交获得F2群体种子，在重庆正季种植5000个F2单株，调查F2单株单雌蕊(正常)和多雌蕊(突变)符合3:1孟德尔遗传分离比例，多雌蕊基因受1对隐性单基因控制，适用于基因图位克隆策略开展研究。所述02428为江苏省农科院选育的矮秆广亲和粳稻，为云南地方粳稻螃蟹谷的辐射后代与上海地方粳稻吉邦谷辐射后代杂交选育而成，对籼、粳具有广亲和性。

2.DNA提取、PCR扩增及8％凝胶电泳

2.1DNA提取采用SDS法，对F2隐性单株提取全基因组DNA。具体步骤如下：

1)取4cm左右叶片加入研钵，在液氮中磨成粉末状至1.5ml离心管中。

2)加入65℃预热的提取液600-800ul，混匀后于65℃水浴锅中保温20-30分钟，其间上下颠倒3次。

3)从水浴中取出离心管，加入200ul 5mMKAC溶液混匀，冰浴20-30分钟。

4)每管加入24：1的氯仿/异戊醇600ul，上下颠倒数次至下层液相呈深绿色10000rpm离心10分钟。

5)取上清液置另1个1.5ml离心管中，加入1.5倍体积的冰冻乙醇缓慢混匀，室温静置15分钟，10000rpm离心5分钟。

6)吸取上清液，用70％乙醇洗涤2次，然后用无水乙醇脱水，自然风干。

7)加入400ul ddH₂O，-20℃冰箱保存备用。

2.2 PCR扩增

根据参考图谱，选取均匀分布在全基因组的159对双亲间有多态的SSR引物。随机选取22个F2隐性单株的基因组DNA进行聚合酶链式(PCR)反应。

1)PCR反应体系总体积20ul，各成分如表1所示

表1 20ul PCR反应体系各成分

试剂和模板	使用量
		模板DNA	2μl
10×PCR buffer with Mg<sup>2+</sup>	2μl
		Primer F(10μM)	1μl
Primer R(10μM)	1μl
		dNTP	1μl
Taq酶	0.1μl
		ddH<sub>2</sub>O	12.9ul
Total	20ul

2)PCR反应程序为：

1)94℃预变性3min

2)94℃变性30s

3)56℃退火30s

4)72℃延伸1min

从步骤2到步骤4共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应在美国Bio-rad伯乐T100型梯度PCR仪上运行。

2.3 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

8％聚丙烯酰胺凝胶工作液配方见表2，PCR扩增产物用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，具体步骤如下：

1)将配置好的凝胶灌注到两个玻璃板之间，注满后，立刻插入梳子到胶室(以免胶凝固)，放平槽子，室温静置30min或以上直至胶完全聚合。

2)待胶完全凝固后，在电泳槽中加入1×TBE缓冲液，小心平行拔出梳子。

3)在PCR反应产物10μl中加3μl溴酚蓝指示剂混匀，用微量进液器每管取3ul点样。

4)200V恒压电泳1.5h。

表2 8％聚丙烯酰胺凝胶工作液

成分	使用量
		10×TBE(ml)	10
40％丙烯酰胺(ml)	20
		灭菌水(ml)	69
过硫酸铵(μl)	900
		TEMED(μl)	100
Total(ml)	100

3初步定位

用多态性标记对“02428/多雌蕊172”构建的F2隐性单株小群体进行连锁分析，参考双亲PCR扩增条带，倘若22个隐性单株有14个单株带型与隐性亲本带型一致，说明该标记与隐性亲本存在连锁关系。第3染色体短臂上标记RM3467扩增22个隐性单株有17个单株带型与多雌蕊172一致，水稻多雌蕊基因与第3染色体上的标记RM3467存在连锁关系，多雌蕊基因初步定位在第3染色体短臂上。

(二)控制水稻多雌蕊新基因的精细定位

1.供试材料

多雌蕊172来源于“热粳35/协青早B”F2遗传分离群体(图1)，在水稻抽穗扬花期该突变材料表现为雄蕊正常表现，6枚雄蕊，花药花丝发育正常，雌蕊突变表现为2或3个子房(图1-a)，蜡熟成熟期受精结实形成完整的2或3粒稻谷(图1-b,c)，成熟种子萌发成连体双苗(图1-d)，暂命名为多雌蕊172。

2.精细定位方法

2.1引物开发

根据Gramene网站上公布的SSR引物以及生物信息学比对已测序的粳稻品种日本晴、籼稻品种9311和协青早B在这一区间的序列差异，进一步设计SSR和InDel#引物扩增双亲，筛选获得多态性分子标记用于精细定位。

2.2精细定位方法及紧密连锁分子标记的获得

同样利用“02428/多雌蕊172”构建的F2遗传群体，进一步扩大定位群体隐性单株数量至364个，利用目标染色体区段开发的引物筛选该目标染色体区间段的交换单株，从而构建目标区间高密度的遗传物理图谱，最终将多雌蕊基因精细定位在L3-135-RM7576标记区间(图2、3)，用2对特异的PCR引物L3-135(SEQ ID NO：1、2)和RM7576(SEQ ID NO：3、4)，标记L3-135和RM7576分别扩增250bp和206bp大小的片段，标记L3-135参考日本晴基因组物理位置6048599bp、标记RM7576参考日本晴基因组物理位置6079216bp,2对特异PCR标记区间物理距离为40.617Kb，标记L3-135(6048599bp)仅1个杂合单株(单株号39#)，标记RM7576(6079216bp)有1个杂合单株(单株号137#)。充分说明水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630精细定位在标记RM7576和L3-135间，由此获得与LOC_Os03g11630紧密连锁的分子标记，并只扩增出带有来自多雌蕊172基因型的片段。

(三)多雌蕊候选基因鉴定

借助水稻多雌蕊新基因精细定位的标记L3-135和RM7576标记物理位置信息，从(http://ensembl.gramene.org/Oryza_sativa/Location/View？r＝3:6801225-6812449；db＝core)数据库中仅筛选到一个1个候选基因LOC_Os03g11630，进一步分析发现，从MSURice Genome Annotation Project数据库获的基因LOC_Os03g11630的DNA序列长度为2547bp，预测蛋白质848AA，为转座子蛋白。

本发明水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630精细定位标记交换单株基因型相关染色体、标记、基因型、物理位置等信息列示于表3。标记RM5444(5591402bp)有13个杂合单株，标记L3-118(6012517bp)有5个杂合单株，标记L3-135(6048599bp)仅1个杂合单株(单株号39#)。标记L3-52(6812449bp)有14个杂合单株，标记L3-97(66239662bp)有3个杂合单株，标记RM7576(6079216bp)有1个杂合单株(单株号137#)。充分说明水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630精细定位在标记RM7576和L3-135间，2特异标记间物理距离为40.617kb。

表3 水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630精细定位标记交换单株基因型

染色体	3	3	3	3	3	3	3	3	3	3
											标记	RM5444	RM3467	L3-118	L3-132	L3-135	RM7576	L3-95	L3-97	L3-101	L3-52
物理位置(bp)	5591402	6003496	6012517	6043090	6048599	6079216	6127475	6239662	6240244	6812449
											11	1	1	1	1	1	1	H	H	H	H
14	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1
											18	H	H	H	1	1	1	1	1	1	1
20	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											30	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
39	H	H	H	H	H	1	1	1	1	1
											46	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
71	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											105	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1
137	1	1	1	1	1	H	H	H	H	H
											139	H	1	1	1	1	1	1	H	H	H
145	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											151	H	H	H	1	1	1	1	1	1	1
157	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											176	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1
207	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											231	H	H	H	1	1	1	1	1	1	1
235	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											245	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
275	H	H	H	1	1	1	1	1	1	1
											296	1	1	1	1	1	1	1	1	1	H
329	H	1	1	1	1	1	1	1	1	H
											348	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
349	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
											356	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1
359	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1
											362	H	1	1	1	1	1	1	1	1	1

注：1：多雌蕊172基因型；H：杂合基因型；物理位置(bp)：参考晴基因组序列。

本发明水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630紧密连锁标记信息列示于表4。标记L3-135信息在日本晴基因组位置为6048599bp；SEQ ID NO：1和2序列长度均为22bp，PCR扩增产物250bp，退火温度分别为59.3和59.0℃，为日本晴和93-11插入缺失(InDel#)引物。标记RM7576信息在日本晴基因组位置为6079216bp；SEQ ID NO：3和4序列长度均为21bp，PCR扩增产物206bp，退火温度分别为59.1和60.2℃，为SSR引物，重复基元为(GCA)10。

表4 水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630紧密连锁标记信息

物理位置(bp)：参考日本晴基因组序列。

序列表

<110> 重庆师范大学

<120> 水稻多雌蕊基因LOC_Os03g11630的分子标记方法

<130> 1

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cggagcttct gttcatgtgt c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gactgcttct tgtacgacga c 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgccctgcc ttttgtacac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgagcattc tttcttccac 20