阅读说明：本技术 德卡林碱与水杨酸的组合物及其在制备抗炎药物中的应用 (Composition of dacrine and salicylic acid and application thereof in preparing anti-inflammatory drugs ) 是由 宋启示 贡潘偏抽 周兰 范青飞 纳智 和文倩 黄凤梅 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及德卡林碱与水杨酸的组合物及其在制备抗炎,尤其是抗炎性肠病药物中的应用。本发明研究发现德卡林碱与水杨酸联合使用,可显著抑制LPS诱导THP-1细胞对促炎因子IL-1β、TNFα的表达,也可显著抑制IL-1β、TNFα诱导的结肠内皮细胞Caco-2表达促炎因子IL-6、IL-8,二者混合使用时,其抑制作用明显优于德卡林碱、水杨酸单独使用的效果。在DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型中二者联合使用可显著降低溃疡性结肠炎相关疾病指数。(The invention relates to a composition of dacrine and salicylic acid and application thereof in preparing anti-inflammatory drugs, in particular to anti-inflammatory bowel disease drugs. The research of the invention finds that the combined use of the dacrine and the salicylic acid can obviously inhibit the expression of proinflammatory factors IL-1 beta and TNF alpha induced by THP-1 cells by LPS, and also can obviously inhibit the expression of the proinflammatory factors IL-6 and IL-8 by colon endothelial cells Caco-2 induced by the IL-1 beta and the TNF alpha, and when the two are used in a mixed way, the inhibition effect of the dacrine and the salicylic acid is obviously better than the effect of the single use of the dacrine and the salicylic acid. The combined use of the two in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model significantly reduced the ulcerative colitis-associated disease index.)

德卡林碱与水杨酸的组合物及其在制备抗炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及德卡林碱与水杨酸的组合物及其用途，尤其涉及德卡林碱与水杨酸混合制剂作为主要活性成分在制备抗炎及治疗炎性肠病方面的用途。

背景技术

炎症是组织应对损伤或外部病原体感染的重要防御性反应，是损伤、抗损伤和修复的统一过程，炎症细胞(如内皮细胞、中性粒细胞、以单核细胞为代表的白细胞)及其释放的促炎因子IL-6、IL-8、TNFα、IL-1β等在抵御机体侵害时扮演重要角色。在正常情况下炎性因素消除后炎症反应将会终结，而当低强度或持续的刺激导致组织长期过度反应时，炎症无法从抗损伤状态归于消退，导致炎症反应持续进行。受损部位炎症细胞的招募不可控，促炎因子过度分泌将会引发一系列疾病，如炎性肠病、类风湿性关节炎、阿尔兹海默症等。有效抑制炎症细胞对促炎因子的释放是防治不可控炎症及相关疾病的重要手段。本发明发现德卡林碱和水杨酸组合物可有效抑制单核细胞及结肠内皮细胞促炎因子的释放。

炎性肠病是一类病因尚不明确且反复发作的慢性肠道疾病，包括溃疡性结肠炎UC(Ulcerative Colitis，UC)及克罗恩病CD(Crohn's disease,CD)。其病因主要包括遗传、环境、感染和免疫因素，发病过程可以概括为遗传易感者被环境因素所影响，肠道菌群介入其中，引发了反复发作、难以扭转的肠道获得性免疫及天然免疫反应，最终导致肠黏膜屏障损伤，溃疡经久不愈及炎症增生等病变。炎性肠病的病患主要集中于中青年人群且发病率在全球范围内呈升高趋势，正严重危害人类健康，增加社会经济负担且影响社会生产。目前常用药物如氨基水杨酸各种制剂、皮质激素类制剂、抗菌药物存在不同程度的毒副作用、依赖性、药效存在个体差异等各种问题。因此寻找有效的炎性肠病治疗药物仍然是目前该领域的研究热点及首要任务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗炎的组合物及其在制备抗炎药物、尤其是抗炎性肠病的应用。

本发明的技术方案如下：

一种组合物由德卡林碱和水杨酸组成。

进一步，所述的组合物，以质量分数计，德卡林碱为0.5～99.5％，水杨酸为0.5～99.5％。

进一步，所述的组合物，以质量分数计，德卡林碱为22.4～94.9％，水杨酸为5.1～77.6％。

进一步，所述的组合物，以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％。

本发明还提供上述任一组合物在制备抗炎药物中的应用。

进一步，在所述的应用中，所述抗炎药物为抗炎性肠病药物。

进一步，在所述的应用中，所制备的抗炎药物中所述的组合物的含量为0.1～99％质量分数，其余为药学上可接受的辅料。

进一步，在所述的应用中，所制备的抗炎药物中所述的组合物的含量为0.5～90％质量分数，其余为药学上可接受的辅料。

进一步，在所述的应用中，所述制备的抗炎药物为药学上可接受的任何制剂。

经过多次独立重复试验，本发明发现在两种细胞模型(THP-1、Caco-2)中由德卡林碱和水杨酸组成的组合物在1:1摩尔浓度比(分别是15μM德卡林碱+15μM水杨酸，30μM德卡林碱+30μM水杨酸)比例下可显著降低促炎因子的表达，其抑制作用显著优于德卡林碱或水杨酸单独使用时的效果。进一步研究发现该组合物能显著改善UC小鼠溃疡性结肠炎相关症状。

如所述的应用，由德卡林碱和水杨酸组成的组合物可显著抑制多种重要促炎因子的表达，其抑制作用显著优于二者分别使用的效果。本研究发现由德卡林碱和水杨酸的组合物可抑制人源单核细胞THP-1及结肠内皮细胞Caco-2对多个促炎因子(IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8)的表达，当二者比例为1:1(摩尔浓度比)时抑制效果最佳。体内研究表明该组合物在灌胃给药德卡林碱100mg/kg+水杨酸43mg/kg时可明显改善DSS诱导的UC小鼠腹泻、便血等症状，有效维持结肠黏膜组织的完整，达到治疗和预防炎性肠病的目的。其治疗效果显著优于现常用治疗UC药物柳氮磺吡啶(150mg/kg)，可以用于制备口服抗炎及治疗炎性肠病的药物。

本发明组合物用作药物时，可以直接作为药物组合物使用也可以与其他药物组成复方的形式使用，本发明组合物在复方中含有0.1～99％质量分数，优选为0.5～90％质量分数，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的药物制剂常用的药用载体和/或赋形剂。将本发明组合物或药物组合物以单位体重服用量的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成药物学上可接受的任何制剂，包括但不限于固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等)或液体制剂(注射剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂等)。本发明的组合物或药物组合物可经口服和注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射等)形式给药。

附图说明

图1A至图1F：德卡林碱和水杨酸组成的组合物抑制促炎因子IL6/8在Caco-2细胞中的表达。其中，图1A：IL-6浓度检测，30μM德卡林碱与30μM水杨酸的组合物(Decarine+Salicylic acid)(德卡林碱∶水杨酸的摩尔浓度1:1，以质量分数计：德卡林碱为69.8％，水杨酸为30.2％)处理Caco-2细胞24小时，用ELISA试剂盒检测各实验组细胞上清中IL-6的浓度。图1B：MTS检测图1A中各实验孔细胞活力。图1C至图1F：不同比例的德卡林碱和水杨酸的组合物对IL-6、IL-8的抑制活性检测。30μM德卡林碱添加不同比例的水杨酸(水杨酸浓度3.75-240μM，德卡林碱∶水杨酸的摩尔浓度比8:1-1:8，以质量分数计，德卡林碱22.4％～94.9％；水杨酸5.1％～-77.6％)。各比例组合物处理Caco-2 24小时后检测各个实验组细胞培养基上清中IL-6、IL-8的浓度。T检验，误差线为标准误，n＝3。与IL-1β+TNFα组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与decarine组比较，^##P<0.01，^###P<0.001，NS表示无统计学差异。

图2A至图2C：德卡林碱和水杨酸的组合物抑制促炎因子IL-1β、TNFα的表达。

其中，图2A-图2B：THP-1细胞培养基上清中的IL-1β、TNFα浓度检测，德卡林碱和水杨酸的组合物(德卡林碱∶水杨酸的摩尔浓度1:1，以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％)处理THP-1 24小时后，ELISA试剂盒检测其上清中IL-1β、TNFα浓度。DXMS为阳性对照***。图2C：MTS检测图2A、图2B中各实验孔细胞活力。与LPS组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001；与decarine组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

图3A至图3C：德卡林碱与水杨酸的组合物改善UC小鼠模型溃疡性结肠炎相关症状。其中，图3A：Blank空白对照组、DSS诱导的模型组及各实验组小鼠溃疡性结肠炎疾病指数，DSS+SASP为阳性药物组。图3B：图3A中各组实验小鼠结肠长度比较。图3C：各组实验小鼠结肠中段组织切片结果。T检验，误差线为标准误，n＝3-5，与blank组比较，^***P<0.001，NS表示无统计学差异。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但并不以此来限定本发明。各实施例中无特殊说明的为常规方法，各实施例中所用的试剂、药品均为市售。

德卡林碱(英文名称：Decarine)，CAS：54354-62-0，分子量：319.3，外观：黄色粉末，溶于DMSO。

水杨酸(英文名称：Salicylic acid)，CAS：69-72-7，分子量：138.12，外观：结晶性粉末，白色，溶于乙醇、氯仿、DMSO等。

以下组合物由德卡林碱和水杨酸组成。

实施例1德卡林碱与水杨酸的组合物抑制Caco-2细胞表达促炎因子IL-6、IL-8

试剂配制：

从Peprotech公司购买10μg TNFα、加入200μl含5％海藻糖的PBS溶解，TNFα浓度为50μg/ml。

从Peprotech公司购买10μg IL-1β，加入400μl含5％海藻糖的PBS溶解，IL-1β浓度为25μg/ml。

称取5mg德卡林碱，加入261μl DMSO配制成60mM德卡林碱溶液。

称取2.5mg水杨酸，加入302μl DMSO配制成60mM水杨酸溶液。

试剂稀释：

将细胞因子TNFα、IL-1β按1:1000稀释于所需体积的培养基中，如1ml DMEM培养基中加入1μl TNFα(50μg/ml)和1μl IL-1β(25μg/ml)溶液，配制含终浓度为50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基。

将德卡林碱、水杨酸溶液按1:2000稀释于含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基中。如1ml含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基中加入0.5μl 60mM德卡林碱溶液和0.5μl 60mM水杨酸溶液配制成含德卡林碱30μM+水杨酸30μM+50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基(其中，组合物中德卡林碱30μM∶水杨酸30μM的摩尔浓度比为1:1，以质量分数计，德卡林碱为69.8％，水杨酸为30.2％)，其余比列的组合物以此类推。如1ml含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基中分别加入0.5μl 60mM德卡林碱溶液或0.5μl 60mM水杨酸溶液配制成单独含德卡林碱的、单独含水杨酸的培养基。即含德卡林碱30μM+50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基、或含水杨酸30μM+50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β的DMEM培养基。

1.1德卡林碱与水杨酸的组合物抑制Caco-2细胞表达促炎因子IL-6

实验分组如下：

模型组(TNFα+IL-1β)：DMEM培养基含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β。

空白对照组(Blank)：DMEM培养基不含TNFα、IL-1β。

德卡林碱30μM组(Decarine 30μM)：DMEM培养基含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β+30μM德卡林碱。

水杨酸30μM组(Salicylic acid 30μM)：DMEM培养基含50ng/ml TNFα+25ng/mlIL-1β+30μM水杨酸。

德卡林碱30μM+水杨酸30μM组(Decarine+Salicylic acid)：DMEM培养基含50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β+30μM德卡林碱+30μM水杨酸。

50ng/ml TNFα+25ng/ml IL-1β诱导Caco-2细胞，同时以30μM的德卡林碱+30μM水杨酸组合物(以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％)孵育24小时，收集细胞上清。按Human IL-6ELISA Kit试剂盒操作说明检测培养基上清IL-6的浓度(Human IL-6ELISA Kit达科为)。结果显示：德卡林碱水杨酸组合物能显著抑制Caco-2细胞对促炎因子IL-6表达，其抑制作用显著优于二者分别使用时的效果(图1A，图1B)。

1.2德卡林碱和水杨酸的摩尔浓度比例为1:1时其抑制IL-6、IL-8的效果最佳。

30μM德卡林碱添加浓度梯度水杨酸，配制成不同摩尔浓度比例的组合物(德卡林碱∶水杨酸的摩尔浓度比8:1-1:8，以质量分数计，德卡林碱22.4％-94.9％；水杨酸5.1％-77.6％)。

以50ng/ml TNFα及25ng/ml IL-1β(Peprotech公司)诱导Caco-2细胞，同时以不同浓度比例的组合物处理Caco-2细胞，24小时后检测各个实验组细胞培养基上清中IL-6、IL-8的浓度(Human IL-6ELISA Kit、Human IL-8ELISA Kit达科为)，结果显示当组合物中两个组分的摩尔浓度比例为1:1(以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％)时其对IL-6、IL-8的抑制效果最佳(图1C-图1F)。

实施例2德卡林碱与水杨酸的组合物有效抑制THP-1细胞表达促炎因子TNFα、IL-1β

试剂配制：

从Sigma公司购买10mg LPS，用PBS溶解至5mg/ml。

称取2.5mg德卡林碱，加入261μl DMSO配制成30mM德卡林碱溶液。

称取1.25mg水杨酸，加入302μl DMSO配制成30mM水杨酸溶液。

试剂稀释：

将LPS按1:5000稀释于所需体积的培养基中。如5ml 1640培养基中加入1μl LPS(5mg/ml)溶液，配制含终浓度为1μg/ml LPS的1640培养基。

将上述德卡林碱溶液与水杨酸溶液按1:2000稀释于含1μg/ml LPS的1640培养基中。如1ml含1μg/ml LPS的1640培养基中加入0.5μl 30mM德卡林碱溶液和0.5μl 30mM水杨酸溶液配制成含组合物德卡林碱15μM和水杨酸15μM(组合物中德卡林碱15μM∶水杨酸15μM的摩尔浓度比为1:1，以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸30.2％)的1640培养基即含1μg/ml LPS+德卡林碱15μM+水杨酸15μM的1640培养基。

如1ml含1μg/ml LPS的1640培养基中分别加入0.5μl 30mM德卡林碱溶液或0.5μl30mM水杨酸溶液配制成单独含德卡林碱、单独含水杨酸的培养基，即含德卡林碱15μM+1μg/ml LPS的1640培养基或含水杨酸15μM+1μg/ml LPS的1640培养基。

实验分组如下：

模型组(LPS)：含100ng/ml LPS的1640培养基。

空白对照组(Blank)：1640培养基不含LPS。

阳性对照DXMS组(DXMS10μM)：含100ng/ml LPS+10μM***的1640培养基。

德卡林碱15μM组(Decarine 15μM)：含100ng/ml LPS+15μM德卡林碱的1640培养基。

水杨酸15μM组(Salicylic acid 15μM)：含100ng/ml LPS+15μM水杨酸的1640培养基。

德卡林碱15μM+水杨酸15μM组(Decarine+Salicylic acid)：含100ng/ml LPS+15μM德卡林碱+15μM水杨酸的1640培养基。

脂多糖LPS(lipopolysaccharide，LPS)，以含100ng/ml LPS的培养基诱导THP-1细胞，同时用如上各实验组样品孵育细胞24小时，收集培养基上清。按试剂盒操作说明检测上清中TNFα和IL-1β的浓度(Human IL-1βELISA Kit和Human TNFαELISA Kit达科为)。结果显示德卡林碱和水杨酸组合物可显著抑制THP-1细胞对促炎因子TNFα和IL-1β的表达，且二者联合使用时其抑制作用显著优于德卡林碱单独使用时的效果，组合物中德卡林碱和水杨酸两个组分的摩尔浓度比例为1:1(以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％)(图2A-图2C)。

实施例3德卡林碱和水杨酸组合物对DSS诱导的UC小鼠有良好的治疗作用

试剂配制：

称取10g DSS加入400ml灭菌ddH₂O，配制成2.5％的DSS溶液。

称取120mg德卡林碱，溶解于6ml 0.5％羧甲基纤维素钠溶液，配制20mg/ml的德卡林碱溶液。

称取52mg水杨酸溶解于6ml 0.5％羧甲基纤维素钠溶液，配制8.7mg/ml的水杨酸溶液。

称取120mg德卡林碱和52mg水杨酸同时溶解于6ml的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，配制组合物溶液。

健康雄性C57BL/6小鼠(维通利华)随机分成空白组(blank)、模型对照组(2.5％DSS)、德卡林碱(2.5％DSS+100mg/kg decarine)、水杨酸组(2.5％DSS+43mg/kg Salicylicacid)、组合物处理组(2.5％DSS+100mg/kg decarine+43mg/kg Salicylic acid)、柳氮磺吡啶阳性对照组(2.5％DSS+150mg/kg SASP)，除空白组外其余各实验组小鼠均用2.5％DSS(2.5％质量分数)及相应待测物处理，给药方式为灌胃给药(各组实验给药容积为5ml/kg)。空白组动物用不含DSS的饮用水喂养，空白组及模型对照组用生理盐水灌胃处理。

研究结果表明，德卡林碱和水杨酸组合物能明显改善UC小鼠腹泻、便血、体重减低等情况，有效降低疾病综合指数，其效果优于二者单独使用时的结果。测量各组实验小鼠的结肠长度发现，组合物可显著维持结肠正常长度，结肠病理切片显示组合物可有效保护结肠黏膜的完整，与模型对照组相比，明显降低免疫细胞在结肠组织中的浸润(图3A-图3C),所给组合物中德卡林碱和水杨酸两个组分的摩尔浓度比例为1:1(以质量分数计，德卡林碱69.8％，水杨酸为30.2％)

实施例4

注射液制剂的制备：

将德卡林碱和水杨酸混合制剂各按比例称取80mg，将其溶解于2毫升丙二醇中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例5

粉剂的制备：

将1:1摩尔量德卡林碱和水杨酸混合制剂与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例6

片剂的制备：

将1:1摩尔量德卡林碱和水杨酸混合制剂，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7

口服液制剂的制备：

将1:1摩尔量德卡林碱和水杨酸混合制剂按常规口服液制法制成口服液。

实施例8

胶囊剂、颗粒剂、或冲剂的制备：

将1:1摩尔量德卡林碱和水杨酸混合制剂按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。