阅读说明：本技术 一种曲通-银复合抗菌新试剂及其应用 (Novel triton-silver composite antibacterial reagent and application thereof ) 是由 范伟 范兵 段梦婷 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种曲通-银复合抗菌新试剂及其应用,所述曲通-银复合抗菌新试剂为以曲通和银为原料,添加药剂学可接受的载体,制备的具有复合优良抗菌性能的新型抗菌药物试剂,所述银为银离子或者纳米银,所述曲通浓度低于1％,所述银离子或者纳米银浓度低于100μg/mL。所述曲通和银具有协同抗菌作用。本发明提供的曲通-银复合抗菌新试剂可以有效减少银离子或纳米银的使用量,从而显著降低其伴随的高细胞毒性和潜在变色性缺陷,显著提升银离子或纳米银的抑菌效果,具有重要研究及临床意义。(The invention provides a novel triton-silver composite antibacterial reagent and application thereof, wherein the novel triton-silver composite antibacterial reagent is a novel antibacterial drug reagent which is prepared by taking triton and silver as raw materials and adding a pharmaceutically acceptable carrier, and has excellent composite antibacterial performance, the silver is silver ions or nano silver, the concentration of the triton is lower than 1%, and the concentration of the silver ions or the nano silver is lower than 100 mug/mL. The triton and the silver have a synergistic antibacterial effect. The novel triton-silver composite antibacterial reagent provided by the invention can effectively reduce the usage amount of silver ions or nano silver, thereby obviously reducing the accompanying high cytotoxicity and potential discoloration defects, obviously improving the antibacterial effect of the silver ions or the nano silver, and having important research and clinical significance.)

一种曲通-银复合抗菌新试剂及其应用

技术领域

本发明属于抗菌药物试剂领域，具体涉及一种曲通-银复合抗菌新试剂及其应用。

背景技术

抗菌药物是目前临床应用最广泛的药物种类之一。不同抗菌药物的联合应用由来已久。合理的联合用药，有单用药物不可比拟的优越性，既可降低不良反应，减少药源性疾病，又可降低耐药性，提高疗效。

抗菌金属离子，例如银离子(Ag⁺)在有广谱抗菌活性的同时无明显细菌耐药性。然而，银离子的高细胞毒性和潜在变色性严重制约了它在临床医学中的广泛应用。洗涤剂被广泛用作生物膜的增溶剂，可分为离子表面活性剂(如氯己定，chlorhexidine，CHX)和非离子表面活性剂(如曲通，Triton X-100，TX-100)。由于洗涤剂两亲性的特点，能在低浓度进入细胞膜，在高浓度下溶解膜。CHX因其对一系列革兰氏阳性、阴性菌的高效抑制作用，被广泛应用于临床治疗，但其高毒性始终制约它的应用。TX-100作为非离子型洗涤剂是可溶的两亲性分子，能够与脂质体和细胞膜结合，并通过重新排列脂筏的各向异质性来增加膜的穿透性。TX-100是研究生物膜的必要工具，但由于其有限的抑菌活性，很少作为抗菌药物使用。

为了克服上述不足，研究人员尝试将银离子或纳米银与其他金属离子、洗涤剂等材料结合使用，以增强抗菌效果，减少副作用。当CHX与银离子或纳米银联合使用，显示其抗菌效果增强，但是将银离子或纳米银和TX-100协同，研制出一种新型增强抗菌药物试剂，尚未见报道。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种曲通-银复合抗菌新试剂，以曲通(TritonX-100，TX-100)和银为主要原料制备的具有复合优良抗菌性能的新型抗菌药物试剂，所述曲通和银具有协同抗菌作用。

本发明目的之二在于提供一种曲通-银复合抗菌新试剂在抗菌药物中的应用，所述曲通-银复合抗菌新试剂可以显著降低银离子或纳米银的使用量，减少其伴随的高细胞毒性及潜在变色性问题，同时增强抗菌作用，具有重要研究及临床意义。

本发明实现目的之一采用以下技术方案：

一种曲通-银复合抗菌新试剂，所述曲通-银复合抗菌新试剂为以曲通和银为原料，添加药剂学可接受的载体，制备的具有复合优良抗菌性能的新型抗菌药物试剂，所述银为银离子或者纳米银，所述曲通浓度低于1％，所述银离子或者纳米银浓度低于100μg/mL。

所述曲通和银具有协同抗菌作用。

所述银离子来源于硝酸银或磺胺嘧啶银或其他银离子化合物。

所述载体为液体、凝胶或固体。

所述凝胶包括胶原凝胶、甲基纤维素凝胶，所述固体包括壳聚糖支架、高分子聚合物支架、纤维织物。

所述曲通-银复合抗菌新试剂为颗粒剂、片剂、丸剂、贴剂、胶囊剂、注射剂、喷雾剂或分散剂等。

本发明实现目的之二采用以下技术方案：

一种曲通-银复合抗菌新试剂在抗菌药物中的应用。

所述菌类包括粪肠球菌。

所述曲通-银复合抗菌新试剂作为抗菌药物用于粘膜给药、皮肤外用、体内植体、牙科给药，所述粘膜给药采用溶液剂、喷雾剂、气雾剂；皮肤外用给药采用贴剂、搽剂、洗剂、凝胶剂、涂剂、软膏剂；牙科给药采用溶液剂、凝胶、糊剂等；体内植体给药采用支架、填充材料、缓释体等。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供的曲通-银复合抗菌新试剂，包括曲通和银两种有效成分，所述曲通-银复合抗菌新试剂可以有效减少银离子或纳米银的使用量，从而显著降低其伴随的高细胞毒性和潜在变色性缺陷。

(2)本发明提供的曲通-银复合抗菌新试剂，可以显著提升银离子或纳米银的抑菌效果，具有协同抗菌作用，具有重要研究及临床意义。

(3)本发明提供的曲通-银复合抗菌新试剂，可以采用多种应用形式，应用于多种感染控制领域。

附图说明

图1为本发明实施例中Ag⁺+TX-100协同作用24小时对粪肠球菌菌落形成的影响；

图中，A-I分别表示25μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100，50μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100,75μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100，100μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100，25μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100，50μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100，75μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100，100μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100，2％CHX组别的细菌菌落形成图；

图2为本发明实施例中Ag⁺+TX-100协同作用24小时对粪肠球菌菌落形成影响的细菌菌落评分(*：与阳性对照组相比有显著差异，P<0.05)；

图3为本发明实施例中Ag⁺+TX-100协同对粪肠球菌影响的动态抗菌评分(*：与阳性对照组相比有显著差异，P<0.05)；

图4为本发明实施例中Ag⁺+TX-100协同对MC3T3细胞的细胞毒性(*：与阴性对照组相比有显著差异，P<0.05)。

具体实施方式

以下通过具体实施例结合附图对本发明中的曲通-银复合抗菌新试剂及其应用作进一步说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

以银离子与TX-100的混合溶液为例，针对粪肠球菌这种对极度恶劣环境，如营养匮乏、高碱性pH值具有很强的抵抗力的革兰阳性兼性厌氧菌，对上述新型抗菌药物的性能进行测定。

实施例银离子和TX-100混合溶液协同抗菌性能的测定

1.1最低抑菌浓度(MIC)和杀菌浓度(MBC)试验

用灭菌双蒸水制备含0，0.02％，0.04％，0.08％，0.1％，0.2％，1％或2％TX-100的硝酸银(AgNO₃)溶液(AgNO₃浓度为：600，400，300，200，100，50，25，0μg/mL)，将50μL上述混合溶液加入96孔板。取600nm处吸光度值为1的粪肠球菌(ATCC)悬液，在双倍浓度的BHI培养基中梯度稀释至2×10⁵CFUs/mL，取50μL已稀释的菌液加入到上述96孔板中，37℃避光厌氧孵育24小时。用酶标仪(Power Wave XS2,BioTek Instruments,VT,USA)读取600nm处吸光度值，数值最接近空白培养基的吸光度值，且AgNO₃溶液浓度最低的组别即为在该浓度TX-100作用下AgNO₃的MIC。从AgNO₃溶液浓度大于MIC的组中各取10μL混合液，涂布于BHI琼脂板上并计算菌落形成单位个数，当小于空白对照组(BHI培养基+粪肠球菌)的4％即为在该浓度TX-100作用下AgNO₃的MBC。操作均在避光无菌条件下进行。重复六次。结果如表1所示：

表1在不同浓度TX-100作用下AgNO₃的MIC和MBC

结果表明，TX-100的少量添加(0.01％，0.02％)，就能使AgNO₃的MIC与MBC得到明显下降，AgNO₃的抑菌效果得到极大提升；并且随着TX-100浓度增加，AgNO₃的MIC与MBC逐渐下降，在加入0.04％TX-100时就能达到AgNO₃MIC和MBC最低值，使其浓度减少达到12倍。而在持续增加TX-100浓度时，其MIC与MBC值保持不变，说明此时银离子的浓度已经达到能充分发挥与TX-100协同抗菌的最低浓度。

1.2菌落形成单位计数实验

取600nm处吸光度值为1时的粪肠球菌悬液(1×10⁹CFUs/mL)，将900μL粪肠球菌悬液与100μL含AgNO₃与TX-100的溶液混合，使AgNO₃的终浓度为25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL，TX-100的终浓度为0.02％、0.04％。混合均匀后于4℃避光孵育24小时。24小时后，各取5μL均匀涂布于BHI琼脂培养皿，于37℃避光厌氧培养24小时。阴性对照组为菌液与100μL灭菌双蒸水共孵育，阳性对照组为菌液与100μL20％CHX共培养，即终浓度为2％CHX。以上操作均在避光无菌条件下进行。重复6次。采用4分制评分系统，具体评分机制如下：

得分1：BHI琼脂板上细菌数量为0。

得分2：BHI琼脂板上细菌少于100个。

得分3：BHI琼脂板上细菌少于500个。

得分4：BHI琼脂板上细菌超过500个。

结果如图1及图2所示，经过24小时，相较于阴性对照组——细菌量完全无法计数，所有实验组都发挥了显著的抗菌效果，并且随着AgNO₃及TX-100浓度的增加，其抗菌效果更加显著，75、100μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100组，以及75、100μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100组，均能发挥稳定的完全杀菌作用，而与2％CHX组别无明显差别。(*：与阳性对照组相比有显著差异，P<0.05)

1.3动态抗菌实验

取600nm处吸光度值为1的粪肠球菌悬液，在双倍浓度的BHI培养基中稀释至2×10⁸CFUs/mL。将500μLAgNO₃与TX-100的混合溶液加入500μL稀释后的粪肠球菌悬液，使AgNO₃与TX-100的终浓度与上述1.2中一致，混合均匀后于37℃恒温培养箱避光孵育。在1，3，6，9小时，分别取5μL均匀涂布于BHI琼脂培养皿，于37℃避光厌氧培养24小时。阴性对照组为500μL菌液与500μL灭菌双蒸水共孵育，阳性对照组为500μL菌液与500μL4％CHX共培养。以上操作均在避光无菌条件下进行。重复6次。评分系统与1.2中一致。结果如表2及图3所示：

表2 AgNO₃+TX-100的动态抗菌效果

图3结果表明，动态抗菌评分结果进一步证实了AgNO₃+TX-100的显著协同抗菌作用。除了剂量依赖性，他们之间还有时间依赖的关系。动态抗菌评分结果显示不同浓度的AgNO₃+TX-100组的得分随时间增加呈逐渐下降趋势，说明随着作用时间增长，其抗菌作用也逐渐增强。在3小时后，100μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100组，75μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100组和100μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100组未见细菌生长，继续观察发现随时间延长，无细菌生长的组别逐渐增加，而在9小时后，只有25μg/mLAgNO₃+0.02％TX-100组以及25μg/mLAgNO₃+0.04％TX-100组仍有细菌存活。此外，所有评分为1的组别的标准差均为0，说明AgNO₃+TX-100能发挥极其稳定的完全杀菌作用。

1.4细胞毒试验

采用CCK-8试剂盒检测该混合物的细胞毒性。用含1％青霉素/链霉素双抗及10％胎牛血清的α-MEM培养基制备AgNO₃(25,50,75,100μg/mL),TX-100(0.02％，0.04％)及含Ag⁺+TX-100的混合溶液，并使用无菌的直径为0.22μm的过滤器进行过滤除菌。在96孔板中加入100μL浓度为10×10³个/mL的MC3T3细胞(ATCC)悬液，37℃培养24小时使细胞贴壁。24小时后，吸取96孔板中的培养基，并添加200μL新鲜α-MEM培养基及10μL上述混合液，37℃避光共培养。同时设置阴性对照组(换液时仅添加210μLα-MEM培养基)及阳性对照组(换液时添加200μLα-MEM培养基及10μL2％CHX)。培养24小时后，吸去96孔板每孔中液体，并使用200μLPBS漂洗3次，最后加入100μLα-MEM培养液、10μLCCK-8试剂，避光37℃共同孵育1小时后使用酶标仪测定450nm波长处96孔板的吸光度。以上各组重复6次。

结果如图4所示，经过CCK-8测试，与阴性对照组比较，不同浓度的AgNO₃+TX-100组对细胞生长均无明显抑制作用(P>0.05)，而阳性对照组即2％CHX组别对细胞生长有明显抑制作用。(P<0.05)

综上所述，银离子和TX-100混合溶液相较于银离子或者纳米银，可以在更低剂量的药物作用下抑制致病菌的生长，增强抗菌效力，减少药物带来的副作用，具有协同抗菌作用；相较于传统抗菌药物氯己定，在保持和氯己定相似抗菌效果的同时，降低了药物的细胞毒性，使得银与TX-100添加药剂学可接受的载体，能够制备曲通-银复合抗菌新试剂，其具有复合优良抗菌性能，能够作为一种新型抗菌药物试剂在预防及治疗细菌感染性疾病中得到应用。