阅读说明：本技术 Pgam1别构抑制剂hkb99在制备治疗肺腺癌药物中的应用 (Application of PGAM1 allosteric inhibitor HKB99 in preparation of drugs for treating lung adenocarcinoma ) 是由 沈瑛 梁倩 陈红专 周璐 周烨 顾玮铭 罗鸣宇 于 2019-04-10 设计创作，主要内容包括：本发明提供PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用,PGAM1别构抑制剂HKB99能够显著抑制肺腺癌及其耐药细胞增殖和迁移,且对正常支气管上皮细胞影响较小,具有良好的选择性；体内实验发现HKB99能抑制人肺腺癌皮下瘤生长和肿瘤转移。HKB99有望成为高效、低毒的抗肿瘤新药,为PGAM1抑制剂联合厄洛替尼治疗肺腺癌提供实验理论依据。(The invention provides an application of PGAM1 allosteric inhibitor HKB99 in preparation of a medicament for treating lung adenocarcinoma, and PGAM1 allosteric inhibitor HKB99 can obviously inhibit lung adenocarcinoma and proliferation and migration of drug-resistant cells thereof, has small influence on normal bronchial epithelial cells, and has good selectivity; in vivo experiments show that HKB99 can inhibit the growth of subcutaneous tumor of human lung adenocarcinoma and tumor metastasis. HKB99 is expected to become a novel high-efficiency and low-toxicity antitumor drug, and provides experimental theoretical basis for treating lung adenocarcinoma by combining PGAM1 inhibitor with erlotinib.)

PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及技术药物化学领域，尤其涉及PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

背景技术

磷酸甘油酸变位酶1(phosphoglycerate mutase 1，PGAM1)是肿瘤细胞有氧糖酵解通路中的重要酶，催化其底物3-磷酸甘油酸(3-phosphoglycerate，3-PG)转化为2-磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate，2-PG)，不仅能调控糖酵解速率，同时还通过调控3-PG和2-PG的浓度，参与调控磷酸戊糖途径和丝氨酸合成通路，进而影响整个代谢网络。PGAM1表达与活性异常升高，在多种肿瘤的发生发展中起重要作用，有望作为抗肿瘤新靶标，设计并筛选出高活性、高特异性的PGAM1抑制剂已受到越来越多研究者的关注。

代谢重编程已成为肿瘤的重要特征之一，在细胞癌变过程中有氧糖酵解、三羧酸循环、氧化磷酸化等多个代谢途径发生了显著变化，不仅能提供肿瘤生长所需的能量，其代谢中间产物也为蛋白质、脂肪、核酸等生物大分子合成提供原料，使肿瘤形成依赖代谢关键酶的调节，增加恶性潜能。其中，PGAM1处于糖酵解通路中游，在肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌和神经胶质瘤等多种肿瘤组织中高表达，其蛋白水平与患者预后呈负相关，与肿瘤组织分级和严重程度呈正相关，提示PGAM1有望成为抗肿瘤新靶标。

Evan等首次报道小分子化合物MJE3，能特异性抑制PGAM1，但是细胞水平抑制活性较弱。Hitosugi等筛选得到PGMI-004A，能选择性抑制PGAM1活性，显著抑制肿瘤细胞增殖和皮下移植瘤生长，但是抑制活性仍需进一步提高。Xiaoguang Li等从绿茶中分离得到的天然产物EGCG，能抑制PGAM1活性，但是特异性不佳，存在其他作用靶标，体内实验结果也未见报道。因此，研究与开发更高活性和特异性的PGAM1抑制剂已成为抗肿瘤药物研究的热点。

肺癌分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC,～80％)和小细胞肺癌(SCLC,～20％)。其中肺腺癌发病率逐年急剧上升，已成为最常见的NSCLC病理类型，约占50％。大多数肺癌患者确诊时已进入疾病进展期或晚期，错过最佳手术机会，以放化疗为主要的治疗方案，有效应答率低，毒副反应较高。

以厄洛替尼、吉非替尼和阿法替尼为代表的第一代EGFR-TKIs药物极大的缓解了EGFR敏感型活化突变(主要包括外显子19的缺失突变Del19与外显子21的错义突变L858R)NSCLC患者的临床症状，延长无进展生存期。EGFR敏感突变阳性的NSCLC在我国高达30-40％，特别是肺腺癌中占60％以上，使得EGFR-TKIs类药物在治疗我国肺腺癌患者中的地位显得尤为重要。然而在临床实践中发现，即便是治疗初期有效者，在治疗后4～12个月发生不同程度的耐药现象，继而导致肿瘤复发，已成为TKIs类药物在临床应用中的最大障碍。

中国专利申请CN201810273938.9公开了一种9,10-蒽醌类化合物或其药学上可接受的盐及其药物用途，其中9,10-蒽醌类化合物结构式如下：

该类化合物能抑制磷酸甘油酸变位酶活性，降低细胞代谢水平，可用于治疗实体肿瘤及血液肿瘤等疾病。其中HKB99化学结构式如下：

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

本发明的第二个目的在于，提供PGAM1别构抑制剂HKB99与抗肺腺癌药物联合用药在制备治疗肺腺癌药物中的应用。

为了实现上述本发明第一个目的，本发明提供了PGAM1别构抑制剂HKB99在制备治疗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，所述HKB99的结构式如下：

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了PGAM1别构抑制剂HKB99与抗肺腺癌药物联合用药在制备治疗肺腺癌药物中的应用，其特征在于，所述HKB99的结构式如下：

作为一个优选方案，所述抗肺腺癌药物是指厄洛替尼。

本发明的优点在于，PGAM1别构抑制剂HKB99，能够显著抑制肺腺癌及其耐药细胞增殖和迁移，且对正常支气管上皮细胞影响较小，具有良好的选择性；体内实验发现HKB99能抑制肺腺癌皮下瘤生长和肿瘤转移。HKB99有望成为高效、低毒的抗肿瘤新药，为PGAM1抑制剂联合厄洛替尼治疗肺腺癌提供实验理论依据。

附图说明

图1.HKB99选择性抑制肺腺癌细胞增殖。

图2.小剂量HKB99短时间处理抑制肺腺癌细胞运动。

图3.HKB99抑制耐药细胞增殖和运动，提高对厄洛替尼敏感性。

图4.联合使用HKB99对PC9细胞皮下移植瘤的作用。

图5.HKB99抑制HCC827-Luc尾静脉注射移植瘤体内转移。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.制备4-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(3,4-二羟基-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-基)苯磺酰胺(HKB99)

HKB99的合成路线

第一步、制备3-硝基-1,2-二羟基蒽-9,10-二酮(2)

向1L圆底烧瓶中加入1,2-二羟基蒽-9,10-二酮(5g,20.8mmol)和冰醋酸(350mL)，50℃搅拌约10分钟，逐滴加入1.5mL浓硝酸，TLC检测原料点消失停止反应，待反应液恢复至室温后，抽滤得黄色固体，该粗产品可不经纯化直接用于下步反应,粗产率70％。

第二步、制备3-氨基-1,2-二羟基蒽-9,10-二酮(3)

向1L圆底烧瓶中加入化合物2(1.75g,6.14mmol)和无水乙醇(350mL)，室温搅拌，依次加入锡粉(10.5g,341mmol)和二水合氯化亚锡(12.5g,55.4mmol)，再逐滴加入50.4mL浓盐酸，TLC检测原料点消失停止反应，抽滤除去锡粉，减压浓缩除去部分乙醇，将剩余反应液逐滴加入1L水中，抽滤并真空干燥得黑色固体，该粗产品可不经纯化直接用于下步反应，粗产率90％。

第三步、制备N-(3,4-二羟基-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-基)-4-碘苯磺酰胺(4)

向25mL圆底烧瓶中加入化合物3(255mg,1mmol)和干燥吡啶(5mL)，室温搅拌，缓慢加入对碘苯磺酰氯(454mg,1.5mmol)，反应4h。将反应液逐滴加入10％盐酸中，调pH 1-2，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(二氯甲烷)，得黄色固体281mg，产率54％。

第四步、制备4-(氮杂环丁烷-1-基)-N-(3,4-二羟基-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-基)苯磺酰胺(HKB99)

把N-(3,4-二羟基-9,10-二氧-9,10-二氢蒽-2-基)-4-碘苯磺酰胺(52.1mg,0.1mmol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(9.2mg,0.01mmol)、(±)-2,2'-双-(二苯膦基)-1,1'-联萘(9.3mg,0.015mmol)、叔丁醇钠(48.1mg,0.5mmol)和哌啶(1mL)加入5mL圆底烧瓶，依次抽真空、充氮气三次，80℃反应，TLC检测原料点消失停止反应。待反应液冷却至室温后，将反应液逐滴加入约20mL的10％盐酸中，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离(二氯甲烷)，得橘黄色固体29.3mg，产率65％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.60(brs,1H),10.82(brs,1H),9.80(brs,1H),8.22–8.10(m,2H),7.94–7.84(m,2H),7.80(s,1H),7.66(d,J＝8.0Hz,2H),6.41(d,J＝8.4Hz,2H),3.88(t,J＝6.4Hz,4H),2.30(p,J＝6.4Hz,2H).¹³C NMR(151MHz,DMSO)δ187.59,180.71,153.76,150.13,141.14,134.90,134.19,133.29,132.85,132.07,128.41,126.75,126.33,125.47,123.86,112.36,111.08,109.74,51.25,15.93.MS(ESI)(m/z):449.0(M-H)^-.HRMS(ESI)calcd for C₂₃H₁₈N₂O₆S[M-H]^-:449.0813；found:449.0816.

实施例2.HKB99抑制肺腺癌细胞

(1)CCK8法检测结果发现HKB99抑制多种肺腺癌细胞，对正常支气管上皮细胞16HBE没有影响。图1为HKB99选择性抑制肺腺癌细胞增殖。

在96孔板中加入100μL细胞悬液，4000cells/well,将培养板在37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中培养24h。将候选药物不同浓度梯度配制在培养液中，吸去旧培养液，每孔加入100μL新配的培养液，将培养板在37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中培养72h。将CCK-8溶液按照1:10用不含血清的培养液稀释10倍，吸去培养板中的旧培养液，每孔加入100μL新配的含CCK-8的培养液。将培养板置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中孵育30至60min。用酶标仪在450nm处检测吸光度值。以下列公式计算肿瘤细胞增殖的抑制率：

抑制率＝(A_450对照孔－A_450给药孔)/A_450对照孔×100％

根据各浓度抑制率，采用LOGIT法计算半数抑制浓度IC₅₀。以上每个实验重复2次，求出2次实验的平均IC₅₀值作为抑制能力的最终指标。

(2)划痕实验发现HKB99抑制肺腺癌细胞运动；

对数生长期肺腺癌细胞接种到96孔板，2×10⁴个细胞/孔，3复孔，过夜贴壁，观察细胞汇合度约100％时，进行细胞划痕。PBS清洗3遍后，对照组加入不含血清的培养液，实验组加含有小剂量HKB99(0.2μM)的无血清基础培养液。放入Incucyte活细胞检测仪进行实时监测，数据分析得到细胞迁移速率。图2显示HKB99短时间处理抑制肺腺癌细胞运动。

(3)HKB99能逆转耐药细胞对厄洛替尼的耐药性，抑制耐药细胞增殖和运动；

CCK8法检测细胞增殖活力，计算HKB99和厄洛替尼对肺腺癌细胞增殖抑制率；划痕实验观察细胞运动，具体方法描述同上。图3显示HKB99抑制耐药细胞增殖和运动，提高对厄洛替尼敏感性。

(4)裸小鼠皮下异种移植瘤模型观察HKB99和厄洛替尼对肺腺癌皮下肿瘤生长的抑制作用。HKB99缓释制剂能显著抑制肺腺癌皮下瘤生长，厄洛替尼剂量爬坡诱导皮下瘤适应性耐药，联用HKB99缓释制剂可抑制肿瘤耐药性产生。

收集细胞制成5×10⁶个/mL细胞悬液，在BACL/c裸小鼠上腋窝皮下注射100μL。注射7天之后，肿瘤体积约为100mm³，将裸小鼠随机分为4组：空载对照组(缓释制剂载体PLGA),单加HKB99组(腹腔注射，100mg/kg，每隔2天注射1次)，厄洛替尼剂量爬坡组(灌胃，爬坡剂量见图示)，HKB99+厄洛替尼联合加药组，待对照组肿瘤长到1500mm³,取出皮下移植肿瘤，拍照并称瘤重。HE染色观察皮下瘤病理状况。图4显示联合使用HKB99对PC9细胞皮下移植瘤的作用。

(5)裸小鼠体内肺腺癌转移瘤模型发现HKB99抑制肺腺癌体内转移。收集HCC827-Luc肺腺癌细胞悬液1×10⁶个/mL，BACL/c裸小鼠尾静脉注射100μL，隔天注射一次，待细胞总量达到5×10⁶个/只停止注射。IVIS小动物活体成像实验每两周1次观察体内荧光素信号，在细胞结束接种后的第2周进行第一次活体成像，此时裸鼠肺部荧光信号均值约为1×10⁵p/sec/cm²/sr，表明肺腺癌细胞已经在裸鼠体内形成稳定转移灶。待体内肿瘤转移灶形成后，进行随机分组，对照组不做处理，实验组给予HKB99缓释制剂(腹腔注射，100mg/kg，每隔2天注射1次)，持续观察小鼠体内荧光信号和体重变化。在持续给药2周后，再次进行小动物活体成像实验，结果显示实验组小鼠体内荧光信号无明显变化，而对照组小鼠体内荧光信号明显增加，表明肿瘤发生转移。

持续至接种后84天，当小鼠出现体重急剧下降或恶变质、或者体内荧光信号值达到1×10⁷p/sec/cm²/sr时，定义为小鼠死亡。相对于HKB99加药组，无处理对照组小鼠生存期明显缩短(图5A)；小鼠活体成像结果显示给药组荧光强度显著低于对照组(图5B)；统计接种后14天和84天的荧光强度值，发现给药组荧光强度显著低于对照组(图5C)；通过体重曲线可以看出，加药组体重有所上升，说明持续长时间HKB99给药对小鼠毒性低；而对照组中部分小鼠发生恶变质而导致体重明显下降(图5D)。图5显示HKB99抑制HCC827-Luc尾静脉注射移植瘤体内转移。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。