氯喹那多的新应用
阅读说明：本技术 氯喹那多的新应用 (Novel application of chloroquinate ) 是由 胡文辉 孙平 杨忠金 陈燕红 陈秀会 梁淑丽 熊兮 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种氯喹那多的新应用。本发明中通过氯喹那多对NLRP3炎症小体抑制作用的体外研究表明,氯喹那多能有效抑制NLRP3炎症小体的活化,能抑制炎症细胞因子IL-1β和Caspase-1的成熟和分泌。另外,动物试验证明,氯喹那多对于NLRP3相关疾病具有良好的防治作用,尤其是针对银屑病,具有显著的防治效果。(The invention relates to a new application of cloquindol. In-vitro research on the inhibition effect of the cloquindol on the NLRP3 inflammasome shows that the cloquindol can effectively inhibit the activation of the NLRP3 inflammasome and can inhibit the maturation and secretion of inflammatory cytokines IL-1 beta and Caspase-1. In addition, animal experiments prove that the chloroquinate has good prevention and treatment effects on NLRP 3-related diseases, and particularly has remarkable prevention and treatment effects on psoriasis.)
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是涉及氯喹那多的新应用。
背景技术
NLRP3炎症小体是一种模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)，是Caspase-1的炎症性激活平台。NLRP3炎症小体是由感受蛋白NLRP3、接头蛋白ASC(apoptosis-associated speck like protein containing a CARD，细胞凋亡相关斑点样蛋白)及Caspase1为关键蛋白组装而成的多蛋白复合体。在接受免疫原刺激活化后，可以激活Caspase1，进而促进Pro-IL-1β等细胞因子前体的切割成熟；同时，激活的Caspase-1还可以引发细胞焦亡。NLRP3炎症小体能够识别外源性的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecμlar pattern,PAMP)如脂多糖LPS、病毒RNA等或内源性的损伤相关分子模式(damage-associated molecμlar pattern,DAMP)如DNA、内毒素、尿酸、ATP、Aβ和细胞碎片等。这些物质异常的出现在细胞外或细胞内的某个部位，使组织的稳态受到刺激而激活NLRP3炎症小体，抵抗外源性或内源性因素对机体的损害，但过度激活的NLRP3炎症小体会导致多种疾病发生发展，例如银屑病、痛风、遗传性Cryopyrin相关周期性发热综合征、多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症、脓毒症等。尽管在基础研究中许多抑制剂对NLRP3炎症小体相关的疾病都有一定的缓解作用，通过靶向NLRP3炎症小体治疗相关疾病已经在一些疾病模型中得到了验证。
目前已经报道有些小分子化合物以及代谢物能够有效抑制NLRP3炎症小体，如MCC950(Coll,et al.,2016,Nat Med)、ω-3脂肪酸(Yan,et al.,2013,Immunity)、萝卜硫素(Yang,et al.,2016,Sci Rep)、异甘草素(Honda,et al.,2014,J Leukoc Biol)、3,4甲二氧基-β-硝基苯乙烯(3,4-methylenedioxy-nitrostyrene)(He,et al.,2014,J BiolChem)、β羟基丁酸(Youm,2015,Nat Med)等。虽然这些化合物有望成为治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物，但还需经过漫长的药效及药物安全评估和临床测试，迄今为止还没有有效针对NLRP3炎症小体的药物问世。
综上所述，本领域对于抑制NLRP3炎症小体活化的临床药物存在需求。而目前氯喹那多能否对NLRP3炎症小体相关疾病进行防治未见报道。
氯喹那多的结构式为氯喹那多是一种用于治疗皮肤感染的局部抗菌剂，已经在临床上作为一种药膏局部单独使用或结合皮质激素治疗局部皮肤感染很长一段时间了，对其研究与实践已证明其安全性。氯喹那多已被证明具有显著的抗菌、抗结核、抗病毒、抗寄生虫活性，而目前关于氯喹那多的研究主要集中在其抗菌效果。氯喹那多在预防和治疗NLRP3炎症小体相关疾病药理机制却未见报道。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种氯喹那多在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。
具体技术方案如下：
氯喹那多在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为银屑病。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为特异性皮炎、紫外线所诱导的皮肤晒伤、肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化、痛风、多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏症、肝炎、硅肺、类风湿关节炎、接触性超敏反应、抑郁症、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病或肾病。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体相关疾病为家族性冷自发炎综合征、Mμckle-Wells综合征、慢性婴儿神经皮肤和关节综合征、新生儿发作多系统炎性疾病、肌萎缩侧索硬化或哮喘或急性呼吸窘迫综合征。
在其中一些实施例中，其中氯喹那多能抑制NLRP3炎症小体活化。
在其中一些实施例中，氯喹那多能抑制Caspase-1成熟或分泌。
在其中一些实施例中，其中氯喹那多能抑制IL-1β成熟或分泌。
在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。
本发明的另一目的是提供一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物，包括活性物质以及药学上可接受的辅料，所述活性物质包括氯喹那多。
在其中一些实施例中，所述辅料为赋形剂、填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂和香料中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种氯喹那多在预防和/或治疗NLRP3炎症小体相关疾病的药物中的新应用。本发明中通过氯喹那多对NLRP3炎症小体抑制作用的体外研究表明，氯喹那多能有效抑制NLRP3炎症小体的活化，能抑制炎症细胞因子IL-1β和Caspase-1的成熟和分泌。另外，动物试验证明，氯喹那多对于NLRP3相关疾病具有良好的防治作用，尤其是银屑病，具有显著的防治效果。
附图说明
图1：(A)氯喹那多的结构式，CQD为氯喹那多的缩写；(B、C、D)氯喹那多(CQD)可以浓度依赖性的抑制尼日利亚菌素(Nigericin)、ATP和尿酸盐结晶(MSU)诱导IL-1β的分泌。
图2：CCK8实验检测氯喹那多(CAQ)在体外对细胞的毒性小。
图3：细胞总乳酸脱氢酶活性的检测显示氯喹那多(CQD)能抑制LDH的释放。
图4：免疫印迹(WB)检测氯喹那多(CQD)可以浓度依赖性的抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的Caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。
图5：氯喹那多(CQD)能有效降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型背部皮肤红斑评分、鳞屑评分、皮肤厚度评分以及总评分。
图6：苏木素-伊红(HE)染色显示氯喹那多(CQD)能降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型背部表皮厚度。
图7：氯喹那多(CQD)能降低咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型背部皮肤中IL-1β、IL-17的释放。其中，A是IL-1β的表达变化，B是IL-17的表达变化。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例中所用到的试验材料：如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。氯喹那多(缩写：CQD)购自TargetMol公司(货号：T0908)。LPS和ATP购自Sigma公司。Nigericin(尼日利亚菌素)购自Invitrogen公司。LDH检测试剂盒购自碧云天公司。抗鼠IL-1β抗体(AF-401-NA)购自R&D公司。抗NLRP3抗体(AG-20B-0014)、抗ASC抗体(AG-25B-0006)和抗Caspase-1抗体(AG-20B-0042)购自Adipogen公司。抗β-actin抗体(P30002)购自Abmart公司。ELISA试剂盒(IL-1β,IL-17)购自Invitrogen公司。J774A.1细胞购自jennio-bio。咪喹莫特乳膏购自四川明欣利迪公司。凡士林乳膏购自上海商玺伟康公司。C57BL/6J雌性小鼠购自广东省实验动物中心。
实施例1
氯喹那多(CQD)抑制IL-1β的分泌
1、第一天，将生长状态良好的J774A.1细胞接种到96孔板上，每孔5×103个细胞；
2、次日观察细胞后，弃上清，每孔加入100μL用含有10％血清的DMEM培养基配制的细菌脂多糖(LPS)(1μg/ml)，作用5h，然后加入不同浓度的氯喹那多(CQD)(氯喹那多预先采用二甲基亚砜溶解，配成10mM母液，采用培养基稀释到想要的浓度；氯喹那多的终浓度依次为：2μM、4μM、6μM)处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，终浓度10μM)、ATP(终浓度5mM)处理1小时或MSU(终浓度300μg/ml)处理12h；
3、步骤2处理后，吸取细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书测定IL-1β含量，结果见图1。
图1结果显示，在LPS预处理和第二信号Nigericin、ATP或MSU的共同作用下，炎症小体被激活并分泌成熟的IL-1β到上清液中，随着不同浓度的氯喹那多(CQD)加入，均能够有效地抑制IL-1β的成熟和分泌，并且这种抑制效果在一定浓度范围内是呈剂量依赖性的。
实施例2
CCK8细胞毒性实验
1、将J774A.1细胞以每孔5×103个细胞接种到96孔板中，置于5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养过夜。
2、次日观察细胞生长状态良好，弃去培养基。空白对照组加入100μL完全培养基(98％DMEM+2％FBS)，给药组分别加入不同浓度的氯喹那多(CQD)(氯喹那多的终浓度分别为2.5μM、5μM、10μM)，作用24h。
3、步骤2处理完成后，用无菌PBS洗1次，所有组别均加入10％CCK-8溶液，100μL/孔，置于细胞培养箱中孵育1h。
4、检测前排出孔内的气泡避免对实验结果造成影响，在酶标仪上设定波长为450nm检测样品的吸光度值。结果见图2。
图2的结果显示，不同浓度的氯喹那多(CQD)处理细胞24h后，对细胞的毒性很小。
实施例3
氯喹那多(CQD)抑制乳酸脱氢酶(LDH)的释放
1、将J774A.1细胞以每孔5×103个接种到96孔板中，在细胞培养箱中培养过夜。
2、每孔加入100μL用含有10％血清的DMEM培养基配制的LPS(1μg/ml)，作用5h后，除了给药组每孔加入150μL含对应氯喹那多(CQD)浓度(浓度分别为2μM、4μM、6μM)的opti-MEM培养基外，其余组分别加入相同体积的opti-MEM培养基作用1h，再加入Nigericin(终浓度为10μM)刺激1h。
3、根据LDH试剂盒的使用说明，分别吸取各孔上清液120μL置于一个新的96孔板中，每孔加入60μL LDH工作液后用锡箔纸包裹置于摇床上反应30min。
4、设定酶标仪检测波长为490nm，参考波长为600nm，检测其吸光度值。结果见图3。
图3结果显示，氯喹那多(CQD)能明显抑制乳酸脱氢酶的释放。NLRP3炎症小体活化会导致免疫细胞焦亡，因此可以通过测上清中乳酸脱氢酶的量来评估细胞焦亡的程度。
实施例4
氯喹那多(CQD)抑制NLRP3炎症小体的活化
1、第一天，将J774A.1细胞接种到6孔板上，每个孔2×10 6个细胞；
2、种板过夜，弃上清，每孔加入1mL含细菌脂多糖(LPS)(1μg/ml)的含10％血清的DMEM培养基刺激5h，然后弃上清，加入含不同浓度的CQD(浓度分别为2μM、4μM、6μM)的opti-MEM培养基处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，终浓度10μM)处理1小时；
3、步骤2处理完毕后，分别提取上清液蛋白和细胞总蛋白，用抗IL-1β抗体、抗Caspase-1抗体、抗NLRP3抗体和抗ASC抗体进行western blot分析，结果见图4。
图4结果显示，在LPS预处理和第二信号Nigericin的共同作用下，炎症小体被激活，caspase-1和IL-1β成熟并分泌到上清液之中，随着不同浓度的氯喹那多(CQD)加入，均有效地抑制caspase-1和IL-1β成熟和分泌，并且，这种抑制效果在一定的浓度范围下是呈剂量依赖性的。
实施例5氯喹那多(CQD)抑制银屑病模型小鼠症状
1、选取6-8周龄的C57BL/6雄性小鼠，称量体重并随机分为6组，分别为：阴性对照组、阳性对照组(甲氨蝶呤组)、模型组和给药组(5mg/kg、15mg/kg)。
2、造模。所有小鼠在动物中心饲养一周以适应实验环境。一周后，给所有的小鼠背部剃毛，面积为2cm×4cm。给阴性对照组每只鼠涂抹凡士林62.5mg，其余各组每只鼠均涂抹IMQ 62.5mg，每天涂抹一次，连续6天，并在涂抹凡士林和IMQ(咪喹莫特)1h后腹腔注射药物。
3、给药。注射药物前称量并记录每只小鼠的体重，给药组腹腔注射氯喹那多，阳性对照组注射甲氨蝶呤(1mg/kg)，阴性对照组和模型组注射相同的溶剂，溶剂为2％二甲基亚砜+20％聚乙二醇+78％生理盐水，连续给药6天。
4记录评分。每天在涂抹凡士林和IMQ前称量体重并拍照记录小鼠皮肤，以便观察小鼠裸露皮肤表面的鳞屑、红斑和皮肤厚度的变化情况，并及时做好记录评分。
5、取材。给药6天后，给小鼠颈椎脱臼致死，取一部分皮肤置于1.5ml离心管中，随即放进液氮中冻存。另取一部分皮肤放入多聚甲醛中固定，做免疫组化和HE染色观察其病理变化。
6、检测。在完成步骤5后，取40mg左右液氮中冻存的皮肤组织，采用Elisa检测皮肤组织中IL-1β和IL-17的表达情况。
图5结果显示与模型组相比，氯喹那多能明显改善咪喹莫特诱导的银屑病小鼠的皮肤的红斑、鳞屑和褶皱情况。
图6结果显示模型组皮肤角化不全，表皮皮肤向下延伸呈钉突状；真皮可见毛细血管扩张充血，炎性细胞浸润。经氯喹那多治疗后能明显改善这种情况。
结果见图7。图7结果显示氯喹那多有效抑制了皮肤中IL-1β和IL-17的表达水平。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。