具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一类可有效抑制肝星状细胞活化的活性成分。实验表明，本发明的活性成分(奈非那韦或其药学上可接受的盐)可高效地抑制肝星状细胞的活化，从而起到防治非酒精性脂肪肝和/或抗肝纤维化的效果。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明揭示了奈非那韦及其组合物在防治非酒精性脂肪肝和/或抗肝纤维化的用途。奈非那韦及其组合物在临床可及浓度下可显著抑制肝星状细胞的活化，具有良好的临床应用前景。

术语

如本文所用，“本发明的活性成分”“本发明的活性化合物”、“本发明的抑制肝星状细胞活化的活性化合物”可互换使用，指具有优异的肝星状细胞活化抑制活性的化合物，尤其是奈非那韦或其药学上可接受的盐、或其组合。

如本文所用，“本发明的制剂”指含有本发明活性化合物的制剂。

如本文所用，术语“包括”或其变换形式如“包含”或“包括有”等等，被理解为包括所述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

肝星状细胞

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)是参与肝纤维化过程的关键细胞。研究表明，当肝脏遭到急性或慢性损伤因素时，如变为非酒精性脂肪性肝炎的过程中，静止状态的HSC发生活化，从贮存细胞分化成肌成纤维细胞，最终导致肝纤维化。

α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)是HSC活化的标志。静止状态的HSC中的α-SMA表达量低，活化状态下的HSC的α-SMA表达量高。

肝纤维化(Liver fibrosis)

如本文所用，术语“肝纤维化”指肝脏中胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的产生与降解失衡，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的的可逆性病理过程。

研究表明，各种致病因子累及肝脏后肝内发生的一种慢性损伤修复反应，包括病毒性肝炎、化学毒物或药物性肝病、酒精性/非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝病以及先天性代谢性疾病等均有可能引起肝纤维化。

非酒精性脂肪肝炎(NASH)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除饮酒过量和其他明确导致肝损伤的因素外所致的肝细胞脂肪过量累积为主要特征的一系列临床病理综合症。NAFLD根据其组织学变化分为单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)至肝硬化。如本文所用，术语“非酒精性脂肪肝炎”指表现为5％以上的肝细胞脂肪变合并小叶内炎症和肝细胞气球样变性。不合并肝纤维化或仅有轻度纤维化(F0～1)为早期NASH；合并显著肝纤维化或间隔纤维化(F2～3)为纤维化性NASH；合并肝硬化(F4)为NASH肝硬化。NASH与肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高脂血症等代谢紊乱关系密切。目前还没有获批的疗法。

本发明的活性化合物和活性成分

在本发明中，提供了一种可有效抑制肝星状细胞活化的活性成分。该活性成分选自下组：奈非那韦、或其药学上可接受的盐、或其晶体、或其溶剂化物。

奈非那韦(Nelfinavir)的结构式为：

该化合物的分子式为C₃₂H₄₅N₃O₄S，白色粉末状，分子量为567.78，CAS编号为159989-64-7。通用名为奈非那韦，是一种口服可生物利用的人类免疫缺陷病毒HIV-1蛋白酶抑制剂(Ki＝2nM)，是继沙奎那韦、利托那韦和英地那韦后，第四个FDA批准用于治疗艾滋病的药物。

一种优选的奈非那韦的药学上可接受的盐为其甲磺酸盐(即奈非那韦甲磺酸盐)：

奈非那韦甲磺酸盐的分子式为C₃₃H₄₉N₃O₇S₂，白色粉末状，分子量为663.89，CAS编号为159989-65-8。该化合物的通用名为甲磺酸奈非那韦(Nelfinavir mesilate)。

试验表明，本发明的活性成分可有效地抑制肝星状细胞活化，进而预防、治疗和/或缓解非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化相关疾病。

如本文所用，“本发明的活性化合物”、“本发明的抑制肝星状细胞活化的活性化合物”可互换使用，指具有优异的肝星状细胞活化抑制活性的化合物，包括奈非那韦、或其药学上可接受的盐、或其晶体、或其溶剂化物。

应理解，本发明的活性成分包括本发明的抑制肝星状细胞活化的活性化合物、或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体或外消旋体、或其前药。应理解，本发明的活性成分还包括本发明的活性化合物的晶型、无定形化合物、以及氘代化合物等形式。

所述“药学上可接受的盐”为本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应形成常规的无毒盐。例如，常规的无毒盐可通过本发明的活性化合物与无机酸或有机酸反应制得，所述无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、胺基磺酸和磷酸等，所述有机酸包括柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、萘磺酸、乙磺酸、萘二磺酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、富马酸、琥珀酸、丙酸、草酸、三氟乙酸、硬酯酸、扑酸、羟基马来酸、苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、对胺基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸和羟乙磺酸等；或者本发明的活性化合物与丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸或谷氨酸形成酯后再与无机碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐或铵盐；或者本发明的活性化合物与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸形成酯后再与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸或磷酸形成的对应的无机酸盐或与甲酸、乙酸、苦味酸、甲磺酸或乙磺酸形成的对应的有机酸盐。

此外，本发明的活性成分还特别适合与其他防治非酒精性脂肪性肝炎和抗肝纤维化药物联用。代表性的其他的抗病毒药物包括(但并不限于)：PPARγ激动剂、FXR激动剂、抗氧化剂、PPARα/δ激动剂、或其组合。

本发明的活性成分可抑制肝星状细胞活化。因此，当在治疗上施用或给予本发明的的活性成分时，可抑制肝星状细胞活化，进而达到防治非酒精性脂肪性肝炎和抗肝纤维化的作用。

药物组合物和应用

本发明还提供了以本发明的抑制肝星状细胞活化的活性化合物、或其药学上可接受的盐、或其前药、或其提取物、或其药材中的一种或多种的混合物为有效成分在制备治疗和/或预防、缓解非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化相关疾病的药物中的用途。

本发明所提供的药物组合物优选含有重量比为0.001-99wt％的活性成份，优选的比例是本发明的活性化合物作为活性成分占总重量的0.1wt％～90wt％或1wt％～50wt％，其余部分为药学可接受的载体、稀释液或溶液或盐溶液。

需要的时候，在本发明药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明所提供的化合物和药物组合物可以是多种形式，如片剂、胶囊、粉剂、糖浆、溶液状、悬浮液和气雾剂等，并可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中和适宜的用于注射或滴注的消毒器具中。

本发明的药物组合物的各种剂型可按照药学领域的常规制备方法制备。其制剂配方的单位计量中通常包含0.05-400mg本发明的活性化合物，优选地，制剂配方的单位计量中包含1mg-500mg本发明的活性化合物。

本发明的化合物和药物组合物可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以通过口、皮肤、或者胃肠道等的给药途径。最优选为口服。最优选日剂量为0.01-400mg/kg体重，一次性服用，或0.01-200mg/kg体重分次服用。不管用何种服用方法，个人的最佳剂量应依据具体的治疗而定。通常情况下是从小剂量开始，逐渐增加剂量一直到找到最适合的剂量。

本发明的药物或抑制剂可通过各种不同方式施用，例如可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹导入机体。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明活性化合物可高效地抑制肝星状细胞活化，1μM时即可降低α-SMA表达，在10μM时能够显著优于阳性药奥贝胆酸(OCA)降低α-SMA表达。。

(b)本发明活性化合物的毒副作用低，成药性好。奈非那韦是抗艾滋病老药，安全性高，对于13岁及以上的成人和青少年，推荐剂量为每天两次1250mg(BID)或每天三次750mg(TID)。2-13岁儿童的建议剂量为每天3次25-35mg/kg或每天两次45至55mg/kg。这提示着其在防治非酒精性脂肪性肝炎和抗纤维化方面有很好的药用前景。

(c)本发明活性化合物在临床推荐剂量下(1250mg BID)，最高血药浓度为4.0mg/L(7.04μM)，最低血药浓度为2.2mg/L(3.87μM)(FDA Package Insert，Reference ID:3986049)。在1875mg BID剂量下，最高血药浓度为13.3μM，最低血药浓度为约5.5μM(Haematologica 2016；101(3):346-55)。在大鼠的组织分布实验中，肝中的本发明活性化合物浓度最高，为血药浓度的16倍(Antimicrob Agents Chemother 1996；40(1):110-4)，这预示着其在病人的肝中会有良好的药效。

(d)本发明活性化合物肝毒性非常小，甚至在肝炎病人中也非常安全。

(e)本发明活性化合物在中等程度肝损伤的病人中是安全的。

(f)本发明活性化合物在4250mg BID的临床剂量下未见毒性，安全性很好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：奈非那韦针对对肝星状细胞的表型筛选实验

1.1实验耗材

1.2实验用细胞

1.3溶液配量

1.4实验步骤

a)培养LX2细胞，培养基为DMEM+2％FBS，按照1:2传代；

b)若LX2生长密度为80％～90％时收集细胞，加入胰酶1.5ml，3分钟，加入3ml MEM培养基终止，将细胞收集在15ml离心管中；

c)取20μl细胞液体和20μl台盼蓝按照1:1混匀，进行细胞计数，记录数据；将15ml离心管离心，300g，5分钟；

d)用DMEM将细胞重悬至15000cell/ml，混匀，500μl/well加入已铺好胶的#352424孔板中；

e)细胞贴壁后，换DMEM+0.5％FBS饥饿12h；

f)用DMEM培养基配制10ng/ml的TGF-β，用配置好的TGF-β溶液配制的化合物；

g)将配制的化合物(NC为阴性对照，阳性化合物为OCA，测试化合物为甲磺酸奈非那韦)加入24孔板，500μl/well，混匀，置于37℃培养箱，孵育24小时；

h)用PBS缓冲液洗细胞两遍，每孔加入100μl 1×的loading buffer，细胞收样于1.5mlEP管中；

i)100℃煮样品10分钟，离心后放入-20℃冰箱待用；

j)细胞免疫印迹(western blot)。

1.5结果

如图1和图2所示，结果表明：

(a)TGF-β能明显激活肝星状细胞，活化后的LX2表达α-SMA。

(b)1μM和10μM的甲磺酸奈非那韦(DRN788)均能够不同程度地显著降低α-SMA表达，从而抑制LX2的活化；

(c)与阳性化合物OCA(10μM)相比，10μM甲磺酸奈非那韦在能够更显著降低α-SMA表达。

上述结果表明，1-10μM甲磺酸奈非那韦，在体外有显著的抑制肝星状细胞活化的效果，在10μM能够显著优于阳性化合物奥贝胆酸(OCA)降低α-SMA表达。

讨论

2018年发现奈非那韦可以通过抑制TGFβ1通路，来抑制肺纤维化，此外奈非那韦对心肌纤维化和皮肤的纤维化也有一定效果(Arthritis Rheumatol 2018；70(1):115-26)。肝星形细胞与肺纤维化中的成纤维化细胞存在本质区别。肝星形细胞在代谢、分化能力、储脂、来源等很多方面都有其独特之处，因此从肺、心脏及皮肤纤维化的结果无法推演到肝星形细胞及肝纤维化。

在本发明之前，奈非那韦或其药学上可接受的盐对肝星状细胞活化的抑制作用尚未见报道。

在本发明中，本发明人首次公开了奈非那韦或其药学上可接受的盐对肝星状细胞的活化具有显著的抑制作用，强于阳性药奥贝胆酸。因此，奈非那韦或其药学上可接受的盐具有优异的防治非酒精性脂肪性肝炎和抗肝纤维化的活性，具有良好的临床应用前景。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。