一种活性木质素及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种活性木质素及其制备方法和应用 (Active lignin and preparation method and application thereof ) 是由 黄曹兴 裴雯慧 郑力铭 王许才 勇强 于 2021-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种活性木质素及其制备方法和应用。所述的应用为活性木质素在制备用于促进软骨缺损修复的药物中的应用。本发明以漆酶催化阿拉伯糖、木糖脱氢聚合合成的活性木质素,将其用于软骨缺损模型中进行修复试验,发现所制备的活性木质素可以促进软骨缺损修复。本发明通过生物法合成的活性木质素在促进软骨缺损修复方面效果显著,具有巨大的应用潜力和经济效益。(The invention discloses active lignin, a preparation method and application thereof. The application is the application of active lignin in preparing a medicament for promoting cartilage defect repair. According to the invention, laccase is used for catalyzing active lignin synthesized by arabinose and xylose dehydrogenation polymerization, and the active lignin is used for a repair test in a cartilage defect model, so that the prepared active lignin can promote cartilage defect repair. The active lignin synthesized by the biological method has obvious effect on promoting the repair of cartilage defect, and has huge application potential and economic benefit.)
技术领域
本发明属于生物新材料技术领域，更具体地说，涉及一种活性木质素及其制备方法和应用。
背景技术
关节软骨损伤是临床上最常见的疾病之一，由于软骨的无血管结构和软骨细胞迁移能力差，一旦损伤，很难实现自发修复，并且会导致继发性关节退变，若缺乏合理的治疗，最终会导致关节疼痛，甚至发展为骨性关节炎，给患者带来极大痛苦。水凝胶材料，被证实可明显促进软骨缺损修复。虽然软骨组织工程技术在软骨修复领域得到了广泛的应用，但植入的水凝胶支架与宿主组织之间的整合对于有效的组织再生是至关重要的，特别是对于软骨，这可以促进愈合过程和机械功能的恢复。植入的生物材料与天然软骨结合不良往往会导致组织纤维化，导致机械载荷传递效率低下，新生软骨与天然软骨结合失败，最终导致软骨再生失败。然而，植入的生物材料与天然软骨之间良好而稳定的结合仍然是一个巨大的挑战。对于软骨再生，现有的粘附性水凝胶还远远不够理想，应该更具生物相容性，使用方便，成本效益高，能有效促进软骨再生。
木质素是含量最丰富的天然多酚，是木材水解和制浆工业的副产品。然而，这些木质素副产物通常被当作低档燃料焚烧，甚至干脆作为废物丢弃。随着社会的发展和进步，人们对环境和可持续发展的关注度越来越高。尚未得到充分利用的木质素资源被广泛研究。由于其具有许多其他天然聚合物所不具备的独特特性，如抗氧化、抗炎、良好的抗菌活性等。在生物医学领域，利用天然聚合物开发生物医用材料是一种常用的途径，木质素可以作为生物活性化合物来补充常用的生物材料。然而工业木质素中提取的木质素组分十分复杂，提纯过程比较繁琐，官能团含量低，提取工艺和预处理方法都会影响木质素的物理化学性能，结构不可调控，即使是来自同一种材料与制浆工艺，不同的抽提条件都会影响其性能，因此还不能满足使用需求。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种纯度较高且具有丰富酚羟基官能团含量的活性木质素。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述的活性木质素的制备方法。本发明还要解决一技术问题是提供所述的活性木质素在制备用于促进软骨缺损修复的药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
活性木质素在制备用于促进软骨缺损修复的药物中的应用。
所述的活性木质素促进骨髓间充质干细胞成软骨分化。
所述的活性木质素，是以漆酶催化阿拉伯糖或木糖与异丁香酚反应获得的活性木质素。
一种制备所述的活性木质素的方法，步骤如下：
1)取阿拉伯糖或木糖，与异丁香酚混合均匀，在无菌的条件下加入乙酸/乙酸钠缓冲液、乙醇，充分溶解；
2)加入漆酶混合均匀，控温酶解反应，结束后离心分离，保留固体物质部分得粗产物，冷冻干燥；
3)粗产物用二氯乙烷/乙醇洗涤，收集液体部分旋转蒸发得固体，即为活性木质素。
步骤1)具体为：配制pH为5的乙酸/乙酸钠缓冲液，与乙醇等体积混合；然后取5g阿拉伯糖或5g木糖，与5g异丁香酚混合均匀，无菌条件下加入配置的乙酸/乙酸钠、乙醇缓冲混合液体，充分溶解。
步骤2)具体为：加入酶活1000IU/mL的漆酶1mL混合均匀，然后将体系放置30℃水浴锅中反应24h，再加入1mL漆酶，同时加入无水乙醇；无菌条件下反应5天后洗涤、离心保留沉淀部分粗产物并冷冻干燥。
步骤3)具体为：取冷冻干燥后的粗产物加入体积比为2∶1的二氯乙烷/乙醇混合溶液，反应6h后离心收集液体部分旋转蒸发得到活性木质素固体。其中，以阿拉伯糖与异丁香酚为原料反应获得的是阿拉伯糖来源的活性木质素(DHP-A)，以木糖与异丁香酚为原料反应获得的是木糖来源的活性木质素(DHP-X)。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优势在于：本发明提供的活性木质素纯度高(98％)、结构明确，具有良好的生物相容性和抗氧化性。体外实验表明该活性木质素能够促进间充质干细胞促进成软骨分化。体内实验表明活性木质素能够促进大鼠软骨缺损修复。这表明本发明提供的活性木质素是能有效的促进软骨缺损修复，将在制备用于促进软骨缺损修复的药物中具有广泛的应用。此外，本申请采用酶催化合成法制备活性木质素，得到的木质素不仅纯度较高，且具有丰富的酚羟基官能团含量(大于3.5mmol/g)，是理想抗氧化剂，具有很好的实用性。
附图说明
图1是DHP-A和DHP-X 2D HSQC核磁共振谱图；
图2是DHP处理24h后细胞存活率数据结果图；
图3是不同DHP浓度对DPPH、超氧阴离子自由基清除率影响结果图；
图4是ROS清除流式数据及荧光图；*表示vs IL-1β对照组，****P＜0.0001；
图5是不同处理的成人骨髓干细胞软骨球的大体观察及阿利新蓝、二型胶原免疫组化染色图；Scale Bar：200μm；
图6是软骨缺损模型图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1
活性木质素的合成：配置pH 5的乙酸/乙酸钠缓冲液，将其与乙醇等体积混合。然后分别称取5g阿拉伯糖和5g异丁香酚(试验1)，5g木糖分别与5g异丁香酚(试验2)，各自混合均匀，无菌条件下均加入配置的乙酸/乙酸钠、乙醇缓冲混合液体70mL，充分溶解。分别加入酶活1000IU/mL的漆酶1mL混合均匀，然后将体系放置30℃水浴锅中反应24h，再加入1mL漆酶，同时加入30mL无水乙醇。无菌反应5天后蒸馏水洗涤，离心，保留沉淀部分，即为粗产物，并冷冻干燥。取冷冻干燥后的粗产物加入体积比为2∶1的二氯乙烷/乙醇混合溶液100mL，反应6h后，离心收集液体部分，旋转蒸发得到活性木质素DHP。从试验1和试验2得到的DHP分别命名为DHP-A和DHP-X，得率分别为81.2％和83.5％，纯度分别为98.1％和98.6％。
采用2D-HSQC核磁共振波谱法、31P定量法核磁共振波谱法和凝胶渗透色谱法，分别对活性木质素的结构、官能团含量和分子量进行表征与测定，结果如表1所示。
表1不同DHP官能团含量及分子量
从表1可以看出DHP-A的重均分子量(1890g/mol)及数均分子量(1310g/mol)均小于DHP-X的重均分子量(2560g/mol)及数均分子量(1620g/mol)。DHP-A的多分散性为1.44，低于DHP-X的多分散性(1.58)，两种木质素样品的分子量分布都相对较窄，重均分子量与数均分子量的比值均小于3。
31P定量法核磁共振波谱法可以得到DHP-A的酚羟基含量(3.5mmol/g)低于DHP-X(4.3mmol/g)，其醇羟基的含量与DHP-X非常接近，分别为0.8、0.6mmol/g。其中，DHP-A和DHP-X均具有丰富的酚羟基含量，表明其具有良好的抗氧化功能。
从2D-HSQC NMR谱图(图1)可以看出在侧链区域中均显示出β-O-4芳基醚键结5构(A、A’)、树脂醇β-β结构(B)、苯基香豆满β-5结构(C)。化学位移86.0/4.11ppm为β-O-4醚键结构与木质紫丁香基(S)相连的β位的信号(A)树脂醇β-β结构(B)的α、β位置的相关信号峰分别在84.9/4.69、53.7/3.05ppm位置可以识别。同时，在谱图中可以清晰看到β-5(C)结构的信号，其α的化学位移在86.8/5.49ppm，β的化学位移在53.1/3.49ppm。芳环区域中可以清楚看到愈创木基(G)结构单元信号。其2，5，6位置的相关信号分别在111.0/7.01、114.4/6.73-115.3/6.98ppm和119.0/6.82ppm。同时，发现G型木质素侧链位被氧化成酮基(G’)的现象，其2号位的信号在112.5/7.32ppm。此外，在两种木质素中均发现了肉桂醇端基(I)结构，该结构的α、β位置的相关信号峰分别在128.5/6.47、128.5/6.25ppm。从这些化学位移可以看出，利用不同糖生物合成的木质素均具有天然木质素的基本结构。
实施例2活性木质素的细胞毒性及抗氧化性能测定
(1)细胞毒性测定
活性木质素对人骨髓间充质干细胞的毒性测试是通过将细胞与不同浓度(0.1ug/mL、1ug/mL、10ug/mL、50ug/mL)DHP-X和DHP-A共培养24h来确定，细胞存活率通过cck-8测定。
图2为细胞存活率数据。DHP浓度在低浓度下(0.1-10μg/mL)，在24h对BMSCs细胞基本没有毒性，没有细胞死亡现象。当DHP浓度为1μg/mL时，DHP-X对于细胞增殖无明显促进作用，DHP-A表现出一定的促进成骨细胞增殖作用，这可能是由于DHP-A具有更高的羟基含量，从而表现出一定的生理活性。50μg/mL的DHP-X对细胞的增殖效果更为显著。但是当DHP-A浓度为50μg/mL时，对细胞增殖无显著效果。基于DHP对BMSCs细胞增殖促进作用显著性为基准，最终选择1μg/mL为最佳浓度进行后续的试验。
(2)抗氧化性能测定
体外抗氧化性能通过测定样品对DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除能力的差异来确定。分别取2mL不同质量浓度(1ug/mL、10ug/mL、100ug/mL、500ug/mL、800ug/mL、1000ug/mL)的DHP溶液于10mL离心管中，再往其中加入2mL DPPH溶液(溶于无水乙醇，浓度0.2mmol/L)，混匀后在室温下避光反应30min。结束后于517nm处测吸光值(A1)。分别取2mL不同质量浓度(1ug/mL、10ug/mL、100ug/mL、500ug/mL、800ug/mL、1000ug/mL)的DHP溶液(溶于二甲亚砜)和2mL无水乙醇混合反应记为对照组，而2mL无水乙醇和2mL DPPH溶液(溶于无水乙醇，浓度0.2mmol/L)混合反应记作空白组，吸光值分别记为A2和A0，每个样品重复试验两次。DPPH自由基清除率(Scavenging activity)根据下面的公式计算：
Scavenging activity＝(1-(A1-A2)/A0)×100％
式中：Scavenging activity为DPPH自由基清除率；A1为DHP与DPPH的混合溶液吸光度；A2为DHP与无水乙醇的混合溶液吸光度；A0为无水乙醇与DPPH的混合溶液吸光度。
用索莱宝超氧阴离子自由基清除试剂盒测定不同质量浓度(1ug/mL、10ug/mL、100ug/mL、500ug/mL、800ug/mL、1000ug/mL)的DHP溶液的超氧阴离子自由基清除能力。
从图3可以看出，DHP-A的DPPH自由基清除能力高于DHP-X。当质量浓度为0.5g/L时，DHP-A对DPPH的自由基清除能力达到70％，而DHP-X的清除能力为55％。对于DHP-A，DPPH自由基清除效果伴随着样品浓度的增加而增强。而DHP-A对DPPH自由基清除效果在0.5g/L时获得一个最好的清除效果。当DHP-A浓度高于峰值时，DPPH清除率随着浓度的增加而降低为一终值。超氧阴离子自由基清除率随着DHP浓度的增加而增加，最终近乎达到100％，且两种DHP无差异性存在。
体内抗氧化性能利用流式细胞仪通过对细胞荧光信号的检测了解细胞内活性氧的水平。其荧光强度间接代表细胞内过氧化物的水平。
流式细胞仪检测结果显示，细胞受IL-1β刺激后，产生高浓度的活性氧，而活性氧的产生被DHP所抑制，且DHP-X的抑制效果要比DHP-A好。然后使用氧化敏感染色剂DCFH-DA进行细胞染色。实验结果如图4显示，IL-Iβ刺激的对照组表现出比空白组更加强的荧光，表明对照组细胞内产生更多的活性氧；而提前加入DHP的治疗组荧光强度明显低于对照组及空白组，表明治疗组明显降低了细胞内活性氧的产生。这与流式细胞术结果一致。以上结果表明，DHP在软骨细胞中可以抑制氧化应激，且DHP-X的抑制氧化应激效果要强于DHP-A。
实施例3活性木质素促进软骨分化实验
首先通过商业试剂盒(成人骨髓间充质干细胞成软骨分化诱导培养基，赛业生物，HUXMA-90041)诱导BMSCs成软骨分化，诱导过程中加入1ug/mL DHP-A、DHP-X共培养，持续诱导18天后，取出软骨球变焦体视显微镜下观察并拍照。冰冻切片进行阿利新蓝及二型胶原免疫组化染色。软骨球大体观察及染色图如图5所示。
由图5可得出，成人骨髓干细胞软骨分化诱导成功。对形成的软骨球大体尺寸分析发现，对照组与DHP-A诱导的软骨球尺寸接近，与对照组相比，木质素与DHP-X诱导形成的软骨球尺寸明显较小。DHP-A诱导的软骨球表面较光滑，更接近于球形，这可能是由于DHP-A诱导BMSCs形成软骨球的效果较好。
阿利新蓝(AB)是一种水溶性的多价碱性染料，结构中有铜的存在。当pH＝2.5，与硫酸、羧酸及其盐类的酸性蛋白黏多糖形成盐键，染成蓝色。其着色深浅可以反映软骨细胞外基质的合成情况。在成软骨诱导培养基诱导培养19d后，进行阿利新蓝染色。实验结果显示，BMSCs成软骨诱导分化成功。与对照组比较，木质素组形成的软骨球切片染色区域较小，但内部结构较为致密；DHP-A组软骨球切片染色区域较大且内部呈现更为聚集的形态；DHP-X组软骨球切片染色区域较小，但其内部形成更为致密的形态。结果表明DHP-A处理后的诱导分化细胞外基质糖胺多糖含量增加，并形成更聚集的形态。
软骨基质主要由胶原和蛋白多糖组成。研究发现胶原是主要成分，占50％-80％。胶原纤维以II型胶原为主体，构成关节软骨基质的纤维骨架。为了评价活性木质素对BMSCs软骨形成的影响，在培养19d后进行Col2α1免疫组化染色检测。免疫组织化学染色分析显示，与对照组相比，DHP-A处理后的软骨球切片中软骨标志物基因Col2a1的染色明显增强，与阿利新蓝染色结果一致。
实施例4：活性木质素体内促进软骨缺损修复实验
本实施例所有操作严格遵守美国公共卫生署关于关爱和使用实验动物的相关指南，所有实验动物的饲养、手术操作、安乐死等均严格按照南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物伦理委员会指南进行。
将动物分成五组：正常组、缺损组、纯HA组、0.1％DHP组及1％DHP组。
本实验共选用30大鼠(雄性，12周龄)。分为五种种处理方式，包括正常组(Sham)、损伤无处理组(Control)；透明质酸基0.1％DHP添加量水凝胶处理组(m-HA+0.1％DHP)；透明质酸基1％DHP添加量水凝胶处理组(m-HA+1％DHP)；单纯透明质酸水凝胶处理组(m-HA)。对于m-HA+0.1％DHP及m-HA+1％DHP处理组，将对应水凝胶，使用注射器注入软骨缺损处。对于m-HA处理组，将透明质酸水凝胶注入缺损处。大鼠麻醉方式：气麻(异氟烷)，麻醉后，大鼠仰卧位。常规消毒后，采取内侧骸旁入路，向外侧脱位骸骨，暴露股骨内侧课，使用相应尺寸的骨软骨移植器制作全层缺损，直径为2mm、深度3mm的全层软骨缺损的骨软骨缺损。用生理盐水冲洗清除组织碎屑和血块，复位髌骨，逐层闭合肌肉层、筋膜层和皮肤切口。皮肤切口再次碘伏消毒；术后肌肉注射青霉素预防感染，大鼠术后自由活动。
术后3周对实验大鼠实施安乐死。获取膝关节标本，进行大体拍照。图6是软骨缺损模型；用不同DHP添加量的HA水凝胶填充3周后各组标本大致观察。
由图6可分析得出，与HA组标本相比，术后3周HA组可见股骨髁部分软骨磨损痕迹，软骨缺损明显，缺损部位呈暗红色，部分缺损有少许白色瘢痕样纤维组织长入。0.1％DHP组可见关节面平滑，未见明显软骨缺损，在肉眼观察下修复组织与正常软骨组织肉眼已难以区分，并发现该实验组所修复的组织表面光滑；与0.1％DHP组比较，1％DHP组缺损区充满大量的新生软骨细胞，与周围正常软骨相似，边界不清晰。而0.01％DHP组可见关节面不连续，刮除部位有明显软骨缺口。
大体观察显示，与未处理组相比，处理组的软骨缺损几乎完全填充，在植入后3周，缺损处有明显的组织凹陷。高浓度DHP添加组显示出更光滑、更完整的形态，在某些部位没有明显的边界。
实验结果表明，大体观察下HA组修复软骨缺损效果较差；0.01％DHP组修复效果一般，0.1％DHP组与1％DHP组修复效果较好。
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